开发一种可提供四种纳米颗粒暴露浓度的单鼻吸入毒性试验舱

摘要

设计并验证了一种可同时在四个不同暴露浓度下进行吸入毒性测试的仅鼻暴露吸入毒性舱，该装置已针对各浓度暴露端口的流场均匀性及交叉污染进行了验证。本文介绍了一项确认该设计舱体适用于吸入毒性测试的实验方案。

摘要

基于计算流体动力学的数值分析，设计并验证了一种具有四种不同暴露浓度的单鼻暴露吸入毒性试验舱，用于评估各浓度组暴露端口之间的流场均匀性及交叉污染情况。将设计的流场数值与水平和垂直位置上各暴露端口的实际测量值进行比较。为此，采用纳米级氯化钠颗粒作为测试颗粒，将其引入吸入舱内，以评估各浓度组之间舱室的交叉污染情况及浓度维持能力。结果表明，所设计的多浓度吸入毒性试验舱可用于动物吸入毒性试验，且各浓度组之间无交叉污染。此外，该多浓度吸入毒性试验舱亦可转换为单浓度吸入试验舱。通过气体、有机蒸气或非纳米级颗粒的进一步测试，将有助于验证该试验舱在其他测试物质吸入试验中的适用性。

引言

吸入毒性测试是评估化学物质、颗粒物、纤维和纳米材料风险的最可靠方法^1,2,3。因此，当化学物质、颗粒物、纤维和纳米材料的暴露途径为吸入时，大多数监管机构均要求提交吸入毒性测试数据^4,5,6,7,8。目前，吸入毒性系统主要有两种类型：全身体暴露系统和仅鼻部暴露系统。标准的吸入毒性测试系统，无论是全身体暴露还是仅鼻部暴露，均需至少四个暴露舱，用于使大鼠和小鼠暴露于四种不同浓度下，即新鲜空气对照组以及低、中、高三个浓度组^7,8。经济合作与发展组织（OECD）的测试指南建议，所选的目标浓度应能够识别出靶器官，并显示出明确的浓度-反应关系^7,8。高浓度水平应产生明显的毒性效应，但不应导致动物死亡或出现可能致死或妨碍对结果进行有意义评估的持续性症状^7,8。在满足颗粒物粒径分布标准的前提下，可达到气溶胶的最大可实现浓度或高浓度水平。中等浓度水平应合理设置，以在低浓度与高浓度之间产生毒性效应的梯度变化^7,8。低浓度水平最好为未观察到有害效应浓度（NOAEC），应几乎不产生或完全不产生毒性迹象^7,8。全身体暴露舱使动物在金属网笼中处于无束缚状态进行暴露，而仅鼻部暴露舱则使动物在受限的管状装置中处于束缚状态进行暴露。这种束缚可防止气溶胶从动物周围泄漏而造成损失。由于全身体暴露舱体积较大，需要使用大量测试样品才能对实验动物进行暴露；而仅鼻部暴露系统中的管状束缚会限制动物活动，可能导致不适或窒息。尽管如此，监管用的OECD吸入毒性测试指南更推荐使用仅鼻部吸入暴露系统^4,5,6,7,8。

然而，容纳四腔室系统（无论是全身暴露式还是仅鼻部暴露式）成本高昂、占用空间大，且需要内置空气净化与循环系统。此外，四腔室系统还可能需要独立的受试物发生装置，以使动物暴露于目标浓度，以及独立的检测设备来监测受试物浓度。因此，由于标准吸入毒性试验需要大量投入，在小型研究机构中亟需开发一种更便捷、经济的全身或仅鼻部暴露系统。在设计吸入暴露室时，通常还采用计算流体动力学（CFD）建模，以实现颗粒物、气体或蒸气分布的均匀性^{9,10,11,12,13}。已有研究通过数值分析对小鼠全身暴露室进行评估，并结合实验结果进行了验证¹⁰。例如，已利用CFD对气流和颗粒物运动轨迹进行建模，并在全身暴露室的九个区域测量了颗粒物分布的均匀性¹⁰。此外，也已通过CFD数值分析对仅鼻部暴露室进行了评估¹³。随后，通过将数值分析结果与使用纳米颗粒的实验研究进行比较，进一步完成了对仅鼻部暴露室的评估¹³。

