基于纳米颗粒示踪分析的单个细胞外囊泡在人血中快速荧光表征

摘要

在本实验方案中，我们描述了从人全血中快速分离细胞外囊泡并通过基于荧光的纳米颗粒追踪分析对特定标志物进行表征的完整流程。所展示的结果具有高度可重复性，且该方法可调整用于细胞培养上清液的分析。

摘要

细胞外囊泡（EVs），包括外泌体，是一类存在于体液中的特化膜性纳米级囊泡，由多种细胞持续释放，在调控细胞间通讯及多种生物学过程中发挥关键作用。目前已报道了多种EVs的表征方法。然而，这些方法大多存在制备与表征过程耗时较长的缺点，或由于EVs体积微小且缺乏明确的亚群，难以对特定目标标志物进行分析。尽管过去十年中EVs分析技术已取得显著进展，但目前仍缺乏针对单个EVs表征的标准化方法。s. 在此，我们展示了一种基于荧光纳米颗粒追踪分析的单个细胞外囊泡（EV）表征的半自动化方法。本方案针对该领域研究人员普遍面临的问题，提供了从EV快速分离到利用PKH67（一种通用细胞膜标记物）以及特异性表面标志物（如CD63、CD9、波形蛋白和溶酶体相关膜蛋白1（LAMP-1））对EV进行表征的完整工作流程。实验结果表明该方法具有高度可重复性，并通过Western blot等其他方法得到了验证。本研究所用实验均 exclusively 采用人血清样本中分离的EV，但该方法同样适用于血浆或其他体液中的EV，也可经调整后用于细胞培养上清液中EV的表征。无论EV生物学研究未来如何发展，本方案均提供了一种快速、可靠的单个EV特异性标志物表征方法。 关键词：细胞外囊泡，纳米颗粒追踪分析，PKH67，CD63，CD9，波形蛋白，LAMP-1，人血清，EV分离，表面标志物表征

引言

细胞外囊泡（EVs），包括外泌体，是一类特殊的膜性纳米级囊泡（20–150 nm），含有特定组合的脂质、黏附分子和细胞间信号分子，以及其他功能性胞质成分如微小RNA（miRNA）和信使RNA（mRNA），在调控细胞间通讯中发挥关键作用^1,2. 多种不同细胞类型均可向其周围环境释放细胞外囊泡（EVs）， 例如， 内皮细胞、免疫细胞和肿瘤细胞，可在血清、精液、尿液、乳汁、唾液或脑脊液等体液中检测到^3,4越来越多的研究强调了细胞外囊泡（EVs）作为多种疾病早期诊断和/或疾病进展预测潜在生物标志物的多样化作用。^5,6外泌体通常通过其特异性相关的分子来表征，而不论其来源细胞类型如何⁷例如，外泌体含有不同的四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）、主要组织相容性复合物I类（MHC I）分子、多种跨膜蛋白、典型的胞质蛋白（微管蛋白和肌动蛋白）、参与多泡体（MVB）形成的分子（TSG101和Alix）、热休克蛋白（HSP 70和HSP 90），以及参与信号转导的蛋白（蛋白激酶）。⁸.

