建立过表达DR3的细胞系以评估对有丝分裂抑制治疗的凋亡反应

摘要

建立稳定过表达目的基因的细胞系以研究基因功能，可通过稳定转染法实现，即在转染后筛选单克隆细胞。 通过 逆转录病毒感染。在此，我们展示了通过该方法生成的HT29-DR3细胞系揭示了死亡受体3（DR3）在有丝分裂抑制剂诱导的细胞凋亡中的作用机制。

摘要

通过调控目的基因的表达水平，可以研究其功能，例如利用基因敲低细胞系降低其表达，或利用过表达细胞系提高其表达。瞬时转染和稳定转染是外源基因表达常用的两种方法。瞬时转染仅适用于短期表达，而稳定转染可使外源基因整合到宿主细胞基因组中，实现持续表达。因此，稳定转染通常用于长期遗传调控的研究。本文介绍一种简单的实验方案，用于构建稳定过表达带标签的死亡受体3（DR3）的细胞系，以探究DR3的功能。我们在逆转录病毒感染后挑选单克隆，以确保稳定细胞系的均一性和纯度。利用该方案构建的稳定细胞系可使DR3缺陷的HT29细胞对抗有丝分裂药物产生敏感性，从而在HT29细胞中重建凋亡反应。此外，DR3上的FLAG标签弥补了优质DR3抗体难以获得的不足，并有助于通过生物化学方法研究抗有丝分裂药物诱导凋亡的分子机制。

引言

异源基因表达常用于研究目的基因的功能。在细胞与分子生物学中，瞬时转染和稳定转染是两种常用方法，用于将一段DNA或RNA导入宿主细胞。^1,2瞬时转染的DNA或RNA无法传递给子代细胞，因此遗传改变只能维持较短时间。相比之下，在稳定转染的细胞中，外源基因被整合到宿主细胞基因组中，从而在细胞系中持续表达。因此，稳定转染通常用于长期基因调控的研究。稳定细胞系还可作为异种移植移植物植入小鼠模型中 体内 研究³稳定转染可分为病毒性和非病毒性两类。与非病毒性转染相比，病毒感染能以更高的效率将基因导入更多种类的人类细胞中。^4,5,6,7此外，来自单克隆的稳定细胞系具有均一性和克隆纯度的优势。

不受控制的细胞生长和分裂是癌症最显著的特征。在临床治疗中，抗有丝分裂药物是多种肿瘤的主要治疗手段⁸。然而，抗有丝分裂药物的一些重要局限性不容忽视。首先，这类化疗药物在杀伤异常癌细胞的同时也可能杀死正常细胞，从而导致严重的副作用⁸。其次，尽管微管蛋白作为细胞骨架蛋白在多种组织中广泛表达，但抗微管药物并非对所有类型的肿瘤都有效^9,10。目前尚不清楚为何抗微管药物在临床治疗中对卵巢癌、肺癌和血液系统肿瘤表现出良好的疗效，却对肾癌、结肠癌或胰腺癌无效¹¹。 最后，即使是患有同种类型肿瘤的患者，对抗有丝分裂药物的反应也可能存在不可预测的个体差异 。可能存在某种关键效应分子，影响不同患者对抗有丝分裂药物的敏感性，从而导致临床治疗中观察到的多样化结果¹²。因此，在优化治疗干预策略时，应充分考虑患者对抗有丝分裂治疗潜在的个体化敏感性差异¹³。

一项高通量全基因组siRNA文库筛选表明，DR3基因敲低可使敏感细胞对有丝分裂抑制药物产生抗性，提示DR3在化疗诱导的细胞凋亡中发挥作用¹⁴。作为肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员，DR3已被报道在多种系统中介导细胞凋亡^15,16,17,18。因此，我们着手建立稳定过表达DR3的细胞系，以研究有丝分裂抑制药物诱导凋亡的分子机制。人结肠癌细胞系HT29可作为研究DR3过表达的合适细胞模型，因其被发现缺乏DR3表达。此外，在临床中，结肠癌对有丝分裂抑制药物不敏感¹⁹。

