小鼠结肠吻合术的建立

摘要

术后吻合口漏或吻合失败是导致术后发病率和死亡率升高的主要原因。我们建立结肠吻合的手术方法是一种可靠且可重复的研究吻合口愈合机制的方法。

摘要

肠道吻合术在择期和急诊手术中均常被实施。然而，吻合口漏是结肠手术中令人高度担忧的并发症，可发生于高达26%的外科吻合术中，发生吻合口漏的患者死亡率可达39%。目前，关于吻合口愈合的细胞机制，仍缺乏详细的数据。若能更深入地理解吻合口正常愈合的过程，将有望显著促进针对吻合口漏的预防策略和治疗手段的开发。

小鼠模型是理想的选择，因为先前的研究表明，与其他动物模型相比，小鼠的吻合术在临床上与人类情况最为相似。我们提供一种易于重复的小鼠结肠吻合模型，可用于进一步阐明吻合口愈合过程。

引言

肠道手术吻合的严重并发症之一是吻合口破裂或渗漏。吻合口渗漏可导致肠腔内容物溢入腹腔，危及生命，并可迅速引发腹腔内脓毒症；小肠吻合术后吻合口漏的发生率在0.3%至5.5%之间，结肠吻合术后则上升至0.5%至26%^1,2。由于腹腔污染后脓毒症发生迅速且病情快速进展至死亡，渗漏后的死亡率可高达39%³。目前的预防策略和治疗方法仍基于尚未完全阐明的病理生理机制。

目前，吻合口愈合常被与研究更为广泛的皮肤伤口愈合相比较，但后者被证明是一个相对不理想的模拟模型。愈合过程包括一系列重叠的阶段，始于最初的滞后期。在肠吻合术后0至4天内，滞后期表现为急性炎症反应，清除伤口中的细胞碎片。接下来，在术后第3至4天，成纤维细胞增殖及胶原蛋白生成标志着纤维增生期（fibrophasia phase）的开始。最后，自第10天起，进入持续较长时间的胶原重塑阶段，称为成熟期（maturation phase）。需要特别注意的是，吻合口的强度在早期非常低，在胶原沉积完成之前，其强度依赖于手术缝合钉或缝线提供的外部支撑⁴。深入了解肠壁各层在吻合口愈合过程中的作用与时间规律，炎症介导的细胞类型（如巨噬细胞）的参与，以及明确可用于预测吻合口成功或失败的替代标志物，有望显著降低结肠手术后的发病率、死亡率以及医疗支出⁵。

既往研究已表明，小鼠模型在模拟人类吻合术方面具有重要价值⁶。尽管目前已有广泛应用、经过验证且研究充分的小鼠结肠吻合模型，尤其是Komen et al.⁷所描述的方法，但这些模型主要倾向于采用回盲部或升结肠结肠吻合技术⁸。既往对人类患者的研究表明，回盲部、结肠-结肠及结直肠吻合术之间的吻合口漏发生率存在显著差异，凸显了在不同解剖位置建立更多实验模型的必要性。此外，一些常用的方法旨在构建一种有意造成吻合口漏的模型，而非阐明正常吻合口愈合所必需的细胞机制⁹。大鼠模型虽曾被尝试使用，但其吻合口裂开率和/或漏出征象（即，脓肿形成）的发生率明显低于人类和小鼠^6,7。此外，相较于大鼠，目前可用的基因修饰实验小鼠品系更为丰富，这使得大鼠模型在吻合研究中的应用价值较低。同时，猪和犬类模型在临床研究方面的探索也少于小鼠模型^6,7。

我们提出一种安全、技术简单且易于快速重复的方法，用于在小鼠模型中建立结肠吻合口，该方法将有助于进一步研究目前报道不足的吻合口伤口愈合机制¹⁰。

方案

本方案已获得俄克拉荷马大学健康科学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，并符合所有关于实验动物使用的机构伦理准则。此外，所有实验均遵循机构、州及联邦有关实验动物研究的法规进行。

注意：本实验方案使用了12至72周龄的雌性和雄性同源近交C57BL6/J小鼠。所有用于本实验的小鼠在手术前均在非屏障设施中饲养至少一周，以适应当地微生物环境。小鼠可自由进食直至手术前，且在手术前未进行口服机械性肠道准备或直肠冲洗。

