本文描述了一种基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）CRISPR-Cas9 的方法，可用于并行地对多个候选基因在急性髓系白血病（AML）细胞增殖中的作用进行简单且快速的研究。该技术具有可扩展性，也可应用于其他癌细胞系。
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本文内容
摘要
摘要
基因扰动研究已被广泛用于探究单个基因在急性髓系白血病（AML）发病机制中的作用。为了实现完全的基因敲除，许多研究采用了复杂的基因敲除模型。尽管这些使用基因敲除小鼠的研究为探究基因型与表型之间的关系提供了优雅且经过长期验证的系统，但开发一种快速且可扩展的方法，用于在AML模型中评估影响AML细胞增殖或存活的候选基因，将有助于加速对多个候选基因的并行分析。近年来基因组编辑技术的进步极大地提升了我们以前所未有的规模进行遗传扰动的能力。其中一种基因组编辑系统是基于CRISPR-Cas9的方法，可用于对靶细胞基因组进行快速而高效的修饰。CRISPR/Cas9介导的基因删除因其操作简便和易于扩展，成为在表型检测中分析大量基因最具吸引力的技术之一。本文介绍一种简单的方法，结合CRISPR/Cas9介导的基因破坏与基于高通量流式细胞术的竞争性检测，用于研究可能在人和小鼠AML细胞系增殖或存活中发挥重要作用的基因。
引言
过去几十年来，大量研究致力于揭示关键分子通路在急性髓系白血病（AML）发病机制中的作用。传统上，AML细胞中的基因失活主要通过条件性基因敲除小鼠或短发夹RNA（shRNA）来实现。尽管基因敲除小鼠能够提供时空可控的基因删除系统，但构建这类小鼠模型费时、费力且成本高昂。此外，基于重组策略的基因敲除难以扩展规模，不适合并行研究多个基因的功能。自从发现利用小干扰RNA（siRNA）或shRNA进行RNA干扰以敲低内源性mRNA的方法后，许多研究团队开始采用RNA干扰技术来探究特定基因在AML中的功能。由于小鼠和人类AML细胞均难以通过传统的脂质体转染方法进行有效转染，大多数研究采用慢病毒或逆转录病毒编码的shRNA来研究AML细胞中基因的功能。近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关的Cas核酸酶（CRISPR-Cas9）系统的发现彻底改变了基因靶向技术1,2,3。利用CRISPR-Cas9，可以高效且简便地对特定基因或基因组区域进行删除、编辑或标记。由于该技术具有操作简便、效率高和适用范围广等优势，基于CRISPR-Cas9的基因编辑正逐渐成为研究多种细胞类型中基因型与表型关系的首选方法。在AML研究中，CRISPR-Cas9技术也日益成为主流方法，不仅用于分析单个基因的功能，还被广泛应用于阵列式或混合式遗传筛选中，以并行方式系统性地鉴定多个可能作为AML依赖基因的候选靶点4,5,6。
在本文中，我们描述了一种简单的竞争性生长检测方法，用于评估基因失活对急性髓系白血病（AML）细胞生长的影响。该方法基于稳定的CRISPR-Cas9介导的基因编辑，随后进行高通量流式细胞术分析。该方法操作简便、效率高，可扩展用于中等通量实验，以平行研究多个基因在AML细胞中的功能。
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方案
1. 构建高表达稳定且有活性Cas9的AML细胞系克隆
- Cas9 慢病毒的制备
- 第 0 天：在生物安全二级（BSL2）认证的细胞培养操作台中，将 4 × 106 个 293T 细胞接种于含 10% 胎牛血清（FBS）、青霉素和 L-谷氨酰胺的 10 mL DMEM 培养基中，置于 10 cm 组织培养皿内。将培养皿放入 37 °C 培养箱中孵育。
- 第 1 天：接种的 293T 细胞在第 1 天应达到 70–80% 汇合度。于下午按照以下方案进行转染。
- 将转染培养基、细胞培养基和转染试剂恢复至室温。解冻转染所需的所有质粒。