本文介绍了一种通过逆转录病毒感染生成 HT29-DR3 稳定细胞系的方法。我们进一步展示了如何利用蛋白质印迹法验证这些细胞中 DR3 的表达，并通过细胞活力检测和形态学观察来评估其对有丝分裂抑制剂的敏感性。这些细胞由单克隆扩增而来，因此具有同质性良好的遗传背景。此外，DR3 上的 FLAG 标签使得可通过显微镜观察细胞内 DR3 的定位，并可通过生化方法分析基因表达和蛋白质相互作用。同时，这些细胞还可移植至小鼠体内，以进一步在活体（in vivo）条件下分析肿瘤进展对有丝分裂抑制剂的响应¹⁴。

本文介绍的HT29-DR3细胞系统为研究抗有丝分裂药物如何杀死癌细胞的分子机制提供了一种有效工具¹⁴。由于过表达和基因敲低细胞系是研究基因功能的常用工具，本实验方案可轻松适用于其他目的基因或其他细胞系，因而有望成为一种广泛应用的研究方法。

方案

请注意，本文所述所有小鼠实验均经清华大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并遵循其规定进行。

1. DR3 过表达细胞系的构建

1. 通过将带有C端3x FLAG标签的全长DR3 cDNA插入到逆转录病毒载体pMXs-IRES-Blasticidin的BamHI/XhoI限制性酶切位点，构建用于DR3表达的质粒（pMXs-IRES-DR3-FLAG）。
2. 在60 mm培养皿中用4 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养Plat-A细胞。次日，当细胞融合度达到80% - 90%时，按照制造商说明书使用转染试剂（见材料表）将2 μg质粒pMXs-IRES-DR3-FLAG转染入细胞²⁰。
3. 72小时后，收集上清液，用0.45 μm无菌滤器过滤培养基，并将病毒悬液避光保存于4 °C。
4. 在60 mm培养皿中用DMEM培养HT29细胞，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育细胞。
5. 次日，当细胞融合度达到30% - 50%时，在每毫升病毒悬液中加入8 μg的1,5-二甲基-1,5-二氮杂十一烷聚合溴化物，用2 mL病毒悬液感染细胞。在37 °C孵育4 - 6小时后，吸除病毒悬液，加入4 mL新鲜DMEM，并将培养皿放回培养箱。
6. 感染后24小时，弃去培养皿中的培养基，用2 mL预热的PBS小心洗涤细胞。向细胞中加入1 mL胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育3分钟。
7. 在10倍显微镜下观察，当大多数细胞已脱落时，加入含10%胎牛血清（FBS）的完全DMEM培养基2 mL终止消化反应。将细胞悬液收集至15 mL离心管中，在室温（RT）下以200 × g离心5分钟。
8. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL DMEM中，轻轻吹打混匀。将细胞按30倍、100倍和300倍稀释，接种至150 mm培养皿中，每皿加入含1 µg/mL杀稻瘟菌素的20 mL DMEM。在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育约1 - 2周。
9. 在此期间，每天使用倒置显微镜在10倍放大下观察克隆形成情况。当克隆直径约为1 - 2 mm时，在培养皿底部标记孤立良好的克隆。
10. 吸除培养基，并用3 mL预热的PBS洗涤细胞。在60 mm培养皿中加入2 mL胰蛋白酶-EDTA。使用无菌镊子夹取经高压灭菌的无菌克隆环，将其放入60 mm培养皿中。将含有胰蛋白酶-EDTA的克隆环轻轻放置在已标记的克隆上方。确保每个克隆环内仅包含一个克隆，并避免与邻近克隆发生污染。
11. 将培养皿放回培养箱孵育3分钟。
12. 3分钟后，在10倍显微镜下检查细胞是否已脱落。当细胞脱落后，向每个克隆环中加入70 μL培养基以灭活胰蛋白酶。使用200 μL移液器轻轻吹打混匀细胞悬液。此过程中注意不要移动克隆环。
13. 将每个克隆的细胞悬液转移至两个24孔板中，每孔含1 mL DMEM。在A板中每孔加入30 μL细胞悬液，在B板对应孔中加入70 μL。正确标记培养板后放回培养箱继续培养。