1）吻合口的建立

1. 高压灭菌手术器械，预热生理盐水灌洗液，并用70%乙醇彻底清洁所有手术操作表面。
2. 将小鼠放入与麻醉蒸发器相连的诱导室中以诱导麻醉。以1-2 L/min的流量输送2-3%异氟烷，直至小鼠进入镇静状态。
3. 将动物置于加热装置（如加热垫）上，以防止低体温。
4. 皮下注射单次剂量0.1 mg/kg的丁丙诺啡（30 g小鼠注射3 µg）用于术后镇痛，以及单次剂量10 mg/kg的恩诺沙星用于术前抗生素预防。
   注意：尽管本手术无需常规使用术前和术后抗生素，但根据本机构的指南以及动物护理与使用委员会的建议，本机构设施内推荐使用。
5. 将麻醉鼻罩罩住小鼠的口鼻。在整个手术过程中，密切监测动物的呼吸频率，并根据需要调整麻醉气体流速。维持呼吸频率在每分钟30-40次。
6. 使用毛发修剪器，再配合脱毛剂，去除腹部皮肤表面的全部毛发。用浸有水或70%乙醇的纱布彻底清除脱毛剂。将动物彻底擦干。
7. 在准备腹部手术前，用胶带将小鼠四肢固定在加热垫或手术台面的末端，以防止小鼠在手术过程中移动。使用氯己定对腹部进行消毒，消毒范围应包括整个剃毛区域以及剃毛区域边缘的毛发。将无菌手术巾覆盖于小鼠体表图1A).
   1. 在铺巾前，于铺巾上剪开一个较小的椭圆形或矩形窗口，以暴露已消毒的腹部区域。
      注意：窗口应暴露小鼠的整个腹部，但覆盖其四肢、尾巴、头部和胸部。我们裁剪一个 4 x 3 cm 的开口² 我们操作的时间窗口（图1B).
   2. 沿铺巾中线从底边向卵圆形或矩形窗口做一小切口，以便术中接触直肠图1C).
8. 在下腹部正中线处做皮肤切口，用剪刀沿腹中线垂直向上剪至剑突。仅切开皮肤，避免损伤腹壁肌肉组织。图2A).
9. 用镊子夹住腹壁正中线并提起，使其远离腹腔内容物。注意避免损伤腹腔内结构，用锐利的剪刀沿正中线腹筋膜垂直剪开。延长皮肤切口的长度。图2B).
10. 当暴露肠管时，找到盲肠和小肠，将左侧内脏向内侧旋转，以暴露降结肠和乙状结肠。将钝性探针尖端涂上润滑胶，小心地将探针插入直肠，以帮助识别降结肠和乙状结肠。图3).
    注意：与人类不同，小鼠的盲肠通常位于腹腔左上象限。此步骤中需注意避免探针刺穿肠壁。若发生肠壁穿孔，应立即终止操作并对小鼠实施安乐死。
    1. 避免使用有齿或尖锐的镊子夹持盲肠。应使用无创镊、棉签或轻柔的手指操作来旋转内脏。
    2. 使用温热的无菌生理盐水确保暴露的肠管在整个手术过程中保持湿润。
    3. 结肠位于中线左侧，并附着于腹膜后。 通过 肠系膜。确认后，部分撤出钝性探针，以便进行结肠切开术。
11. 进行乙状结肠横行切开术。
    1. 用无创镊子轻轻夹住骨盆入口上方的乙状结肠（图4A).
    2. 使用锋利的显微剪刀，在乙状结肠上做一垂直于肠管走向的切口，切口长度应贯穿结肠宽度的80–90%。该操作有助于防止结肠一端回缩至手术视野外，并便于后续修复。图4B).
    3. 如果在内脏旋转或结肠切开过程中损伤了肠系膜血管，可用纱布或棉签轻轻按压出血部位，持续时间最长达2分钟。若按压2分钟后出血仍持续，应在出血点周围缝合一针8-0单股缝线，采用“8”字缝合法。
       注意：如果肠道在此之后出现坏死或损伤迹象，应终止操作，并采用经本机构动物使用委员会批准的人道方法处死小鼠。
12. 缝合乙状结肠切口。
    1. 使用Castroviejo持针器，以5-6针8-0不可吸收聚丙烯间断单纯缝线修复结肠造口。缝线间距1 mm，进针深度0.5 mm。
       1. 注意缝合时每针应稍多取浆膜侧组织，少取黏膜侧组织，以避免肠管边缘卷入修补处。线尾留5 mm长。注意避免缝合时意外缝到周围肠管组织。图 4C).
          注意：缝合应从结肠切口靠近肠系膜缘处开始，将距肠系膜最远的部分留到最后缝合。
       2. 随着修补术的进行，在放置最后几针缝线之前，推进经肛门的钝头解剖探针以跨越修补部位。这有助于防止修补过窄，并降低吻合口狭窄的发生率。
13. 使用一个装有温热生理盐水的10 mL注射器，反复冲洗腹腔数次。若小鼠下方的表面被浸湿，应及时擦干小鼠或将其转移至干燥表面，以避免低体温。
    1. 使用无菌纱布覆盖切口以吸收多余的灌洗液。
    2. 在最后一次灌洗时，用无菌生理盐水充满腹腔。将一支润滑过的18 G套管针小心插入直肠，并注入0.5–1 cm的液体使其膨胀。³ 气流。这将有助于发现吻合口是否存在漏气，如有漏气，可使用无菌探针跨越吻合口，并以另一根间断的聚丙烯缝线进行修补。
    3. 移除前使用套管针放空结肠内的气体。
14. 确保无活动性出血。若有出血，直接在出血部位施加轻柔压力，持续1-2分钟。如出血仍持续，按上述方法放置止血缝线。
15. 轻柔地将内移的内脏恢复至其正常的解剖位置（图5A).
16. 关闭腹部切口（图5B).
    1. 使用4-0可吸收编织缝线，从切口顶端开始沿腹壁肌层进行连续缝合，至切口下端结束。打结后剪断缝线，留5 mm线尾。
       注意：缝合腹壁时切勿将肠管误缝入内。
    2. 使用4-0单丝缝线间断缝合皮肤图5C).
17. 确保整个动物温暖且干燥，以防止术后低体温。
18. 密切监测动物从麻醉中恢复的情况。术后为控制疼痛，每72小时给予0.1 mg/kg的丁丙诺啡，持续2-3天。  在恢复期间，应每天仔细检查小鼠是否有脓肿或腹膜败血症的迹象。  术后对疼痛和痛苦的观察应包括：活动受限（如弓背姿势）、不进食或不饮水、 grooming 行为异常、伤口周围过度炎症、切口部位未正常愈合，或筑巢行为异常。  任何出现上述行为的动物应立即通过CO实施安乐死₂ 至少窒息10分钟 随后进行双侧开胸术。
19. 术后将0.1 mg/mL的恩诺沙星与小鼠饮用水混合，连续使用7天，以预防因手术相关粪便污染导致的腹腔内感染或败血症。