- 在 5 mL 离心管中，将 9 µg psPAX2、0.9 µg pMD2.G 和 9 µg pLenti-Cas9 质粒与 500 µL 转染培养基混合。
- 向 14 mL 圆底离心管中加入 1.7 mL 转染培养基。将 57 µL 转染试剂直接加入管内的转染培养基中，避免接触管壁。
- 轻柔地将全部质粒混合物加入转染试剂溶液中，并通过轻弹管壁混匀。室温孵育 20–30 分钟。在此期间，更换已接种 293T 细胞的培养皿中的培养基。
- 将转染混合物逐滴加入培养皿中，并轻轻左右摇动培养皿以充分混匀。将培养皿放回 37 °C 培养箱中孵育。
- 第 2 天：轻柔地吸除转染培养皿中的上清液，避免扰动或脱落细胞。弃去上清液。沿培养皿侧壁缓慢加入 10 mL 新鲜的含 10% FBS 的 DMEM 培养基，以避免细胞脱落。
- 第 3 天：使用 10 cm 无菌注射器缓慢吸取转染培养皿中含有病毒的上清液。将上清液吸入注射器后，连接一个无菌的 0.45 µm 滤器，将注射器和滤器置于新的无菌 15 mL 聚丙烯离心管上方。轻推注射器活塞，使含病毒的上清液经 0.45 µm 滤器过滤后进入 15 mL 聚丙烯离心管中。
- 将病毒条件培养基分装为每管 2 mL，置于 2 mL 冻存管中，于 -80 °C 保存。
- AML 细胞系的转导
- 第 -1 天：用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）将 1 mg/mL 重组人纤连蛋白片段原液稀释至 10 µg/mL。在经 BSL2 认证的细胞培养操作台中，用 2 mL 10 µg/mL 重组人纤连蛋白片段工作液包被未经组织培养处理的 6 孔板。用保鲜膜包裹培养板以防止蒸发，并于室温过夜孵育。
- 第 0 天：解冻含 Cas9 的病毒上清液。在离心转导（spinfection）前，彻底吸除包被板中的重组人纤连蛋白片段溶液。向每孔加入 2 mL 含 Cas9 的病毒条件培养基，并在 35 °C 下以 1,300 × g 离心 90 分钟。此步骤有助于病毒颗粒附着于孔底。
- 同时，计数待转导的细胞，并在 15 mL 聚丙烯离心管中以 2 × 106 个细胞进行离心。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 2 mL 新鲜培养基中。
- 离心转导后，完全吸除转导孔中的病毒上清液并弃去。上清液中的逆转录病毒颗粒已附着于孔底。向该孔中加入上述步骤中重悬于 2 mL 培养基的 2 × 106 个细胞。
- 再次短暂离心培养板（1–2 分钟），速度为 1,300 × g，以使细胞充分沉降至孔底。将培养板放回培养箱中过夜孵育，使细胞与已附着的病毒颗粒完成转导。
- 第 1 天：根据细胞密度，向转导后的细胞中补充适量培养基，以防止过度生长。
- 第 2 天：由于 pLenti-Cas9 质粒含有杀稻瘟菌素（Blasticidin）抗性标记，向转导和未转导（对照）的 MOLM13 或小鼠 MLL-AF9 白血病细胞中加入 10 µg/mL 的杀稻瘟菌素，以筛选表达 Cas9 的细胞。
注意：当所有未转导的对照细胞均被清除时，可认为 Cas9 转导的 MOLM13 或 MLL-AF9 白血病细胞的杀稻瘟菌素筛选已完成。对于 MOLM13 和 MLL-AF9 白血病细胞以外的其他细胞系，应在本实验前进行剂量-反应曲线测定，以确定最佳筛选浓度。若转导效率较低，也可对病毒上清液进行滴定。
- 高 Cas9 表达细胞克隆的筛选
注意：我们发现，在某些 AML 细胞系中，可能无需进行克隆筛选：经 Cas9-杀稻瘟菌素富集的群体细胞已具备较高的基因组编辑效率。在此情况下，可跳过步骤 1.3，直接进入步骤 1.4，通过 Western 印迹法检测群体 Cas9-杀稻瘟菌素 AML 细胞中的 Cas9 表达水平。在进行竞争实验前，仍需评估这些群体 Cas9-AML 细胞的基因编辑效率（步骤 1.5）。我们推测，筛选单个高 Cas9 表达克隆可降低基因组编辑的变异性，这在测试多种不同的单导向 RNA（sgRNA）时尤为重要。- 使用位于 BSL2 认证操作台内的 FACS 分选仪，对经 Cas9-杀稻瘟菌素筛选的 MOLM13 和 MLL-AF9 白血病细胞（以下简称 MOLM13-Cas9 和 MLL-AF9-Cas9 细胞）进行单细胞分选。分选可进行至 5–10 块未经组织培养处理的圆底 96 孔板中。