2. DR3 过表达细胞系的验证

1. 当B板中的细胞达到90%融合度时，移除培养基，并用1 mL PBS小心洗涤细胞。彻底去除PBS后，加入50 μL 1x SDS-PAGE上样缓冲液裂解细胞。将细胞裂解液从24孔板转移至1.5 mL离心管中，在100 °C下煮沸10分钟。
2. 在恒定电压80 V下电泳15分钟，随后在120 V下电泳1小时，使用10%十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶分离样品。
3. 通过湿转法在恒定电流400 mA下电转2小时，将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
4. 使用抗FLAG抗体检测不同克隆中的DR3表达，以野生型HT29细胞作为阴性对照（图1）。将一抗用含0.1% Tween-20的TBST（Tris缓冲盐水）中溶解的5%脱脂奶粉按1:5,000稀释，在4 °C下与膜孵育过夜。
5. 在室温下，将膜置于脱色摇床上以200 rpm的速度用TBST洗涤，每5分钟更换一次TBST，总洗涤时间为15分钟。
6. 将膜与按1:10,000稀释于5%脱脂奶粉中的抗小鼠二抗在4 °C孵育5–6小时。
7. 再次按照步骤2.5所述方法洗涤膜。
8. 使用Western增强化学发光（ECL）底物检测FLAG表达，并用凝胶成像系统成像（参见材料表）。将表达DR3的克隆确定为阳性克隆。
9. 将A板中对应于B板阳性克隆的细胞转移至6孔板，继续扩增细胞直至在10 cm培养皿中培养。对来自阳性克隆的细胞制备冻存样本，并储存于-80 °C以备后续使用。

3. 细胞对有丝分裂抑制剂凋亡反应的评估

注意：Diazonamide 是一类新型海洋天然产物，具有显著抑制癌细胞生长的活性，其作用与其它微管去稳定剂相似²¹。然而，其作用机制仍不明确。为检测细胞对有丝分裂抑制剂的反应，使用紫杉醇（paclitaxel）和 diazonamide 处理野生型 HT29 细胞及 HT29-DR3 细胞。将药物溶于二甲基亚砜（DMSO）配制成 10 mM 的储备液，再用 DMSO 进一步稀释为不同浓度：30 nM、100 nM、300 nM、1,000 nM、3,000 nM 和 10,000 nM。

1. 通过胰酶消化收集HT29和HT29-DR3细胞。使用自动细胞计数仪测定细胞密度。随后，将细胞以3 × 10⁵个/毫升的密度接种于12孔板中，培养基为DMEM。⁴ 每孔细胞。次日，加入10 nM重氮酰胺，以1% DMSO作为阴性对照。处理48小时后，在10倍放大倍数下于显微镜下观察细胞图2).
2. 将HT29和HT29-DR3细胞以3 x 10⁵个/毫升的密度接种于96孔板中，培养基为DMEM³ 每孔接种适量细胞，于37 °C培养过夜。随后向各孔加入浓度递增的重氮酰胺，分别为0.3 nM、1 nM、3 nM、10 nM、30 nM和100 nM，以含1% DMSO的溶液作为阴性对照。
3. 处理48小时后，根据制造商说明书，使用基于荧光素酶的细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。
   1. 从培养箱中取出96孔板，在室温下静置约30分钟。然后向每孔加入50 µL检测试剂，在室温下振荡孵育2分钟以裂解细胞，再于室温下继续孵育10分钟。使用微孔板读板仪测定各孔的发光值图3).
      注意：细胞活力表示各孔相对于用1% DMSO处理的对照孔的相对发光强度。
4. 使用6周龄雌性BALB/c裸鼠进行实验 体内 研究¹⁴.
   注意：小鼠在特定无病原体条件下饲养。
   1. 用预热至37 °C的DMEM终止HT29和HT29-DR3细胞的胰蛋白酶消化，收集细胞悬液至50 mL离心管中，在室温下以1,000 rpm离心10 min。弃去上清液，用不含FBS的DMEM重悬细胞沉淀。再次离心细胞，并用PBS重悬细胞沉淀。
   2. 使用自动细胞计数仪对细胞进行计数，并将细胞稀释至浓度为 2.5 x 10⁷ cells/mL，用PBS制备。通过在每只小鼠右侧 flank 皮下注射200 μL HT29或HT29-DR3细胞悬液（5 x 10⁶ 细胞/小鼠²².
   3. 使用游标卡尺在移植后每2天测量一次肿瘤体积（TV）。采用以下公式计算肿瘤体积：TV = 1/2L × W × W（其中，W：肿瘤宽度，L：肿瘤长度）。当平均肿瘤体积达到约100 mm³时³，将小鼠随机分配至对照组或处理组（n 每组6只，并开始治疗。
   4. 按如下步骤配制紫杉醇溶液：首先，将紫杉醇完全溶解于相当于总体积5%的乙醇中，然后加入相当于终体积5%的聚氧乙烯35蓖麻油。最后，用D5W（5%葡萄糖水溶液，pH 7.4）补足剩余90%的体积。
   5. 以20 mg/kg的剂量每周3次静脉注射紫杉醇，持续两周。每周测量3次肿瘤体积和体重¹⁴若动物体重下降达20%或肿瘤体积达到约2,000 mm³，应终止实验并对动物实施安乐死。³.