已报道多种不同的方法用于EVs的表征⁹最常用且普遍的细胞外囊泡分析方法是流式细胞术¹⁰，扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）¹¹生化表征细胞外囊泡（EV）内容物最成熟且常用的方法是蛋白质印迹（Western blotting）。^12,13尽管扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）能够检测整个尺寸范围内的细胞外囊泡（EVs），但这些方法在特异性表面蛋白的鉴定方面能力极为有限，这是其显著缺点。相比之下，流式细胞术是识别特定EV表面标志物的有力工具，但该方法的检测阈值限制了其仅能分析尺寸大于500 nm的EVs。因此，目前尚无法通过上述三种成熟方法中的任何一种，实现对分离EVs的特异性表面标志物检测。我们此前曾描述另一种高灵敏度的EV可视化与分析方法——纳米颗粒追踪分析（nanoparticle-tracking analysis, NTA）¹⁴简而言之，该方法结合了两种不同的物理原理：首先，当粒子受到激光束照射时会散射光；其次，基于布朗运动原理，粒子在液体悬浮液中的扩散速率与其粒径成反比。用于液体样品的半自动化台式纳米粒子分析仪器包含粒子追踪分析仪及基于软件的分析系统，可记录单个粒子散射光的数字图像。粒子及其运动通过配备视频相机的激光散射显微镜进行检测。激光束呈垂直方向，而光学轴呈水平方向，并聚焦于充满样品的样品通道内。通过对散射光斑及其运动速度的图谱数据分析，可确定粒子的总数及粒径分布。激光照射后，粒子产生光散射，散射光由数字视频相机记录。 通过 显微镜¹⁴相较于之前的方法，本方法的改进之处在于将一个500 nm长波通（LWP）截止滤光片插入激光器（波长为488 nm）与细胞通道之间，从而实现了对荧光标记颗粒的直接分析图1）。本方案针对该领域众多研究人员对单个EV快速表征的普遍需求， 例如， 根据其亲本来源。在本方案中，我们描述了从人全血中快速分离细胞外囊泡（EVs）并利用基于荧光的纳米颗粒追踪分析对特定标志物进行快速表征的完整工作流程。可通过通用细胞膜标记物PKH67染色以及特异性外泌体标志物染色来检测EVs， 例如， CD63、CD9 和波形蛋白。本方案也适用于 EDTA 和枸橼酸盐抗凝血浆，以及其他体液和细胞培养上清液。

方案

杜塞尔多夫大学机构伦理委员会已批准本研究中所展示的实验（参考编号：3381）。

1. 从人全血中分离细胞外囊泡

1. 使用外泌体沉淀液分离细胞外囊泡。
   1. 在血清分离管（SST）中采集2 mL人全血 通过 静脉穿刺后，将采血管在室温（RT）孵育15分钟，直至凝固完成。
   2. 将SST在1,700 x g条件下离心 g 在室温下静置10分钟，使细胞与血清分离，然后将1 mL血清转移至1.5 mL离心管中。将富血小板血浆（PRP）在3,000 x g 在4 °C下离心15分钟以去除血小板，然后将100 μL去血小板血浆（PPP）转移至新的1.5 mL反应管中。
   3. 加入25 µL外泌体沉淀液（4份PPP与1份外泌体沉淀液混合），充分涡旋混匀。将样品置于冰上孵育30分钟。孵育期间保持离心管直立，不要翻转或混匀管内液体。
   4. 以 1,500 x g 在4 °C下离心30分钟以沉淀EVs。离心后，EVs在容器底部形成浅黄色或白色沉淀。吸除上清液，将样品在1,500 x g 4 °C下离心5分钟。
   5. 彻底去除所有液体痕迹，通过反复吹打将沉淀重悬于100 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中。若不立即进行分析，将细胞外囊泡（EV）悬液储存于-80 °C。
      注意：从血浆中分离EVs时，纤维蛋白原和纤维蛋白可能阻碍有效回收，且重悬沉淀物更困难、耗时更长。
2. 采用超速离心法分离EVs。
   1. 从冰箱中取出预冷的转子（TLA-55 固定角转子），并在使用前将超速离心机预冷。
   2. 将1.25 mL PPP（按步骤1.1制备）转移至适当的带盖1.5 mL超速离心管中，以110,000 x g 4 °C下孵育90分钟。启动前务必确保转子负载平衡。
   3. 弃去上清液，将离心管倒置于纸巾上静置2分钟。用500 μL PBS重悬沉淀，于110,000 x g离心样品 g 4 °C 下孵育 90 分钟。
   4. 吸弃上清液，将沉淀重悬于50 μL PBS中。
      注意：仅使用专为所用超速离心机设计的转子和配件。使用水对转子中的离心管进行预测试，因为不同批次的离心管强度可能有所不同。