- 在挑选并单独命名单个 MOLM13-Cas9 和 MLL-AF9-Cas9 克隆后，使用含 10 µg/mL 杀稻瘟菌素的培养基扩增 10–20 个克隆，以维持 Cas9 的持续表达。
- 通过免疫印迹法检测稳定表达的 Cas9 蛋白
- 使用核提取试剂盒，按照制造商提供的操作说明，制备所有经杀稻瘟菌素筛选的 MOLM13 和 MLL-AF9 白血病细胞克隆的核提取物。使用抗 Flag M2 抗体检测 Cas9 蛋白的表达，因为 pLenti-Cas9 质粒中的 Cas9 蛋白连接有 N 端 Flag 表位。
- 将每个核提取物中的 50 µg 总蛋白上样至 10% Bis-Tris 凝胶中，在 120 V 条件下电泳，直至上部条带充分分离。
- 用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 缓冲液封闭膜 1 小时。
- 将膜与 1:1,000 稀释的抗 Flag M2 抗体（终浓度为 1 µg/mL）在 4 °C 下孵育过夜。
- 次日，用 TBST 缓冲液洗涤膜，然后在室温下与 1:5,000 稀释的 HRP 标记的抗小鼠二抗（终浓度为 0.16 µg/mL）孵育 1 小时。
- 用 TBST 缓冲液充分洗涤膜，使用 ECL 底物显影。
- 根据 Western 印迹结果，选择 Cas9 蛋白表达水平最高的 3–4 个克隆用于后续功能分析（图 1）。
- 确保所选克隆中 Cas9 的高活性
- 按照步骤 1.1 所述方法，从编码靶向人或小鼠 AAVS1 安全位点的 sgRNA 载体中制备慢病毒上清液。
- 使用上述离心转导法，将 Cas9 表达水平最高的 MOLM13 或 MLL-AF9 白血病克隆与抗 AAVS1 sgRNA 的慢病毒上清液进行转导。使用 2.5 µg/mL 嘌呤霉素筛选 4 天。
- 在嘌呤霉素筛选后，使用基因组 DNA 提取试剂盒，按照制造商说明，从 MOLM13-Cas9 或 MLL-AF9-Cas9 白血病克隆及其相应的野生型对照中提取基因组 DNA。以 50 ng DNA 为模板，使用 AAVS1_test_primers 引物，配合 Taq DNA 聚合酶 2× 预混液，按照 表 1 所列 PCR 程序进行 PCR 扩增。
- 将 PCR 产物在 2% 琼脂糖凝胶上电泳，使用凝胶回收试剂盒按照制造商说明回收 268 个碱基对的条带。使用 AAVS1_target-frag_F 引物对回收的 PCR 产物进行 Sanger 测序。
- 通过在线基于网络的工具比对 AAVS1 编辑序列与野生型序列，评估编辑效率（图 2）。
2. 在 AML-Cas9 细胞中进行 sgRNA 的克隆与转导
- 中高通量sgRNA克隆
- 使用基于网络的CRISPR设计软件为感兴趣基因设计4–6条sgRNA。目前有多种在线CRISPR设计工具，例如http://crispr.mit.edu/，可根据输入的DNA序列生成sgRNA序列。
- 在带星号的字段中填写适当信息。点击目标基因组以进行sgRNA设计。将目标序列粘贴至Sequence框中，然后点击Submit按钮。
- 若要在pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W sgRNA表达质粒中进行克隆，在订购前需在正义链寡核苷酸前添加核苷酸“CACC”，在反向互补的反义链寡核苷酸前添加“AAAC”。向寡核苷酸合成公司订购预混的正义链和反义链寡核苷酸，并将其置于标记为Oligo-Mix的96孔板中。
