定量免疫印迹法检测细胞系作为常规组织样本中生物标志物蛋白定量免疫荧光验证的标准

摘要

我们描述了使用定量免疫印迹法来验证免疫荧光组织学结合图像分析的方法，以定量福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织样本中目标蛋白的含量。我们的结果证明了免疫荧光组织学在确定常规活检样本中生物标志物蛋白相对含量方面的实用性。

摘要

在福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织样本中对目标蛋白进行定量分析，在临床和科研应用中具有重要意义。理想的定量方法应具备高准确性、宽广的线性动态范围，并能保持样本的结构完整性，以便识别不同类型的单个细胞。目前常用的方法，如免疫组织化学（IHC）、质谱分析和免疫印迹，由于其结果为分类式判断或需要将样本均质化处理，均无法完全满足上述要求。作为替代方案，我们提出采用免疫荧光（IF）结合图像分析技术，用于测定FFPE组织中目标蛋白的相对丰度。本文证明，该方法易于优化，具有较宽的动态范围，并且与定量免疫印迹这一金标准相比，具备线性可量化的优势。此外，该方法能够保持样本的结构完整性，允许区分多种细胞类型，这在诊断应用中可能至关重要。总体而言，这是一种针对FFPE样本中蛋白相对定量的稳健方法，可轻松调整以适应临床或科研需求。

引言

在许多临床领域中，存在对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织活检样本中蛋白质进行定量的需求。例如，在常规活检标本中对生物标志物蛋白质进行定量，可用于阐明癌症患者的预后并指导治疗方案¹。然而，目前的方法通常具有主观性，且缺乏验证。

免疫组织化学（IHC）在病理学实验室中常规使用，通常依赖于针对目标蛋白的一抗以及与酶标记（如辣根过氧化物酶）偶联的二抗²。传统的IHC灵敏度高，可利用微量样本，并能保持组织样本的形态完整性，从而允许在相应的组织学背景下评估蛋白表达。然而，由于IHC产生的显色信号是减法型的，其动态范围相对较窄，多重检测潜力有限^2,3,4。基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI）能够保持形态完整性，但该新兴技术的形态分辨率较低，且需要大量校准和归一化处理，限制了其在常规临床应用中的可行性^5,6,7。其他用于定量组织样本中蛋白的技术包括免疫印迹⁸、质谱^9,10,11和酶联免疫吸附测定（ELISA）¹²，这些方法均以组织样本的匀浆裂解液为起始材料。原始组织样本具有异质性，包含多种细胞类型。因此，需要对样本进行匀浆处理的技术无法实现对特定细胞群体（如癌细胞）中蛋白的定量分析。

与免疫组化（IHC）类似，免疫荧光（IF）适用于小型福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本，并可保持组织学完整性¹³然而，由于荧光信号具有可叠加性，免疫荧光技术适用于多种一抗和荧光标记的联合应用。因此，可在特定细胞或细胞区室（例如细胞核）内对目标蛋白进行相对定量 与 细胞质）通过其他抗体进行界定。荧光信号还具有更宽动态范围的优势^13,14在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中应用免疫荧光技术的优越性、可重复性及多重检测潜力已得到证实^13,14,15.

本文描述了利用已建立的细胞系作为金标准，通过定量免疫印迹法来验证免疫荧光结合计算机辅助图像分析在测定福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本切片中目标蛋白相对丰度时的定量特性。我们已成功将该方法应用于多重检测策略，以定量临床活检样本中的生物标志物蛋白^16,17,18。