2. 样品染色

1. 使用 PKH67 对样品进行染色。
   1. 在 1.5 mL 反应管中，将 1 μL PKH67 乙醇染料溶液加入 50 μL 稀释液 C（试剂盒中提供）中，充分混匀，制备染色液。
   2. 将 10 μL 染色液加入含有 20 μL EV 悬液（按步骤 1.1 制备）的反应管中，充分混匀，并在室温避光孵育 5 分钟。
   3. 在 15 mL 反应管中，用 2.5 mL 蒸馏水稀释 50 μL 染色后的 EV 悬液，充分混匀，将此最终悬液用于颗粒计数。
      注意：必须使用水作为 EV 悬液的稀释液，因为其他稀释液（例如 PBS）可能影响测量结果。若使用储存的 EV 悬液，应在冰上解冻样品，并在染色前充分混匀。
2. 使用特异性抗体对样品进行染色。
   1. 在 1.5 mL 反应管中，将 10–20 μL EV 悬液（按步骤 1.1 制备）用 50 μL 蒸馏水稀释，充分混匀。
   2. 向反应管中加入 2.5–5 μL 特异性抗体（表 1），充分混匀，并在室温避光孵育 30 分钟。
   3. 在 15 mL 反应管中，将 50 μL 染色后的 EV 悬液转移至 2.5–10 mL 蒸馏水中（表 1），充分混匀，将此最终悬液用于颗粒计数。
      注意：在某些情况下，所用抗体的浓度需要调整（表 1）。

3. 样品处理

注意：本方法的基本原理此前已有详尽描述，以下方案重点介绍荧光标记EVs分析所需的具体步骤¹⁴。

1. 执行启动程序。
   1. 将荧光滤光片推入显微镜和相机的光路中。启动程序，并按照屏幕上的指示进行自动化操作。
   2. 在“细胞检测”选项卡（细胞定义）中选择正确的细胞编号（Z158_C1149_Fluor）以进行荧光测量。选择光学系统的参考位置，以确保激光与显微镜处于共同焦平面（激光和显微镜将自动移动至该位置）。
   3. 使用装有10 mL去离子水的注射器冲洗细胞通道。确保测量池中无气泡，并避免将气泡注入系统中。
   4. 制备含有表面带羧基的200 nm均一荧光标记聚苯乙烯颗粒的校准悬浮液。取10 μL颗粒溶液与990 μL去离子水混合稀释。然后取10 μL该颗粒溶液加入15 mL离心管中，再加入10 mL去离子水，以获得所需浓度。
   5. 向细胞通道中注入2.5 mL稀释后的颗粒溶液，点击“优化焦距”以调整相机。
2. 测量样品。
   1. 每次样品测量前，使用装有10 mL去离子水的注射器多次冲洗细胞通道。将染色后的EV悬浮液（步骤2中制备）注入细胞通道。
   2. 根据需要在软件的“细胞检测”选项卡中调整以下主要相机参数（表2）。使用参考位置或位置0.41193来调节参数。
      1. 关于灵敏度，点击“粒子数 vs. 灵敏度”按钮，显示不同灵敏度水平下每帧图像中检测到的粒子数量曲线，从而确定最佳灵敏度范围。
         注意：
      2. 关于快门，调节相机允许光线通过的时间周期。
      3. 关于后采集参数，设定最小亮度为20，最小粒径为20 nm，最大粒径为500 nm用于测量。
   3. 记录显示屏中视野内检测到的粒子数量。散射条应处于绿色至橙色范围（50–300个粒子）。若散射条呈红色，则散射光会导致单个粒子融合，被计为一个粒子，从而产生错误结果。此时应进一步稀释样品以避免粒子重叠，或降低灵敏度。
   4. 在开始测量前，点击“细胞检测”选项卡中的“在0 V下检查粒子漂移”。如果漂移速度高于5 μm/s，请等待样品流动停止后再继续测量。
      注意：若测量初期漂移过大，重复测量结果可能出现差异，使数据分析复杂化。根据NTA的基本原理，显著的漂移可能影响软件计算出的粒子尺寸。
   5. 点击“测量”选项卡中的“运行视频采集”。选择实验次数（3–5次）以及各次之间的延迟时间（0分钟）。
   6. 定义待分析粒子的（单个亚体积）位置数量（11个）以及每个测量位置的（测量）循环次数（10次）。
   7. 选择保存文件夹，创建新的文件名，然后点击“确定”开始测量。