注意：我们使用了pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W质粒，该质粒含有用于sgRNA克隆的BbsI限制性酶切位点。如果使用其他sgRNA表达质粒，则需相应调整sgRNA寡核苷酸所用的突出末端。 - 取一个单独的U型底96孔板，标记为Annealing Plate。每轮退火反应配制1 µL T4 PNK、1 µL 10x T4 DNA连接缓冲液和6 µL水的主混合液。
- 将8 µL主混合液加入退火板的每一孔中。向主混合液中加入各1 µL的100 µM正义链和反义链寡核苷酸（或2 µL混合的正义-反义寡核苷酸）。轻轻吹打2–3次以充分混匀，短暂离心使液体沉至孔底。
- 在PCR仪上使用以下退火程序：37 °C孵育30分钟，95 °C孵育2分30秒，随后以0.1 °C/s的速率缓慢冷却至22 °C。退火完成后，取一个新的96孔板标记为Diluted OligoMix。使用多通道移液器将上述反应中磷酸化并已退火的寡核苷酸用水稀释200倍（1:200）。
- 在37 °C条件下，用1.5 µL BbsI限制性内切酶（10,000单位/mL）及适当的缓冲液对5 µg pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W载体消化2小时，使其线性化以便后续连接。
- 取一个新的96孔板标记为Ligation Plate，在每个目标sgRNA连接反应对应的孔中加入20 ng经BbsI消化的pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W载体。向其中加入2 µL来自Diluted OligoMix板的磷酸化并已退火的寡核苷酸。
- 加入1 µL 10x T4连接酶缓冲液和1 µL T4 DNA连接酶。用多通道移液器轻轻吹打混匀，室温孵育连接反应混合物2小时。
注意：连接反应混合物可在-20 °C保存，用于后续转化步骤。 - 在连接反应即将结束前约10分钟，将90 µL化学感受态E. coli细胞置于冰上解冻。
- 使用多通道移液器将感受态细胞以每孔10 µL分装至另一个96孔板的各孔中。
- 将步骤2.1.8中的连接混合物加入含感受态细胞的孔中，轻轻吹打混匀，室温孵育10分钟。
- 用移液器直接从上述反应中取5 µL细菌-DNA混合物，点种到含有LB琼脂及100 µg/mL氨苄青霉素的6孔板中。对每个转化反应重复此操作。
- 将每个转化反应分别接种至6孔板中独立标记的孔内。向每孔加入约5–8颗玻璃珠，将整个6孔板以圆周运动方式摇晃8–10次。
- 用无菌20 µL移液枪头从每孔挑取1–2个单菌落，在标记清晰的含LB琼脂及100 μg/mL氨苄青霉素的10 cm培养皿上划线。划线后，直接将用于菌落划线的枪头弹入对应编号的14 mL圆底管中，该管内已含有3 mL LB-氨苄青霉素培养基。
- 将细菌培养板直接送测Sanger测序，使用人U6启动子正向引物。
- 在确认克隆的sgRNA序列正确后，按照制造商说明书，使用质粒小提试剂盒从对应的14 mL管中提取质粒DNA。
- 使用分光光度计测定各小提质粒的浓度和质量。将每个小提质粒归一化至15 ng/µL的浓度，并用移液器转移至标记为sgRNA Clones Plate的96孔板中。
注意：该板可于-20 °C保存，或直接用于病毒制备。
- 使用基于网络的CRISPR设计软件为感兴趣基因设计4–6条sgRNA。目前有多种在线CRISPR设计工具，例如http://crispr.mit.edu/，可根据输入的DNA序列生成sgRNA序列。
- sgRNA构建体的病毒生产与转导
- 以96孔板形式生产sgRNA慢病毒颗粒时，请遵循Broad研究所遗传扰动平台（GPP网络门户）提供的“shRNA/sgRNA/ORF高通量病毒生产（96孔）”方案（网址：https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols）。
- 将200 µL病毒上清液转移至无菌管中，并立即在-80 °C冷冻保存。