方案

已获得女王大学健康科学及附属教学医院研究伦理委员会（HSREB）的批准，用于使用原代人体组织样本。

1. 构建细胞系组织芯片（TMA）

1. 收集并洗涤细胞。
   注意：本方案已在多种已建立的永生化细胞系上进行过测试（例如 HeLa、Jurkat、RCH-ACV
   1. 对于贴壁细胞，收获约 1.3 x 10⁷ 当细胞融合度达到约80%时进行传代。使用适用于该细胞系的试剂消化细胞。
      注意：通常优先使用乙二胺四乙酸（EDTA）而非胰蛋白酶，以降低表面蛋白降解的风险。如果使用胰蛋白酶，收集细胞后应立即使用胎牛血清（FBS）中和胰蛋白酶。
   2. 对于悬浮细胞，收集约 8 x 10⁷ 对数生长期的细胞
   3. 在50 mL锥形管中以225 × g离心5分钟，收集收获/脱落的细胞。
   4. 弃去上清液，将沉淀重悬于10 mL 1X缓冲液中 磷酸盐缓冲液（PBS）。在225 × g下离心5分钟，弃去上清液。
      注意：1× PBS 由 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄，1.8 mM KH₂PO₄ 在蒸馏水中；调节pH至7.4。
2. 用甲醛固定细胞并离心收集沉淀。
   1. 将锥形管中的细胞沉淀重悬于10 mL 10%中性缓冲福尔马林（NBF）中。
      注意：NBF 可通过将 1 mL 37% 甲醛储备液加入 9 mL 1× PBS 中稀释制备。
      警告：处理甲醛和福尔马林时需谨慎。涉及福尔马林和甲醛的操作步骤应在通风橱中进行。
   2. 将细胞在室温下置于摇床中，以24 rpm转速孵育过夜（约17小时）。
   3. 在 PBS 中制备 1% 的低熔点琼脂糖溶液（每 1 mL PBS 中加入 0.01 g 琼脂糖）。
      1. 每种细胞系样品准备 500 µL 琼脂糖溶液。
      2. 在80 °C水浴或加热块中溶解琼脂糖，间歇混匀，持续2-5分钟。溶解后，将溶液置于37 °C水浴或加热块中，以防止凝固。
   4. 将步骤1.2.2中固定的细胞在225 × g离心5分钟以沉淀细胞。弃去上清液，并将细胞重悬于500 µL的1×PBS中。
   5. 将细胞转移至1.5 mL微量离心管中，在290 × g条件下离心5分钟以收集细胞沉淀。吸除全部上清液。
3. 将细胞包埋于琼脂糖中。
   1. 向每支含有细胞的离心管中加入约 500 µL 的 1% 琼脂糖溶液（来自步骤 1.2.3）。使用 P-1000 微量移液器轻轻但迅速地上下吹打混合液，以充分混匀。
      注意：剪掉移液器吸头末端以扩大开口，避免产生气泡。将工作浓度的琼脂糖溶液置于37 °C水浴中保温，防止凝固。
   2. 让琼脂糖-细胞溶液在室温下凝固（5–10 分钟）。向每支含有样品的微量离心管中加入 1 mL 10% NBF，于室温保存至进行石蜡包埋（最长 24 小时）。
4. 为石蜡包埋制备琼脂糖凝胶块。
   1. 吸除样品中的NBF。
   2. 使用剃刀片切割微量离心管以取出细胞塞，将细胞塞放入 塑料组织包埋盒。将包埋盒置于10% NBF中，室温保存。
5. 过夜手动或使用自动组织处理机处理样本，并采用标准组织学方法将样本包埋于石蜡中。
   注意：参见 Fischer 等.¹⁹ 示例实验方案。
6. 使用一种专用的 "组织芯片仪" 仪器，从每种细胞系的石蜡包埋块中平行获取两份0.6 mm的组织芯，并按行插入空的受体石蜡块中，以构建细胞系组织芯片（TMA）。
   注意：应采用标准方法，例如 Fedor 和 De Marzo 所描述的方法²⁰.
7. 纳入代表另外2-3种组织类型的原代样本的组织芯例如， 扁桃体、结肠、睾丸 等等。) 作为阳性或阴性对照加入到组织芯片（TMA）中。选择适合目标蛋白的组织。
8. 使用切片机对细胞系TMA制备两片组织学切片，厚度约为4至6 µm。将切片贴附于组织学载玻片上，干燥后进行脱蜡处理（方法见Fedor和De Marzo所述）²⁰).