结果

稳定表达DR3的HT29细胞的表征如图1所示。这些克隆表达不同水平的DR3，而作为阴性对照的野生型细胞则不显示外源基因的表达。此处仅展示五个克隆，其中克隆1和克隆5表达DR3的水平最高。我们选择克隆1和克隆5用于后续实验。

通过倒置显微镜在10倍放大倍数下观察了给予重氮酰胺后HT29和HT29-DR3细胞的形态，结果如图2所示。经10 nM重氮酰胺处理48小时后，HT29-DR3细胞表现出明显的凋亡特征，包括细胞膜破裂和细胞碎片（下图）；而HT29细胞仅表现出有丝分裂阻滞，细胞完整，呈圆形（上图）。

HT29 和 HT29-DR3 细胞经重氮酰胺处理后的细胞活力如图3

讨论

在本文中，我们描述了一种生成 HT29-DR3 稳定细胞系的方法。HT29-DR3 细胞为研究 DR3 在抗有丝分裂药物诱导凋亡过程中所参与的分子机制提供了一个模型。该方法具有良好的通用性和可重复性。为确保实验成功，需重点关注方案中的四个关键步骤：首先，为获得足够高的病毒滴度，建议在 Plat-A 细胞融合度达到 80%–90% 时进行 DNA 转染。其次，病毒悬液应避光保存于 4 °C，且保存时间不应超过 2 周。第三，在将感染后的细胞分种至 150 mm 培养皿时，建议进行梯度稀释，以获得分离良好的单克隆集落，因为不同细胞的感染效率存在差异。最后，在挑取单个克隆时，应避免周围其他克隆的污染。

该方案适用于大多数细胞系，但对于不易形成单细胞克隆的细胞可能效果较差。在此类情况下，需要采用其他细胞分选技术，例如联合使用抗生素与荧光激活细胞分选（FACS）。

稳定转染包括病毒和非病毒方法。在本方案中，我们采用逆转录病毒感染的方法来获得过表达DR3的细胞，理由是物理方法（如电穿孔）对细胞的毒性较大^...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Invitrogen	C11965500BT	添加10% FBS和1%青霉素/链霉素
发光法细胞活力检测	Promega	G7571
紫杉醇	Selleck	S1150
pMXs-IRES-Blasicidin	Cell Biolabs	RTV-016
二甲基亚砜	Sigma	D2650
PBS	Invitrogen	C14190500BT
胰蛋白酶-EDTA (0.25%)	Invitrogen	25200056
1,5-二甲基-1,5-二氮杂十一烷多甲基溴化物	Santa Cruz	sc-134220
转染试剂	Promega	E2311
抗小鼠二抗	Jackson ImmumoResearch	115-035-166
抗Flag抗体	Sigma	F-3165
HT29细胞系	ATCC	HTB-38
plat-A细胞系	Cell Biolabs	RV-102
PVDF Immobilon-P	Millipore	IPVH00010
克隆环	Sigma	C1059
细胞成像多功能读板仪	Biotek	BTCYT3MV
CKX53倒置显微镜	Olympus	CKX53
12孔细胞培养板	Nest	712001
60 mm细胞培养皿	Nest	705001
15 mL离心管	Nest	601052
0.22 μm无菌滤膜	Millipore	SLGP033RB
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	5810000327
96孔白色聚苯乙烯微孔板	Corning	3903
Western ECL底物	BIO-RAD	1705060
ImageQuant LAS 4000	GE Healthcare	ImageQuant LAS 4000
脱色摇床	HINOTECH	TS-2000A
杀稻瘟菌素	InvivoGen	ant-bl-1
自动细胞计数仪	BIO-RAD	TC 20
Opti-MEM I减血清培养基	Thermo Fisher	31985070