一项免疫组织病理学研究：描绘巨细胞动脉炎中叶酸受体β巨噬细胞及血管免疫微环境

摘要

本方案阐述了如何利用组织病理学检查和免疫组织化学方法，对巨细胞动脉炎患者颞动脉活检标本中叶酸受体β巨噬细胞进行表征，并分析其与总免疫细胞浸润之间的关系。

摘要

巨细胞动脉炎（GCA）是一种影响老年人的中大型动脉的慢性免疫介导性疾病。GCA 的临床表现包括关节炎以及头痛、中风或视力丧失等闭塞性症状。巨噬细胞和辅助性T淋巴细胞浸润血管壁，引发促炎性反应，导致血管损伤和缺血。迄今为止，尚无可用于监测疾病活动度并指导治疗反应的 GCA 生物标志物。

叶酸受体β（FRB）是一种糖基磷脂酰肌醇蛋白，通过锚定于细胞膜上，在单核-巨噬细胞系中正常表达，同时在大多数髓系白血病细胞以及肿瘤和类风湿性滑膜巨噬细胞中也有表达，其表达水平与疾病严重程度相关。FRB能够结合叶酸化合物、叶酸偶联物以及抗叶酸药物，这使其成为癌症和炎症性疾病研究中一个具有药物开发潜力的靶点。本报告描述了用于评估FRB在巨细胞动脉炎（GCA）免疫病理学背景下表达情况及分布特征的组织病理学和免疫组织化学方法。

对巨细胞动脉炎（GCA）患者及正常对照者的福尔马林固定、石蜡包埋的颞动脉活检组织进行苏木精和伊红染色，以评估组织病理学特征并识别特异性病理表现。采用免疫组织化学方法检测FRB、CD68和CD3的表达。通过显微镜分析，在10个选定的高倍视野切片中定量统计阳性染色细胞的数量，并记录其在动脉壁中的相应定位。

在巨细胞动脉炎（GCA）中可见伴有内膜增生和弹性层破坏的淋巴组织细胞（LH）性炎症，而对照组中未发现此类改变。LH浸润细胞约由60%淋巴细胞和40%巨噬细胞组成。FRB表达局限于巨噬细胞，占总CD68+巨噬细胞群体的31%，定位于中膜和外膜。对照组中未见FRB表达。

本方案展示了FRB巨噬细胞在GCA血管免疫微环境中的独特数值与空间分布模式。

引言

巨细胞动脉炎（GCA）是一种累及中大型动脉的炎症性疾病，主要侵犯主动脉及其分支，多见于老年人。临床表现包括从轻度至重度的缺血性并发症，如头痛、下颌疼痛、视力丧失、卒中和组织坏疽。诊断依据包括升高的炎症标志物（如红细胞沉降率，ESR）以及颞动脉活检（TAB）所见的特征性组织病理学表现¹。GCA 是最常见的成人血管炎，由于用于诊断的颞动脉易于获取，相较于其他血管病变具有优势，因而更便于研究其发病机制。TAB 的典型病理发现包括在内膜、中膜和外膜各层血管壁中均可见巨噬细胞/组织细胞和 T 淋巴细胞浸润，同时伴有正常分隔这些结构的弹性膜破坏²。目前的研究证据表明，GCA 由某种未知抗原引发，该抗原激活血管外膜中的树突状细胞，继而募集辅助性 T（Th）细胞，特别是 Th1 和 Th17 亚型，分别分泌白细胞介素-17 和干扰素-γ（IFN-γ）。IFN-γ 进而招募并激活巨噬细胞，促使其产生细胞因子和蛋白酶。这些物质包括促炎性细胞因子，如 IL-12，它可反过来激活 Th1 细胞，形成正反馈环路；此外还有肿瘤坏死因子 和白细胞介素-6，它们可导致关节炎和发热，以及破坏弹性膜的基质金属蛋白酶。糖皮质激素（GC）是目前标准的慢性期治疗方案，可通过抑制 Th17/IL-17 通路部分控制细胞因子反应，但对 Th1/IFN-γ 通路无明显作用^3,4。然而，停用 GC 常导致疾病复发。作为替代治疗方案，甲氨蝶呤已被重新用于 GCA 的治疗，但临床疗效终点并未持续达成，且尚未采用更敏感的生物标志物进行治疗监测^5,6。2017 年，白细胞介素-6 抑制剂托珠单抗被批准用于 GCA 治疗，因其在控制疾病活动和减少糖皮质激素用量方面表现出显著疗效^7,8。