4. 结果解读

1. 测量完成后，在“分析”选项卡中查看结果和参数。在清洗细胞通道前，需检查以下参数：每个位置的平均颗粒数、追踪到的颗粒总数及颗粒浓度、颗粒分布宽度（x10、x50 和 x90 值）、平均值及标准差。如有需要，可重复进行样品测量。
   注意：结果也会以 .pdf 或 .txt 文件格式保存。
2. 点击“分析”选项卡，查看测量后计算出的图表，该图表显示了检测到的颗粒按尺寸的分布情况。在“分析”选项卡中点击“显示”，并使用图标根据特定需求调整和更改图表设置。

5. 验证 通过 通过蛋白质印迹法检测EV

1. 将步骤1制备的EV沉淀溶解于RIPA裂解和提取缓冲液中，充分吹打混匀，冰上孵育30分钟。在4 °C下以8,000 × g离心10分钟以澄清裂解液，将上清液转移至新管中。
2. 使用Lowry蛋白检测试剂盒测定总蛋白浓度。取1 μL分离的EV悬液加入49 μL RIPA缓冲液稀释，分析时每份取5 μL，设三个重复。用2× Laemmli上样缓冲液将EV悬液稀释至终浓度为2 µg/μL，并在95 °C加热10分钟。
3. 每孔上样20 μg蛋白，按照标准操作流程通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白并进行槽式转膜。
4. 用5%脱脂牛奶粉溶液在室温下封闭膜（0.2 μm聚偏二氟乙烯膜）1小时，随后在4 °C下与特异性一抗（CD9、CD63和波形蛋白）孵育过夜。
   注意：一抗使用1:1,000的稀释比例。
5. 用TBST洗涤膜3次，每次5分钟，在室温下用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（按1:20,000比例溶于TBST）孵育60分钟。
6. 用TBST洗涤膜3次，每次5分钟，然后使用高灵敏度底物溶液通过化学发光法在成像系统上检测蛋白。
   注意：由于CD63抗原存在广泛且可变的糖基化修饰，其分子量可能有所变化，条带通常出现在40–65 kDa之间。