2. 免疫荧光染色样本

1. 优化一抗的稀释比例。
   注意：针对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片的免疫组化（IHC）或免疫荧光（IF）优化，已有标准操作流程，例如 Kajimura 中所述 等²¹此处概述了该方法的简要流程。
   1. 准备4-5 根据制造商说明书，用一抗对目标蛋白进行稀释。
   2. 从动物或人体来源中选取一种表达目标蛋白且具有形态学上可识别细胞群体的对照组织类型。按照标准免疫组织化学实验流程（如 Fedor 和 De Marzo 所述）制备该组织的切片，并将其贴附于载玻片上。²⁰.
      注意：所需切片数量为一抗稀释液种类数加一。
   3. 使用自动或手动免疫组织化学系统，将步骤 2.1.1 中的每种一抗稀释液分别应用于步骤 2.1.2 中的一张切片。在额外的一张切片中省略一抗的孵育，作为空白对照。
   4. 在染色过程中，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对所有载玻片进行染色，作为细胞核复染剂 荧光标记的二抗。如果需要更高的灵敏度，可使用辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗及基于酪酰胺的信号放大系统（参见 Stack 等¹³).
      注意：进行多重一抗孵育时，每种蛋白质需使用不同的荧光标记。
   5. 使用能够生成数字图像文件的适当仪器扫描免疫染色切片，所用激发波长和检测波长应与所使用的荧光染料相匹配。
   6. 使用适当的软件查看数字图像，并根据背景荧光情况经验性地选择可使信号强度相对于背景达到最佳的初级抗体稀释比例。
      注意： 如有需要，可使用HRP标记的二抗、3,3’-二氨基联苯胺（DAB）和明场显微镜进行此优化。
2. 对细胞系TMA进行免疫荧光染色。
   1. 使用自动或手动免疫组织化学系统，用已优化的一抗稀释度（根据步骤2.1确定）对细胞系TMA切片进行染色。第二张切片省略一抗孵育步骤，作为空白对照。
   2. 染色过程中，所有载玻片均使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行细胞核复染，并按照步骤2.1.4使用二抗和酪胺。
   3. 使用能够生成数字图像文件的适当仪器扫描免疫染色切片，所用激发波长和检测波长应与所使用的荧光染料相匹配。
   4. 使用图像分析软件包识别目标细胞区室（即， 细胞质 与 细胞核）并量化每种细胞系的平均荧光强度（MFI）。
      注意：可用于此目的的软件包有多种，其中许多在 Stack 中有讨论 等¹³.