迄今为止，尚无理想的巨细胞动脉炎（GCA）生物标志物。因此，难以监测疾病活动度，并难以调整现有药物的剂量以避免不良反应及减轻社会经济负担。因此，迫切需要寻找一种与疾病活动度相关的候选生物标志物，以提供关于发病机制的新见解，并辅助制定治疗决策。

巨噬细胞活化的失调是巨细胞动脉炎（GCA）发病机制中的关键因素。因此，治疗GCA的有效方法之一可能是选择性靶向活化的巨噬细胞。叶酸受体β（FRB）是一种糖基磷脂酰肌醇糖蛋白，锚定于细胞膜上，表达于正常的髓单核细胞、髓系白血病细胞以及活化的巨噬细胞中。其配体叶酸在还原形式下是一种必需维生素，能够促进细胞DNA合成、甲基化及修复⁹。FRB的表达在自身免疫性疾病和癌变过程中被诱导。在类风湿关节炎中，其表达局限于单核细胞或促炎性M1型巨噬细胞表面；而在实体器官肿瘤及髓系恶性肿瘤中，则局限于抗炎性M2型巨噬细胞^10,11,12,13。除了作为活化巨噬细胞潜在生物标志物的作用外，FRB还可通过一个多步过程实现药物的选择性转运：首先受体在细胞表面与叶酸、抗叶酸剂或叶酸偶联药物结合，随后发生内化、释放，并最终将目标药物递送至细胞内部的分子机制系统^12,14,15,16。与癌细胞和活化巨噬细胞中表达的FRB不同，正常造血细胞中表达的FRB无法结合叶酸类物质，从而确保FRB/叶酸介导的药物递送仅限于FRB阳性的炎症细胞或癌细胞。

在我们之前的研究中，我们首次证明了FRB在GCA巨噬细胞中表达，且其表达与CD68+和内皮素受体β巨噬细胞相关，这些巨噬细胞参与了GCA的发病机制¹⁷。在本报告中，我们描述了用于评估FRB巨噬细胞的组织病理学和免疫组织化学方法，并分析了总淋巴细胞和巨噬细胞计数，以深入了解FRB在GCA血管环境中的定位。

方案

所描述的所有方法均经宾夕法尼亚州立大学机构审查委员会批准。

1. 获取颞动脉活检后的组织病理学制备与处理

注意： 颞动脉活检（TAB）由认证外科医生在局部麻醉和无菌条件下进行。手术取患侧较明显部位约3 cm的动脉组织后，立即将标本置于福尔马林中固定24小时，随后切成3至4 mm的小段，包埋于石蜡中，注意确保组织在蜡块中的正确方向，之后 于室温保存。标本的选择需在核实患者病历资料后进行。诊断依据美国风湿病学会1990年标准，需满足以下5项指标中的至少3项：年龄>50岁、新发头痛、颞动脉压痛、魏氏法测得红细胞沉降率>50 mm/h，以及异常的颞动脉活检结果。 为确保安全，在处理标本、化学试剂和抗体时必须始终佩戴防护手套。