结果

从全血中分离出细胞外囊泡（EVs），并使用荧光试剂通过纳米颗粒追踪分析进行表征。在实验过程中，未染色颗粒检测的最佳灵敏度确定为70%。用于测量校准和调整的荧光微球在灵敏度为85%时表现出最佳设置（图2A）。在70%至90%的灵敏度之间，检测到的颗粒数量迅速增加，而进一步提高灵敏度则可能导致粒径分布恶化，颗粒数量重新下降。相机设置呈现出清晰的图像（图2B）且重复测量显示出较低的标准偏差（图2C）。因此，对EV样本的处理方案进行了调整，以确保所有测量均能在相同的设置下进行（表 2）。分布宽度由x轴上的三个值定义，即x10、x50和x90。x50又称中位粒径，是指有一半颗粒群体的粒径小于此值的直径。类似地，x10和x90分别表示有10%和90%被检测到的颗粒粒径小于此报告值的直径。使用PKH67细胞连接试剂盒（包含一种带有长链脂肪族尾部的绿色荧光染料，可嵌入细胞膜的脂质区域）进行染色，结果显示检测灵敏度与测得的颗粒数量之间存在显著相关性（图3A）。PKH67 常用于细胞增殖监测，但也被证明适用于外泌体或脂质体摄取的监测，以及 体内 细胞迁移。由于PKH67具有非特异性标记特性，可对多种细胞外囊泡（EVs）进行标记和检测。颗粒的分布范围介于266 nm（x10）至1946 nm（x90）之间，峰值最大值出现在857 nm（x50），各测量值之间的标准差较低（28.1 nm）。LAMP-1（又称溶酶体相关膜糖蛋白1）和CD107a主要定位于溶酶体膜上。使用Alexa Fluor 488标记的LAMP-1特异性抗体染色后，颗粒的分布范围为220 nm（x10）至1145 nm（x90），峰值最大值为541 nm（x50），标准差为11.7 nm。图3B）。为了表征细胞外囊泡（EVs），我们使用了针对常见外泌体标志物的Alexa Fluor 488标记抗体，并通过蛋白质印迹法验证了结果。使用Alexa Fluor 488标记的CD9抗体染色后，颗粒的分布范围为251 nm（x10）至1139 nm（x90），主峰位于548 nm，次小峰约在25 nm处图4A). 使用 Alexa Fluor 488 标记的 CD63 进行染色（图4B) 和波形蛋白（vimentin）图4C) 得到了相似的结果。Western印迹分析证实了本研究中所用抗体的阳性结果。重复测量显示，本报告中使用的所有抗体均具有可重复的结果。作为对照，我们使用相应的抗体对无囊泡的水进行了染色图5A），其中PKH67和LAMP1抗体几乎未检测到任何EV，灵敏度接近100%。以波形蛋白（vimentin）为例，高灵敏度会增加伪迹数量，即使样品中基本不含颗粒物。如果在漂移仍过高时即开始测量（> 5 µm/s），各次重复之间存在明显偏差（图5B）。如使用三种不同抗体所示，在开始测量前，漂移应尽可能小。根据我们的经验，使用异硫氰酸荧光素（FITC）作为荧光染料会导致测量结果不准确且不可重复，因为FITC容易发生快速光漂白图 5C）。因此，我们建议在细胞外囊泡（EV）表征中仅使用Alexa Fluor 488标记的抗体。在本方案中，EVs通过含有聚乙二醇的基于聚合物的外泌体沉淀溶液进行分离。为确保实验结果不受所用分离方法的干扰，我们采用超速离心法对EVs进行分离后表征。通过PKH67以及两种不同抗体（CD63和LAMP-1）的检测表明，使用外泌体沉淀溶液进行分离所获得的结果图6A）与分离得到的EVs相当 通过 超速离心图6B然而，由于超速离心后细胞外囊泡（EVs）的得率较低，因此与使用外泌体沉淀溶液进行分离相比，初始分离所需的血清量必须明显更多。

图1：纳米颗粒示踪分析的示意图装置。 显微镜/视频轴与激光束相互垂直，交汇于细胞通道的横截面处。在细胞通道与显微镜之间放置一个荧光滤光片。颗粒散射的光显示在软件的“实时预览”窗口中。采集完成后，结果以粒径分布曲线坐标系的形式呈现。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：使用荧光标记微球进行校准。（A）粒子数量 vs. 灵敏度曲线，显示在自动灵敏度扫描过程中某一时刻某一位置的粒子情况。（B）在实时观察屏幕上显示的粒子图像。（C）多次测量后的粒子粒径分布。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：使用PKH67和LAMP-1染色后的代表性结果。 颗粒数量 与 灵敏度曲线（1）、PKH67染色后在实时成像屏幕上的颗粒可视化（2）以及颗粒大小分布（3）A）和 LAMP-1（B观察到颗粒的粒径分布相似，而灵敏度设置的改变会导致检测到的颗粒发生相似但并非完全相同的变化。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图4：使用Alexa Fluor 488标记的CD9、CD63和波形蛋白染色后的代表性结果。 颗粒数量 与 灵敏度曲线（1）、实时观察屏幕上的颗粒可视化（2）、颗粒大小分布（3）以及两种不同EV悬液的代表性Western印迹（4），针对CD9（24–27 kDa， A），CD63（26 kDa， B），波形蛋白（54 kDa， C）。颗粒信号在灵敏度增加（x轴）过程中出现得越晚，表明Western blot分析中的信号强度越低，证实相应颗粒表面标志物的含量较低例如， 波形蛋白 与 CD63)。注意所有被分析标志物的代表性测量曲线几乎完全重合，表明具有高度可重复性（3）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图5：对照组的代表性结果及可能的误差来源。 (A) 以PKH67（1）、LAMP-1（2）和波形蛋白（vimentin）（3）染色的无囊泡水样对照。B) 分别使用LAMP-1（1）、CD63（2）和CD9（3）染色后具有代表性的颗粒大小分布，以及在悬浮液漂移仍过高时进行的测量结果。C颗粒数量 与 灵敏度曲线（1）及使用FITC标记的CD63抗体染色后的粒径分布（2）。每次测量后均观察到明显的漂白效应，导致颗粒数量逐渐减少。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 6：不同EVs分离方法的比较。 使用外泌体沉淀溶液（A）和超速离心法（B）分离的EVs在用PKH67（1）、LAMP-1（2）和CD63（3）染色后的粒径分布情况。请点击此处查看该图的放大版本。

