本文描述了一种基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）CRISPR-Cas9 的方法，可用于并行地对多个候选基因在急性髓系白血病（AML）细胞增殖中的作用进行简单且快速的研究。该技术具有可扩展性，也可应用于其他癌细胞系。
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本文内容
摘要
摘要
基因扰动研究已被广泛用于探究单个基因在急性髓系白血病（AML）发病机制中的作用。为了实现完全的基因敲除，许多研究采用了复杂的基因敲除模型。尽管这些使用基因敲除小鼠的研究为探究基因型与表型之间的关系提供了优雅且经过长期验证的系统，但开发一种快速且可扩展的方法，用于在AML模型中评估影响AML细胞增殖或存活的候选基因，将有助于加速对多个候选基因的并行分析。近年来基因组编辑技术的进步极大地提升了我们以前所未有的规模进行遗传扰动的能力。其中一种基因组编辑系统是基于CRISPR-Cas9的方法，可用于对靶细胞基因组进行快速而高效的修饰。CRISPR/Cas9介导的基因删除因其操作简便和易于扩展，成为在表型检测中分析大量基因最具吸引力的技术之一。本文介绍一种简单的方法，结合CRISPR/Cas9介导的基因破坏与基于高通量流式细胞术的竞争性检测，用于研究可能在人和小鼠AML细胞系增殖或存活中发挥重要作用的基因。
引言
过去几十年来，大量研究致力于揭示关键分子通路在急性髓系白血病（AML）发病机制中的作用。传统上，AML细胞中的基因失活主要通过条件性基因敲除小鼠或短发夹RNA（shRNA）来实现。尽管基因敲除小鼠能够提供时空可控的基因删除系统，但构建这类小鼠模型费时、费力且成本高昂。此外，基于重组策略的基因敲除难以扩展规模，不适合并行研究多个基因的功能。自从发现利用小干扰RNA（siRNA）或shRNA进行RNA干扰以敲低内源性mRNA的方法后，许多研究团队开始采用RNA干扰技术来探究特定基因在AML中的功能。由于小鼠和人类AML细胞均难以通过传统的脂质体转染方法进行有效转染，大多数研究采用慢病毒或逆转录病毒编码的shRNA来研究AML细胞中基因的功能。近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关的Cas核酸酶（CRISPR-Cas9）系统的发现彻底改变了基因靶向技术1,2,3。利用CRISPR-Cas9，可以高效且简便地对特定基因或基因组区域进行删除、编辑或标记。由于该技术具有操作简便、效率高和适用范围广等优势，基于CRISPR-Cas9的基因编辑正逐渐成为研究多种细胞类型中基因型与表型关系的首选方法。在AML研究中，CRISPR-Cas9技术也日益成为主流方法，不仅用于分析单个基因的功能，还被广泛应用于阵列式或混合式遗传筛选中，以并行方式系统性....
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方案
1. 构建高表达稳定且有活性Cas9的AML细胞系克隆
- Cas9 慢病毒的制备
- 第 0 天：在生物安全二级（BSL2）认证的细胞培养操作台中，将 4 × 106 个 293T 细胞接种于含 10% 胎牛血清（FBS）、青霉素和 L-谷氨酰胺的 10 mL DMEM 培养基中，置于 10 cm 组织培养皿内。将培养皿放入 37 °C 培养箱中孵育。
- 第 1 天：接种的 293T 细胞在第 1 天应达到 70–80% 汇合度。于下午按照以下方案进行转染。
- 将转染培养基、细胞培养基和转染试剂恢复至室温。解冻转染所需的所有质粒。
- 在 5 mL 离心管中，将 9 µg psPAX2、0.9 µg pMD2.G 和 9 µg pLenti-Cas9 质粒与 500 µL 转染培养基混合。
- 向 14 mL 圆底离心管中加入 1.7 mL 转染培养基。将 57 µL 转染试剂直接加入管内的转染培养基中，避免接触管壁。
- 轻柔地将全部质粒混合物加入转染试剂溶液中，并通过轻弹管壁混匀。室温孵育 20–30 分钟。在此期间，更换已接种 293T 细胞的培养皿中的培养基。
- 将转染混合物逐滴加入培养皿中，并轻轻左右摇动培养皿以充分混匀。将培养皿放回 37 °C 培养箱中孵育。
- 第 2 天：轻柔地吸除转染培....