1. 使用切片机从包埋块中切下4-5 µm厚的切片，并用苏木精和伊红（H&E）染色。选用选定的正常组织对照切片以确保质量。
2. 将切下的切片漂浮于40 °C的温水浴中以去除皱褶，然后用涂覆过的玻璃载玻片捞起。  将载玻片置于60 °C烘箱中的温热金属板上，加热60分钟，以促进切片干燥并牢固附着于载玻片上。
3. 将载玻片置于60 °C烘箱中的温热金属板上，加热60分钟，以促进切片干燥并牢固附着于载玻片上。
4. 在显微镜载玻片上贴附3个切片。
5. 将载玻片放入垂直玻片架中，在37 °C下干燥过夜，持续24小时。
6. 将载玻片放入容器中，并在4 °C下保存。

2. 免疫组织化学制备、脱蜡、 抗原修复与染色^15,18,19,20

1. 将切片装入切片架中，按以下顺序将切片架依次浸入各试剂中：在100%二甲苯中处理两次，每次5分钟，每30秒轻轻振荡10秒；在100%乙醇中处理一次，振荡10秒；在90%乙醇中处理一次，振荡10秒；在70%乙醇中处理一次，振荡10秒；在双蒸水中处理两次，每次振荡10秒。 
   注意：二甲苯和丙酮的操作应在通风橱中进行，以避免吸入导致呼吸系统毒性。
2. 将切片架转移至盛有200 mL预热至95 °C的10 mmol/L、pH 6.0柠檬酸盐缓冲液的玻璃容器中进行抗原修复。在水浴中计时30分钟，随后于室温冷却20分钟，再用流水冲洗5分钟。
3. 使用200 mL的3%过氧化氢溶液孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。用200 µL Tris缓冲盐水溶液（TBSS）洗涤切片3次。
4. 从切片架上取下切片，轻轻吸干每张切片上多余的缓冲液。进行染色时，每张切片加入200 µL以下一抗溶液，加盖盖玻片后置于湿盒中，室温孵育1小时：
   FRB抗体，稀释比例1:800
   单克隆小鼠抗人CD68抗体，稀释比例1:200
   多克隆兔抗人CD3抗体，稀释比例1:100
   注意：福尔马林固定石蜡包埋的胎盘组织切片也按照步骤2.1至2.9进行处理，并使用抗FRB18抗体孵育作为阳性对照。染色结果通过优化抗体浓度获得，采用倍比稀释法进行滴定（例如1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600）。
5. 孵育结束后取下并弃去盖玻片。用TBSS洗涤切片3次，每次2分钟，沥干并吸去多余缓冲液。
6. 每张切片加入200 µL含生物素化的抗兔/抗鼠二抗溶液，以与组织抗原结合的未标记一抗发生反应。加盖盖玻片后置于湿盒中，室温孵育45分钟。
7. 孵育结束后取下并弃去盖玻片。用TBS洗涤切片3次，每次2分钟，沥干并吸去多余缓冲液。
8. 每张切片加入200 µL二氨基联苯胺（DAB）+底物缓冲液（咪唑盐酸）-发色系统，孵育10分钟以显色。随后用TBSS洗涤，再用自来水冲洗10分钟。
9. 用苏木精复染3分钟。
10. 在切片表面滴加70 µL封片剂进行封片。缓慢将盖玻片倾斜盖下，避免产生气泡。静置24小时使其干燥。 

3. 组织病理学和免疫组织化学（IHC）分析

使用光学显微镜检查巨细胞动脉炎（GCA）阳性患者和正常受试者的苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组化（IHC）染色切片。