	LAMP-1	CD9	CD63	波形蛋白
抗体（µL）	5	2.5-5	2.5-5	5
EV 悬液（µL）	10	20	10	10
H2O（µL）用于染色	50	50	50	50
终体积（mL）	5-10	2.5-5	5	10

表1：所用抗体及样品稀释倍数范围列表。

采集参数
灵敏度 (%)	85
快门	70
最小亮度	20
最大尺寸 (nm)	500
最小尺寸 (nm)	20
极性	负
电压	关闭
0 V 时的粒子漂移速度 (µm/s)	< 5
位置数	11
循环次数	10
多次采集	3-5
时间间隔 (min)	0

表2：纳米颗粒跟踪分析的采集参数。

讨论

我们展示了一种从全血中分离细胞外囊泡（EVs）并利用基于荧光纳米颗粒追踪分析技术快速表征其特定表面标志物的详细方案。在本研究中，所有实验均仅使用从血清样本中分离的EVs，但该方法同样适用于乙二胺四乙酸（EDTA）和枸橼酸盐抗凝血浆，并可扩展至其他体液，如尿液、乳汁、唾液、脑脊液和精液。此外，该方案也可调整用于细胞培养上清液中EVs的表征。在本方案中，EV悬液由100 μL血清通过外泌体沉淀试剂制备，该试剂含有专有聚合物，可依据30 nm至200 nm的颗粒尺寸温和沉淀外泌体及EVs，每种表面标志物的表征使用10–20 μL EV悬液。遗憾的是，分离步骤不可避免，因为血清样本中含有大量蛋白质，例如， 白蛋白和球蛋白会干扰抗体染色过程，导致背景信号升高和结果复杂化。此外，根据样品中外泌体的生物学可获得性，所使用的细胞外囊泡（EV）悬液的用量以及处理前的稀释比例必须针对其他来源材料进行相应调整。为了比较多个样本，需采用标准化的样本稀释方法，并保持一致的采集参数（灵敏度、快门） 等等。）是必要的。另一个重要之处在于，必须等到漂移降至较低水平后（在我们的实验中， < 5 μm/s）。如果漂移过高，对样品进行重复测量时，数据之间的标准差会显著增大；而漂移较低时，所得数据高度一致，表明实验具有良好的可重复性。所选用的抗体必须带有合适的荧光染料。抗体需与Alexa Fluor 488偶联，因为FITC具有较高的光漂白速率。未来使用可能更稳定的荧光染料，必将进一步提高检测的稳定性。通常情况下，许多研究人员使用PBS作为EV的稀释液s. 本方案中，使用蒸馏水作为细胞外囊泡（EV）悬液的稀释剂至关重要。当EVs用荧光染料标记时，其他稀释剂（如PBS）的高渗透压和离子浓度可能干扰检测，导致结果发生改变。