- 第-1天：在BSL2级细胞培养生物安全柜中，向平底非组织培养处理的96孔板每孔加入100 µL浓度为10 µg/mL的重组人纤维连接蛋白片段。用保鲜膜包裹该板以防止蒸发，室温放置过夜。
- 第0天：从各孔中移除重组人纤维连接蛋白片段。将各sgRNA的病毒上清液室温解冻。将每管中的50 µL病毒上清液加入转导板的各包被孔中。在35 °C、1,300 x g条件下离心90分钟。
- 在离心感染（spinfection）即将结束时，从培养瓶中计数MOLM13-Cas9（克隆B3）细胞。每孔接种10,000个细胞，总体积为100 µL。计算所有转导孔所需的细胞数，并考虑移液过程中的死体积。
- 90分钟离心感染结束后，使用多通道移液器缓慢倾斜板子，以50 µL的设定量从各孔中吸除上清液。沿孔壁缓慢加入100 µL MOLM13-Cas9克隆B3细胞的培养液。
- 在35 °C、1,300 x g条件下离心2分钟，使细胞沉降至孔底。随后将板转移至37 °C组织培养级培养箱中。
- 第1天：向每孔含有sgRNA转导的Cas9-MOLM13或Cas9-MLL-AF9白血病细胞的培养物中加入100 µL新鲜培养基，使最终培养基体积达到200 µL。
3. 竞争性生长实验
- 第3天：转导后72小时（第3天），通过流式细胞术（FACS）检测每个孔中含sgRNA的BFP阳性细胞的比例。使用细胞活力染料标记并排除死细胞，以进行分析。
- 每次FACS分析后，将部分细胞继续传代至含有新鲜培养基的新孔中，以避免在实验过程中细胞过度生长。
- 每2–3天重复一次FACS分析，以检测BFP阳性（BFP+ve）细胞相对于BFP阴性（BFP-ve）细胞的相对比例（图3）。使用FlowJo或类似的FACS分析软件，分析每个时间点的BFP阳性细胞百分比。
- 将每个样本的Fcs文件拖入FlowJo软件。双击任一样本文件，在X轴为前向散射光（FSC）、Y轴为侧向散射光（SSC）的散点图上绘制点图，并圈选所有细胞。
- 双击已圈选的细胞，在Y轴为活力染料信号、X轴为FSC高度（H）或面积（A）的散点图上重新绘制，圈选出活力染料阴性（活细胞）的细胞群。
- 双击已圈选的活细胞群，在X轴为FSC（A）、Y轴为BFP的散点图上绘制，圈选BFP+ve细胞。通过将选定样本拖至Group选项卡下的All Samples，将所有这些门控应用到全部样本。
- 点击Table Editor创建所有样本的分析表格。将某一样本中的BFP+ve细胞数量拖入表格，然后点击Table Editor中的Display按钮，生成包含所有样本的批量报告表格，显示各样本中BFP+ve细胞的百分比。将该表格保存为xls文件。
- 计算随时间变化活细胞群体中BFP阳性细胞百分比的相对增加或减少，并将该比值与对照sgRNA（如荧光素酶、随机序列或GFP sgRNA）中的BFP阳性细胞比值进行比较。
- 以第3天为基准，绘制包括目的基因及对照在内的不同sgRNA对应的BFP阳性细胞比值曲线图。
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结果
在本研究中，我们首先用编码Cas9-杀稻瘟菌素慢病毒质粒的高滴度病毒感染携带MLL-AF9易位的MOLM13人急性髓系白血病（AML）细胞系。在我们的实验条件下，未经分选的混合MOLM13-Cas9细胞通过Western blot检测未显示高水平的Cas9表达，并且在进行基因编辑效率检测时表现不佳——所用方法如前所述7。因此，我们进一步建立了单细胞克隆，并仅选择Western blot检测显示高Cas9表达水平的克隆（图1）。我们挑选了两个不同的克隆，并用靶向AAVS1安全位点的sgRNA进行转导，方法如前文所述7。从嘌呤霉素筛选后的MOLM13-Cas9-AAVS1 sgRNA克隆中提取基因组DNA，使用跨越AAVS1 sgRNA切割位点的引物进行PCR扩增，并对每个MOLM13克隆的10个独立菌落中特异的268 bp PCR产物进行Sanger测序。与亲本序列比对后，我们发现MOLM13-Cas9克隆B3和MLL-...