2）采集吻合组织

1. 在切除吻合组织之前，使用经机构动物使用委员会批准的人道方法处死小鼠。
   注意：根据机构政策，我们通过将小鼠置于二氧化碳室中，以每分钟2升的速度通入100%二氧化碳气体，持续5分钟，随后行双侧开胸术来实施安乐死。
2. 用氯己定对腹部进行消毒，随后使用70%乙醇。
3. 使用锐利剪刀重新切开原有的正中切口。从先前切口的下极开始，向上延伸切口至剑突（图6A）。
4. 使用剪刀切开肌层，进入腹腔后，将切口向上和向下延伸至切口的顶端和底端。进入腹腔时需小心避免损伤肠管，或扰动吻合口，因为可能有肠段粘连于切口或吻合部位。
5. 小心进行左侧内侧内脏旋转，暴露已修复的乙状结肠（图6B）。修复区域周围很可能存在肠管之间的粘连。应轻柔地钝性分离这些粘连组织，避免破坏吻合口。
   1. 通过寻找用于修复的聚丙烯缝线线尾来确定修复部位。使用剪刀，从修复部位近端1 cm处开始，横向切断降结肠。在吻合口远端1 cm处重复此操作。
6. 使用精细剪刀沿结肠后缘，将乙状结肠段从附着的肠系膜上锐性分离，从而移除该肠段（图7）。
7. 识别结肠标本的肠系膜缘，使用精细剪刀沿肠系膜缘纵向剪开全长。这样可将先前移除的圆柱形标本变为方形或矩形的结肠组织片（图8）。
8. 在移除结肠段之前，使用标记笔标出结肠的对系膜缘。移除后，沿结肠长度方向在标记的对侧做一纵向切口。根据需要对组织样本进行固定、包埋，并切片用于组织学和/或免疫染色。