尽管在过去十年中细胞外囊泡（EVs）的分析方法已得到显著改进，但目前仍缺乏用于EVs分离与表征的标准化方法。s. 流式细胞术的主要缺点在于，外泌体通常需要结合微珠以提供更大的表面积，而许多外泌体会附着在表面，从而产生强而可检测的信号¹⁰扫描电镜和透射电镜的缺点在于样品制备耗时，且只能通过大小和形态来区分细胞外囊泡¹¹截至目前，最成熟且广泛应用的定性方法（即， 生化EV表征的常用方法是蛋白质印迹（Western blotting），该方法可使用特异性抗体对蛋白质进行分析^12,13然而，所有这些方法的缺点在于无法对单个细胞外囊泡（EV）的特异性表面标志物进行分析。此外，目前许多实验方案所需的长时间处理以及漫长的洗涤/分离流程包含大量耗时耗力的操作步骤，因而不适合高通量样本处理及单个EV的表征分析s.本方案提供了一套完整的操作流程，用于快速分离和表征具有特定表面标志物（如CD63、CD9、vimentin和CD107a）的单个EV，并可扩展应用于多种其他表面标志物，以确定所释放EV的来源s. 由于NTA设备的持续技术进步，我们与制造商合作，使用最新的分析仪验证了我们的研究结果。无论未来在细胞外囊泡（EV）生物学研究领域（特别是外泌体相关研究）取得何种进展，本文所呈现的方案都将为利用特异性标志物对单个EV进行表征提供一种快速且可靠的方法。由于在EV的分离和染色过程中其聚集现象至今尚无法避免，未来的研究应致力于开发防止EV聚集的方法，以实现对荧光标记EV的精确尺寸测定。s.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
血清分离管	BD	366882	BD Vacutainer
Ampuwa 水	Fresenius Kabi	10060
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's phosphate-buffered saline）	Sigma	56064C
15 mL Falcon 管	Greiner Bio One	188271
50 mL Falcon 管	Greiner Bio One	227270
1.5 mL 微量离心管	Eppendorf	30120086	超速离心专用管
带卡扣盖的 1.5 mL 管	Beckman Coulter	357448
Polybeads 微球 0.2 µm	Polysciences, Inc.	7304	校准溶液
Fluoresbrite YG 羧基微球 0.2 µm	Polysciences, Inc.	09834-10	校准溶液
2 mL 注射器	Braun	4606027V
10 mL 注射器	Braun	4606728V
Exoquick	SBI	EXOQ20A-1	细胞外囊泡沉淀溶液
Laemmli 样品缓冲液（2x）	BioRad	1610737
DC 蛋白定量试剂盒 II	BioRad	5000112	Lowry 蛋白测定法
PKH67 绿色荧光细胞连接试剂盒	Sigma	PKH67GL-1KT	用于通用膜标记
Alexa Fluor 488 抗人 CD107a 抗体	BioLegend	328609	溶酶体相关膜蛋白-1（LAMP-1）
人 CD9-Alexa Fluor 488	R&D Systems	FAB1880G
抗 CD9 抗体	SBI	EXOAB-CD9A-1
CD63-Alexa Fluor 488	ThermoFisher	MA5-18149
FITC 抗人 CD63 抗体	BioLegend	353005
CD63 抗体，多克隆	SantaCruz	Sc-15363
Alexa Fluor 488 抗波形蛋白抗体	BioLegend	677809
抗波形蛋白抗体	SBI	EXOAB-VMTN-1
山羊抗小鼠 IgG + IgM	Jackson Immuno	315-035-048
山羊抗兔 IgG	Dianova	111-035-003
SuperSignal West Femto 高灵敏度底物	ThermoFisher	34094
ZetaView	Particle Metrix	PMX 100, Type
离心机	Eppendorf	5804R
超速离心机	Beckman Coulter	Optima MAX-XP
化学发光成像仪	GE Healthcare	Amersham Imager 600