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结果
在本研究中，我们首先用编码Cas9-杀稻瘟菌素慢病毒质粒的高滴度病毒感染携带MLL-AF9易位的MOLM13人急性髓系白血病（AML）细胞系。在我们的实验条件下，未经分选的混合MOLM13-Cas9细胞通过Western blot检测未显示高水平的Cas9表达，并且在进行基因编辑效率检测时表现不佳——所用方法如前所述7。因此，我们进一步建立了单细胞克隆，并仅选择Western blot检测显示高Cas9表达水平的克隆（图1）。我们挑选了两个不同的克隆，并用靶向AAVS1安全位点的sgRNA进行转导，方法如前文所述7。从嘌呤霉素筛选后的MOLM13-Cas9-AAVS1 sgRNA克隆中提取基因组DNA，使用跨越AAVS1 sgRNA切割位点的引物进行PCR扩增，并对每个MOLM13克隆的10个独立菌落中特异的268 bp PCR产物进行Sanger测序。与亲本序列比对后，我们发现MOLM13-Cas9克隆B3和MLL-.......
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讨论
在本文中，我们描述了一种基于CRISPR-Cas9的竞争性生长实验的详细方案，用于通过流式细胞术在人/小鼠急性髓系白血病（AML）细胞中研究候选基因在AML细胞系中的功能图5）。该检测的目的是在中等通量规模上，评估基因敲除对急性髓系白血病（AML）细胞增殖维持能力的影响，持续时间为两到三周。为顺利实现本方案的规模化，某些关键步骤需严格遵循。在制备Cas9慢病毒时，必须将病毒培养上清液通过0.45 µM滤器过滤，以避免293T细胞污染病毒上清液。在离心感染（spinfection）过程中，使用保鲜膜或封口膜包裹离心板有助于防止离心期间发生污染；但离心完成后，在将培养板放回组织培养孵箱前，必须去除保鲜膜。评估表达Cas9的克隆株的基因编辑效率至关重要。基因组编辑效率较低的克隆株提示Cas9活性不足，可能影响实验的成功率。在我们的实验中，首先使用靶向AAVS1位点的sgRNA转导人AML Cas9克隆株，随后对其基因组DNA进行测序以评估编辑效率。可利用TIDE等在线网络工具比对AAVS1编辑序列与野生型序列的差异8 （https://.......
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披露
A.J.D 是 A2A Pharmaceuticals（新泽西）和 Salgomed Therapeutics（圣地亚哥）的顾问。其他作者无任何利益冲突需要声明。
致谢
pCW-Cas9 质粒由 Eric Lander & David Sabatini 惠赠（Addgene 质粒 # 50661），pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W 质粒来自 Yusa 实验室（Addgene 质粒 #67974）。我们感谢 SBP 医学发现研究所流式细胞术核心平台在流式分析与分选方面提供的及时帮助。我们感谢 Lady Tata 纪念基金会对 A.D. 的资助支持。我们同时感谢以下资助机构的支持：美国国立卫生研究院/国家癌症研究所 P30 CA030199 癌症中心资助项目、V 基金会以及圣地亚哥国家癌症研究所癌症中心（C3）#PTC2017 对 A.J.D. 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| FLAG-M2 抗体 | sigma-aldrich | F3165, 货号 # SLBS3530V | |
| 抗小鼠抗体 | Invitrogen | 31446, 货号 # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto 最高灵敏度底物 | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc 成像系统 | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT 离心机 | Thermo Scientific | ||
| 杀稻瘟菌素 | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-谷氨酰胺 (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| 胎牛血清 (FBS) | SAFC | 12303C | |
| 单gRNA载体 | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic 核提取试剂盒 | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | ||
| T4 多核苷酸激酶 | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA 连接缓冲液 | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA 连接酶 | NEBioLabs | M0202S | |
| 氨苄青霉素 | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB 琼脂 | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB 肉汤 | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen 质粒小提试剂盒 | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop 分光光度计 | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| 重组小鼠 IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| 重组小鼠 IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| 重组小鼠 M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| 稳定感受态细胞 | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm 组织培养皿 | Fisher Scientific | 353003 | |
| 细胞裂解液 | Qiagen | 158906 | |
| 蛋白质沉淀液 | Qiagen | 158910 | |
| DNA 水合溶液 | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0x Taq Red Master Mix 试剂盒 | Genessee Scientific | 42-138 | |
| 嘌呤霉素 | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL 聚丙烯圆锥管 | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL 聚丙烯圆锥管 | Fisher scientific | 1495970C |
参考文献
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
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重印与许可