3. 细胞系的定量免疫印迹

1. 制备细胞裂解液。
   1. 按照步骤1.1.1至1.1.3所述，收集每种细胞系200万个细胞。
   2. 在50 mL离心管中以650 × g离心5分钟，沉淀细胞。弃去上清液。
   3. 用10 mL预冷的PBS洗涤细胞，加入1 mL预冷的PBS重悬，转移至1.5 mL微量离心管中。按步骤3.1.2进行离心，弃上清，将细胞置于冰上。
   4. 加入约 200 µL 含蛋白酶抑制剂的冷放射免疫沉淀（RIPA）裂解缓冲液（10 µL 100X） 每毫升 RIPA 裂解缓冲液中加入抑制剂，涡旋混匀，冰上孵育 15 分钟。
      注意：不同细胞系有效裂解所需的裂解缓冲液体积有所不同，需通过实验确定。RIPA缓冲液的成分为150 mM NaCl、5 mM EDTA、50 mM Tris、1.0% NP-40、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS，溶于蒸馏水中。
   5. 为确保免疫印迹上样量相对均匀，使用适当方法（如Bradford法）对每种裂解液中20 µL样品的总蛋白进行定量。加入约40 µL的6X 拉emmli 向每份细胞裂解液的剩余部分（约180 µL）加入裂解缓冲液，在金属浴或水浴中于100 °C煮沸5分钟。
      注意：6X Laemmli缓冲液由300 mM Tris-HCl（pH 6.8）、4%（w/v）SDS、60%甘油、0.6%（w/v）溴酚蓝和50 mM二硫苏糖醇（DTT）溶于蒸馏水中配制而成。
   6. 将样品在 -20 °C 下保存最多两周。
2. 对所有细胞系进行免疫印迹实验，以确定哪种细胞系中目标蛋白的表达量最丰富。
   注意：请遵循 Mahmood, T. 和 Yang, PC. 描述的实验步骤。²²，作如下修改。
   1. 将含有10–50 µg蛋白质（根据目标蛋白的丰度确定）的细胞裂解液（步骤3.1中制备）分装至微量离心管中。加入2.5 µL 6X Laemmli缓冲液和足量RIPA裂解缓冲液，使总体积达到15 µL。
   2. 加载5%的浓缩胶和适当浓度的分离胶（例如，15-100 kDa 蛋白使用10% SDS-PAGE 凝胶，同时加入蛋白 Marker 和 3.2.1 步骤的样品。在空胶孔中加入 1× Laemmli 缓冲液。将电泳仪调至适当电压（通常为 125 V），电泳 80 分钟，或直至溴酚蓝染料迁移至凝胶底部。
   3. 按照 Wiedemann 所述的方法进行半干法蛋白质转印 等²³.
      注意：在代表性结果中，使用了无需在甲醇中浸泡的硝酸纤维素膜以及冷的比耶鲁姆-舍费尔-尼尔森（BSN）转移缓冲液。BSN缓冲液由48 mM Tris、39 mM 甘氨酸、20% 甲醇溶于蒸馏水中组成。
   4. 转膜后，使用剃须刀片将膜水平切割，以分离含有目标蛋白的部分和含有适当内参蛋白（如GAPDH）的部分。
   5. 使用一抗生产商推荐的封闭缓冲液进行封闭及抗体孵育步骤。
      注意：最佳一抗稀释比例可能因蛋白丰度和检测灵敏度而有很大差异。以下代表性结果中，目的蛋白的一抗稀释比例为1:1,000，而GAPDH内参对照的一抗稀释比例为1:40,000。二抗的稀释比例为1:3,000。
   6. 在抗体孵育并洗涤膜后，将膜条置于透明塑料袋（如三明治袋）中。
   7. 按照制造商说明书配制增强型化学发光（ECL）混合液。使用P-1000移液器将ECL混合液均匀覆盖膜表面，封闭膜夹，于室温避光孵育膜条1–2分钟。
   8. 将膜套管置于数字成像平台中。利用化学发光和比色标记检测法获取膜的多组曝光图像。
      注意：曝光时间将根据上样蛋白量、目标蛋白的丰度以及抗体亲和力的不同而有所变化 等。 从自动曝光开始（通常为几秒），并在其上下范围内以几秒为增量测试不同的曝光时间。
   9. 通过实验经验或使用图像分析软件，确定哪种细胞系表达的目标蛋白最多。
3. 使用梯度稀释法确定每种一抗的线性动态范围。
   1. 使用在步骤 3.2.9 中确定的表达目标蛋白浓度最高的细胞系，进行一系列连续稀释，并据此执行步骤 3.2.1–3.2.8。
   2. 使用 ImageJ 等图像分析软件对曝光图像进行密度测定。
      1. 例如，使用 ImageJ，采用 矩形选择 用于选择凝胶中第一条泳道以进行定量。前往 分析| 凝胶| 选择第一泳道. 使用鼠标将生成的矩形移动到下一个泳道。转到 分析| 凝胶| 选择下一个泳道重复将矩形移至下一泳道，并为其余泳道依次选择对应的区域。
      2. 前往 分析| 凝胶| 绘制泳道. 使用 直线 用于在各峰基部绘制线条以去除背景噪声的工具。使用该工具 魔棒 用于选择每个峰，并采集各峰的密度值，此后称为条带强度，自 结果 窗口
   3. 利用密度测定结果绘制条带强度的散点图 与 每种一抗所加载的总蛋白量。通过最佳拟合线及视觉检查，确定每种抗体线性动态范围的位置（强度范围）。
   4. 选择一个在标准曲线线性范围较高一端产生信号值的蛋白浓度，并在所有细胞系中统一使用该浓度。
      注意：由于该浓度低于表达该蛋白最多的细胞系中的饱和水平，因此其他细胞系的条带应无过度曝光的风险。
4. 使用步骤 3.3.4 中选定的蛋白浓度对所有细胞系进行免疫印迹，并重复步骤 3.2.1–3.2.8。
   1. 按照步骤对数字扫描图像进行密度测定 3.3.2. 选择在步骤 3.3.3 中确定的每种抗体的线性范围内产生信号的曝光图像。
   2. 根据3.4.1中理想曝光所得的条带强度信号，计算每种细胞系中目标蛋白条带强度与上样对照条带强度的比值。这些比值反映了目标蛋白的相对丰度。
   3. 使用统计软件包进行皮尔逊相关性检验，将免疫荧光染色图像分析所得结果（步骤 2.2）与免疫印迹结果（步骤 3.4.2）进行相关性分析。

结果

本方案用于验证免疫荧光法（IF）检测经包埋成FFPE组织块的细胞系中抗凋亡蛋白Bcl-2相对含量的能力。在癌细胞中选择性定量Bcl-2有助于阐明致癌机制，并可用于病理诊断及指导临床管理决策²⁴。更具体而言，Bcl-2在B淋巴细胞的正常发育过程中发挥重要作用，其表达水平常在淋巴瘤研究背景下被检测^25,26,27。图1概述了本方案所涉及的步骤。在初始的免疫荧光优化步骤中，使用自动化免疫组织化学染色仪，按照步骤2.1所述方法，在人扁桃体组织上测试了不同稀释倍数的一抗抗Bcl-2抗体。图2展示了经不同抗体稀释度处理后的人扁桃体组织切片染色并扫描得到的图像。可以看出，1:50为最佳稀释度，可产生强信号且背景荧光较低。随后按照步骤2....