本研究介绍了一种仅暴露实验动物鼻部的吸入暴露舱系统，该系统可在同一暴露舱内使动物接触四种不同浓度的气溶胶。该系统首先通过计算流体动力学（CFD）和数值分析进行设计，随后利用纳米级氯化钠颗粒开展实验研究，以验证暴露舱内气流的均匀性及交叉污染情况。研究结果表明，该仅暴露鼻部的暴露舱能够实现四种不同浓度的同时暴露，适用于小规模学术机构和科研单位的动物暴露实验。数值分析的设置与实验条件保持一致：在单浓度暴露条件下，内层塔的气溶胶流量设定为48 L/min，外层塔的鞘气流量设定为20 L/min；在多浓度暴露条件下，每一级内层塔入口的气溶胶流量均为11 L/min。出口压差维持在-100 Pa，以确保排气顺畅并防止泄漏。假设动物固定装置处于封闭且空置状态。

方案

1. 数值分析方法

1. 根据图1和表1¹⁴中描述的几何形状，对腔室内部的流场进行分析。
   注意：根据几何形状对流场进行数值分析，可预测气溶胶的流动，并将其评估为可测试的装置。
2. 设计腔室为4层×12列，共48个端口，其核心分为内塔和外塔，如图1B所示。
   注意：每层设有12个暴露端口，用于放置实验动物。应满足经合组织（OECD）指南文件（GD）39⁶中提出的建议。
3. 对于单浓度暴露，将混合板置于内塔顶部，以混合测试物质并确保各层之间的浓度均匀；对于多浓度暴露，通过分隔盘将内塔分为四层，以实现不同暴露浓度的分离。
   注意：混合板

2. 实验评估的准备

1. 腔室
   1. 将腔室分为三个部分：进气口、鞘气层和排气口，如示意图所示（图2）。
      注：进气口是气溶胶流入内腔的位置，鞘气层是内外塔之间用于额外气流通过的空间。
   2. 将气溶胶（或测试物质）输送至内塔及实验动物，而动物呼出的含有过量气溶胶的气体则随鞘气一起通过排气口排出。
      注：动物固定装置处于封闭且空置状态。
   3. 使用鼓风机和变频器保持腔室内压力恒定，因为内腔静压由鞘气气流控制。
   4. 设计设备以测量单浓度暴露情况下位于鼻部暴露腔前端混合腔中测试气溶胶（或物质）浓度的均匀性。
      注：可通过粒子数浓度和粒径分布评估测试气溶胶的均匀性。对于气体和蒸气，各腔室浓度样本与平均腔室浓度的偏差不得超过±10%；对于液体或固体气溶胶，偏差不得超过±20%^4,5,6,7,8。因此，当测试粒子浓度不稳定时，可将气溶胶气流通过排气扇旁路排出。
   5. 检查是否存在泄漏，通过确认系统在±500 Pa条件下保持密闭30分钟，以验证试验的可靠性并确保安全性。
      注：可通过皂泡法检测泄漏。
2. 环境控制与监测
   1. 在用户界面的控制设置中，将气溶胶（单浓度/多浓度）和鞘气的总进气流量分别设定为48 L/min或44 L/min（单浓度或多浓度）以及20 L/min，并将腔室内压力恒定维持在−100 Pa。
   2. 将温度和湿度分别维持在23 °C和45%。使用加湿器控制暴露空气的湿度。
   3. 在恒温恒湿受控环境中进行实验，以符合OECD吸入毒性试验指南^4,6,7,8的要求。
3. 气流均匀性测量
   1. 通过由质量流量控制器（MFC）控制的、配备HEPA过滤器的洁净空气供应系统，向吸入腔输送48 L/min的洁净空气。
      注：洁净空气需经HEPA过滤器过滤后获得。
   2. 在单浓度暴露情况下，利用混合腔使气流达到稳定。
   3. 在多浓度暴露情况下，将供气喷嘴连接至一个端口，用于注入新鲜对照空气或测试气溶胶（或物质）。
   4. 使用质量流量计测量每个端口的气流速度。
4. 粒子发生
   1. 使用五喷嘴雾化器生成NaCl纳米粒子，以评估吸入腔的设计性能。
      注：使用0.1%wt的NaCl溶液生成NaCl纳米粒子。
   2. 调节MFC以控制NaCl气溶胶混合空气的产量，在单浓度暴露时为48 L/min，在多浓度暴露时每四个阶段为12 L/min。
      注：每个鼻部暴露腔的每个端口接收1 L/min的气流（即：48端口/鼻部暴露腔（四阶段）；48端口/四阶段；12端口/阶段）。
   3. 在旁路中供应洁净空气用于稀释。
      注：NaCl纳米粒子的计数中值直径和几何标准偏差分别维持在76 nm和1.4以内。
5. 粒子均匀性测量
   1. 使用由差分迁移率分析仪（DMA）和冷凝粒子计数器（CPC）组成的扫描迁移率粒径谱仪（SMPS），测量从注射喷嘴释放出的NaCl纳米粒子的粒径分布。
   2. 使用Am气溶胶中和器去除粒子的静电荷，减少粒子在腔壁上的沉积，从而提高测量效率¹⁸。
   3. 保持DMA中气溶胶与鞘气的流量比为1:10，使气溶胶和鞘气的流量分别维持在1 L/min和10 L/min。