结果

术后7天，吻合口应已愈合良好。可在术后7天之前和之后的不同时间点取材，以更清晰地展示吻合口愈合的各个阶段。在图9中，组织学分析显示，由表达平滑肌α-肌动蛋白的肌成纤维细胞介导的纤维化反应（通过三色染色法显示胶原）。然而，我们发现组织学分析结果在不同小鼠之间存在差异，具体表现为吻合口处再上皮化的程度以及肌成纤维细胞的聚集浓度有所不同。本实验的术后死亡率低于10%，超过90%存活的小鼠在术后7天时吻合口愈合良好。

图1：

讨论

为确保该操作的成功并尽量减少相关的发病率/死亡率，有几个关键步骤需要注意。首先，应小心处理肠组织，在旋转内脏以暴露结肠时注意避免牵拉损伤。对肠管或肠系膜施加过度张力可能会损伤肠壁或血管，导致吻合部位以外的肠坏死。此外，不应使用锐性镊子或带齿镊子来处理肠管。

在计划进行吻合的部位以外发生肠管损伤，无论是在内脏旋转过程中还是因钝性探针穿孔所致，均应实施动物安乐死。根据我们的经验，肠坏死或损伤可导致腹腔内感染或动物死亡，并引发显著增强的炎症反应，使得愈合后吻合口标本的获取极为困难。

结肠横断应尽可能覆盖大部分降结肠，但需注意避免横断与肠系膜接触的肠壁浆膜层。根据我们的经验，若横断范围包括浆膜层——尤其是肠系膜部分——可能导致结肠近端回缩，使吻合更加困难，并在尝试恢复回缩肠段时造成进一步损伤。

吻合口可用5-6针间断缝合进行修复，较大的小鼠可能需要更多缝线。缝线间距应为1 mm。缝合时先在肠系膜边缘两侧置线，随后在断端两侧交替进针，最终于对系膜缘中点会合，有助于简化并加快吻合过程...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL6/J 小鼠	Jackson Labs	#00664
Fisherbrand 吸水垫，20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
带衬里无菌手术单，18" x 24"	Busse 医院一次性用品公司	696	剪一个矩形孔
Isothesia 异氟烷	Henry Schein	50033
Fisherbrand 无菌棉纱布垫，4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Puralube 凡士林眼膏，1/8 盎司管装	Dechra 兽药产品公司	NDC 17033-211-38
Nair 脱毛膏	Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex 布托啡诺  0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser 制药公司	NDC 12496-0757-5
1 cc 胰岛素注射器，27 G	Becton Dickinson	329412
Chloraprep 洗剂	Medline	APL82287
Webcol 酒精消毒棉片	Covidien	6818
BioGel PI 外科手套	Mölnlycke Health Care	ALA42675Z
带齿微型镊子	Roboz	RS-5150
精细剪刀——锋利型	精细科学工具公司	14060-09
直型锯齿镊	精细科学工具公司	11050-10
Castro-Viejo 持针器	精细科学工具公司	12565-14
0.9% 氯化钠冲洗液	Baxter	BHL2F7121	使用前预热至 37 °C
10 ml 注射器	Becton Dickinson	309604
4-0 Vicryl 可吸收编织缝线，18"，PS-2 针	Henry Schein	6546037
蓝色单股缝线，24”，BV-1 针	Henry Schein	8305H	通常为双针缝线。在中间位置剪断，可得到两条可用缝线。
Cole-Parmer 微型剪刀，标准级，直型，4"	Cole-Parmer	EW-10818-06
Medline 无菌润滑胶	Medline	MDS032273H