讨论

我们描述了一种利用定量免疫印迹（IB）的方法，以证明免疫荧光（IF）在确定福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中目标蛋白相对丰度方面的实用性。目前的蛋白质定量方法受限于其分类学特性，例如显色免疫组化^2,3，或需要将样本均质化，从而无法对样本结构和细胞群体进行研究，例如免疫印迹和质谱分析^8,9,10,11。如果方法经过验证并谨慎应用，定量IF可克服这些局限性。通过将IF检测结果与永生化细胞系的定量iIF进行比较，我们验证了IF方法的半定量性质。

来自患者或实验动物的原代组织样本具有异质性，其中包含多种细胞类型。在多重免疫荧光（IF）中应用多种一抗，可实现对特定细胞类型或细胞区室中一种或多种目标蛋白的定量分析

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
697	DSMZ	ACC 42	细胞系
JeKo-1	ATCC	CRL-3006	细胞系
Jurkat	ATCC	TIB-152	细胞系
RCH-ACV	DSMZ	ACC 548	细胞系
Granta-519	DSMZ	ACC 342	细胞系
REH	DSMZ	ACC 22	细胞系
Raji	ATCC	CCL-86	细胞系
HeLa	ATCC	CCL-2	细胞系
胰蛋白酶/EDTA 溶液	Invitrogen	R001100	用于解离贴壁细胞
胎牛血清（FBS）	Wisent Inc.	81150	用于中和胰蛋白酶
中性缓冲福尔马林	Protocol	245-684	用于固定细胞沉淀
UltraPure 低熔点琼脂糖	Invitrogen	15517-022	用于包埋细胞沉淀
小鼠单克隆抗人 Bcl-2 抗体，克隆 124	Dako (Agilent)	货号: M088729-2, RRID: 2064429	用于免疫荧光和免疫印迹检测 Bcl-2（批号#: 00095786
Ventana Discovery XT	Roche	-	用于免疫荧光染色的自动化
EnVision+ 系统 - HRP 标记聚合物（抗小鼠）	Dako (Agilent)	K4000	用于免疫荧光信号放大
EnVision+ 系统 - HRP 标记聚合物（抗兔）	Dako (Agilent)	K4002	用于免疫荧光信号放大
Cy5 酪胺试剂	Perkin Elmer	NEL745001KT	用于免疫荧光信号放大
Aperio ImageScope	Leica Biosystems	-	用于查看扫描的切片图像
HALO 图像分析软件	Indica Labs	-	用于免疫荧光定量分析
蛋白酶抑制剂（Halt 蛋白酶抑制剂混合物，100X）	Thermo Scientific	1862209	用于添加至 RIPA 缓冲液
乙二胺四乙酸（EDTA）	BioShop	EDT001	用于 RIPA 缓冲液
NP-40	BDH Limited	56009	用于 RIPA 缓冲液
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D6750	用于 RIPA 缓冲液
甘油	FisherBiotech	BP229	用于 Laemmli 缓冲液
溴酚蓝	BioShop	BRO777	用于 Laemmli 缓冲液
二硫苏糖醇（DTT）	Bio-Rad	161-0611	用于 Laemmli 缓冲液
牛血清白蛋白（BSA）	BioShop	ALB001	用于免疫印迹洗涤
蛋白分子量标准（Precision Plus Protein Dual Color Standards）	Bio-Rad	161-0374	用于蛋白凝胶电泳
滤纸（加厚印迹纸）	Bio-Rad	1703969	用于印迹转膜
硝酸纤维素膜	Bio-Rad	162-0115	用于印迹转膜
Trans-blot SD 半干式转膜仪	Bio-Rad	1703940	用于半干式转膜
脱脂奶粉（无脂干奶）	Cell Signaling Technology	9999S	用于封闭缓冲液
Tween 20	BioShop	TWN510	用于洗涤缓冲液
GAPDH 兔单克隆抗体	Epitomics	2251-1	内参蛋白的一抗（批号#: YE101901C）
山羊抗小鼠 IgG（HRP 标记）抗体	abcam	货号: ab6789, RRID: AB_955439	免疫印迹二抗
山羊抗兔 IgG（HRP 标记）抗体	abcam	货号: ab6721, RRID: AB_955447	免疫印迹二抗（批号#: GR3192725-5）
Clarity Western ECL 显色底物	Bio-Rad	1705060	用于免疫印迹信号检测
Amersham Imager 600	GE Healthcare Life Sciences	29083461	用于免疫印迹信号检测
ImageJ 软件	免费软件，NIH	-	用于密度分析