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讨论
在本文中，我们描述了一种基于CRISPR-Cas9的竞争性生长实验的详细方案，用于通过流式细胞术在人/小鼠急性髓系白血病（AML）细胞中研究候选基因在AML细胞系中的功能图5）。该检测的目的是在中等通量规模上，评估基因敲除对急性髓系白血病（AML）细胞增殖维持能力的影响，持续时间为两到三周。为顺利实现本方案的规模化，某些关键步骤需严格遵循。在制备Cas9慢病毒时，必须将病毒培养上清液通过0.45 µM滤器过滤，以避免293T细胞污染病毒上清液。在离心感染（spinfection）过程中，使用保鲜膜或封口膜包裹离心板有助于防止离心期间发生污染；但离心完成后，在将培养板放回组织培养孵箱前，必须去除保鲜膜。评估表达Cas9的克隆株的基因编辑效率至关重要。基因组编辑效率较低的克隆株提示Cas9活性不足，可能影响实验的成功率。在我们的实验中，首先使用靶向AAVS1位点的sgRNA转导人AML Cas9克隆株，随后对其基因组DNA进行测序以评估编辑效率。可利用TIDE等在线网络工具比对AAVS1编辑序列与野生型序列的差异8 （https://...
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披露
A.J.D 是 A2A Pharmaceuticals（新泽西）和 Salgomed Therapeutics（圣地亚哥）的顾问。其他作者无任何利益冲突需要声明。
致谢
pCW-Cas9 质粒由 Eric Lander & David Sabatini 惠赠（Addgene 质粒 # 50661），pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W 质粒来自 Yusa 实验室（Addgene 质粒 #67974）。我们感谢 SBP 医学发现研究所流式细胞术核心平台在流式分析与分选方面提供的及时帮助。我们感谢 Lady Tata 纪念基金会对 A.D. 的资助支持。我们同时感谢以下资助机构的支持：美国国立卫生研究院/国家癌症研究所 P30 CA030199 癌症中心资助项目、V 基金会以及圣地亚哥国家癌症研究所癌症中心（C3）#PTC2017 对 A.J.D. 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| FLAG-M2 抗体 | sigma-aldrich | F3165, 货号 # SLBS3530V | |
| 抗小鼠抗体 | Invitrogen | 31446, 货号 # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto 最高灵敏度底物 | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc 成像系统 | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT 离心机 | Thermo Scientific | ||
| 杀稻瘟菌素 | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-谷氨酰胺 (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| 胎牛血清 (FBS) | SAFC | 12303C | |
| 单gRNA载体 | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic 核提取试剂盒 | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | ||
| T4 多核苷酸激酶 | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA 连接缓冲液 | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA 连接酶 | NEBioLabs | M0202S | |
| 氨苄青霉素 | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB 琼脂 | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB 肉汤 | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen 质粒小提试剂盒 | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop 分光光度计 | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| 重组小鼠 IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| 重组小鼠 IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| 重组小鼠 M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| 稳定感受态细胞 | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm 组织培养皿 | Fisher Scientific | 353003 | |
| 细胞裂解液 | Qiagen | 158906 | |
| 蛋白质沉淀液 | Qiagen | 158910 | |
| DNA 水合溶液 | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0x Taq Red Master Mix 试剂盒 | Genessee Scientific | 42-138 | |
| 嘌呤霉素 | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL 聚丙烯圆锥管 | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL 聚丙烯圆锥管 | Fisher scientific | 1495970C |
参考文献
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
- Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
- Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
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- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58(2018).
- Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
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