1. 对于H&E染色切片：
   1. 评估血管结构，识别内膜中的内皮细胞、中膜中的平滑肌细胞，以及外膜中的成纤维细胞和血管滋养管^21,22。
   2. 识别巨细胞动脉炎（GCA）的特征，包括淋巴细胞和巨噬细胞/组织细胞浸润、细胞增生以及内弹性膜降解。
   3. 通过识别并量化巨噬细胞相对于淋巴细胞的数量，分析淋巴组织细胞浸润情况；评估内弹性膜破坏程度以及固有细胞的增生性改变，并与对照组进行比较。
2. 对于免疫组化（IHC）染色切片：
   1. 观察FRB的染色模式，注意其在特定类型细胞中的表达情况，以及其在血管各层中的分布，同时分析其与总体免疫细胞浸润、总巨噬细胞标志物抗CD68和泛淋巴细胞标志物抗CD3的关系。
   2. 通过计数10个随机选取的高倍视野（hpf）中阳性染色的FRB、CD68和CD3细胞数量，量化其表达水平，并记录平均值。
      注意：上述正常与病变细胞及结构的鉴定由认证的心血管病理学家（J.M.）和风湿病学家（S.A.A.）完成，所有病例的结果均已记录。
   3. 使用数码相机采集代表性图像。
      注意：完成上述步骤后，剩余样品可于-80 °C保存。

结果

组织病理学发现

正常标本的H&E染色显示正常的动脉结构：内膜层（tunica intima）可见内皮细胞，中膜层（tunica media）含有平滑肌细胞，外膜层（tunica adventitia）为包含成纤维细胞和称为血管滋养血管（vasa vasorum）的小血管的异质性胶原基质。未见炎性浸润。巨细胞动脉炎（GCA）阳性颞动脉标本显示中至重度炎症，可见巨噬细胞/组织细胞、淋巴细胞、偶见浆细胞及多核巨细胞的聚集。管腔狭窄，伴有内膜增厚及内弹力板90%的破坏（图1）。

免疫组织化学结果

讨论

GCA 是成人最常见的血管炎，其病理学特征表现为辅助性 T 淋巴细胞与活化巨噬细胞的强效组合，这种组合也可在其他肉芽肿性疾病或血管病变中发现，例如结节病和肉芽肿性多血管炎。^2,3在巨细胞动脉炎（GCA）中，颞动脉可良好代表中至大动脉，颞动脉活检可获取足量组织样本，可包埋于石蜡块中长期保存数年，从而为研究新兴诊断和治疗靶点（如FRB）在血管炎微环境中的作用提供了机会。我们 采取了 通过可获取的组织样本和标准的免疫病理学方法，能够可靠地利用免疫组织化学（IHC）分析纤维性内膜增生（FRB）。我们的研究结果表明，组织病理学和免疫组织化学不仅可用于确认巨细胞动脉炎（GCA）的诊断及血管损伤范围，还可用于验证不同巨噬细胞亚型在GCA中的作用。

组织病理学和免疫组化（IHC）方法均较为耗时，且需要组织化学技术人员、病理学家和风湿病学家的专业技能；但这些技术已得到充分建立，可作为采用其他方法（如免疫荧光和流式细胞术）的基础。然而，这些方法的缺点在于需要新鲜冷冻...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
切片机	Reichert-Jung
普通和磨砂载玻片及盖玻片	Fisher Scientific
垂直玻片架	Fisher Scientific
光学显微镜	Olympus BX60  显微镜
二甲苯
蒸馏水中的丙酮			浓度分别为 100%、90%、70%
Tris缓冲盐溶液（TBS）	Dako Wash BufferS3006
3% 过氧化氢TBS溶液
二氨基联苯胺（DAB）	Sigma Fast Tablet set
Chemical Permount  封片介质	Fisher Scientific	SP-15-100
Harleco Gill's III 苏木精染液	Fisher Scientific 23-750-019
Harleco 1% 醇溶性伊红Y储备液	Fisher Scientific	23-749-977
10 mM 柠檬酸一水合物（pH 6.0）
多克隆兔抗叶酸受体β	Manohar Ratnam		最佳稀释比例为 1:800
单克隆小鼠抗人CD68抗体	Dako	M071801	最佳稀释比例为 1:200
多克隆兔抗CD3抗体	Agilent Dako	A0452	最佳稀释比例为 1:100
聚合物山羊抗兔/小鼠二抗	Dako
胎盘组织			作为FRB阳性对照