3. 流速均匀性测试

1. 多浓度暴露
   1. 通过气溶胶入口以 11 L/min 的流速通入洁净空气，设定注射喷嘴的流速。为四个阶段中的每一个阶段选择 11 个喷嘴端口。
   2. 连接流量计至选定的喷嘴，测量流速。
   3. 重复步骤 3.1.2 三次，以验证可重复性。
2. 单浓度暴露
   1. 通过气溶胶入口以 48 L/min 的流速通入洁净空气，设定注射喷嘴的流速。从 48 个端口中随机选择 24 个喷嘴端口。测量三次以验证可重复性。

4. 颗粒均匀性测试

1. 多浓度暴露
   1. 通过气溶胶入口以11 L/min的流速输送生成的颗粒，设定喷嘴的粒径分布（按第2节所述操作）。
   2. 从四个阶段中随机选取六个喷嘴端口；重复测量3次，以验证可重复性。
2. 单浓度暴露
   1. 通过气溶胶入口以20 L/min的流速输送生成的颗粒，同时以28 L/min的流速通入洁净空气，总流速为48 L/min，从而设定喷嘴的粒径分布（如2.4和2.5节所述）。
   2. 从四个阶段中随机选取六个喷嘴端口。
   3. 测量颗粒浓度，将SMPS连接至所选喷嘴。
   4. 重复步骤4.2.3三次，以验证可重复性。

5. 交叉污染测试

1. 在多浓度暴露情况下设置三个阶段。
2. 将两个装有不同溶液浓度的发生器和一条洁净空气管路分别连接至三个阶段。
3. 通过气溶胶入口以11 L/min的流速输送生成的颗粒物和洁净空气（如2.4和2.5所述），设定喷嘴的粒径分布。
4. 从所有三个阶段中随机选择一个端口喷嘴。
5. 测量颗粒物浓度，将SMPS连接至所选端口。
6. 重复步骤5.5共15次，以验证可重复性。

结果

实验装置

图1展示了基于本方案第2节的仅鼻暴露吸入染毒系统示意图，包括带有质量流量控制器（MFC）的气溶胶发生器、仅鼻暴露染毒舱、用于监测空气质量的颗粒物测量仪器、控制器和排气模块。

数值分析设计

图2展示了用于多浓度暴露（图2A）和单浓度暴露（图2B）的鼻部暴露式吸入室的结构。对照用的新鲜空气入口位于顶部，而低、中、高浓度暴露入口如图2A

讨论

目前，吸入毒性测试是评估人类呼吸系统吸入的气溶胶材料（颗粒物和纤维）、蒸气和气体的最佳方法^14,15。吸入暴露方法有两种：全身体暴露和仅鼻部暴露。然而，仅鼻部暴露系统可最大限度减少通过皮肤和眼睛等非吸入途径的暴露，并允许使用极少量的受试物质进行测试，因此被经济合作与发展组织（OECD）吸入毒性测试指南推荐为首选暴露方法，适用于急性^4,6、亚急性⁷和亚慢性⁸毒性测试。

标准的吸入毒性实验系统需要四个染毒室（新鲜空气对照组以及低、中、高三个浓度组），因此该操作成本较高、占用空间大，并且需要配备试验物质发生系统和环境控制系统。然而，本文介绍的多浓度吸入染毒室在未来可为小型研究机构提供更为经济的解决方案。该多浓度吸入染毒室基于单浓度染毒室，通过数值分析方法设计和开...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FLUENT V.17.2	ANSYS		软件
质量流量计 (MFM)	TSI	4043
SMPS（扫描迁移粒径谱仪）	Grimm	SMPS+C
五喷嘴雾化器	HCTM	5JA-1000
质量流量控制器 (MFC)	Horiba	S48-32