小鼠结肠吻合术的建立

摘要

术后吻合口漏或吻合失败是导致术后发病率和死亡率升高的主要原因。我们建立结肠吻合的手术方法是一种可靠且可重复的研究吻合口愈合机制的方法。

摘要

肠道吻合术在择期和急诊手术中均常被实施。然而，吻合口漏是结肠手术中令人高度担忧的并发症，可发生于高达26%的外科吻合术中，发生吻合口漏的患者死亡率可达39%。目前，关于吻合口愈合的细胞机制，仍缺乏详细的数据。若能更深入地理解吻合口正常愈合的过程，将有望显著促进针对吻合口漏的预防策略和治疗手段的开发。

小鼠模型是理想的选择，因为先前的研究表明，与其他动物模型相比，小鼠的吻合术在临床上与人类情况最为相似。我们提供一种易于重复的小鼠结肠吻合模型，可用于进一步阐明吻合口愈合过程。

引言

肠道手术吻合的严重并发症之一是吻合口破裂或渗漏。吻合口渗漏可导致肠腔内容物溢入腹腔，危及生命，并可迅速引发腹腔内脓毒症；小肠吻合术后吻合口漏的发生率在0.3%至5.5%之间，结肠吻合术后则上升至0.5%至26%^1,2。由于腹腔污染后脓毒症发生迅速且病情快速进展至死亡，渗漏后的死亡率可高达39%³。目前的预防策略和治疗方法仍基于尚未完全阐明的病理生理机制。

目前，吻合口愈合常被与研究更为广泛的皮肤伤口愈合相比较，但后者被证明是一个相对不理想的模拟模型。愈合过程包括一系列重叠的阶段，始于最初的滞后期。在肠吻合术后0至4天内，滞后期表现为急性炎症反应，清除伤口中的细胞碎片。接下来，在术后第3至4天，成纤维细胞增殖及胶原蛋白生成标志着纤维增生期（fibrophasia phase）的开始。最后，自第10天起，进入持续较长时间的胶原重塑阶段，称为成熟期（maturation phase）。需要特别注意的是，吻合口的强度在早期非常低，在胶原沉积完成之前，其强度依赖于手术缝合钉或缝线提供的外部支撑⁴。深入了解肠壁各层在吻合口愈合过程中的作用与时间规律，炎症介导的细胞类型（如巨噬细胞）的参与，以及明确可用于预测吻合口成功或失败的替代标志物，有望显著降低结肠手术后的发病率、死亡率以及....

方案

本方案已获得俄克拉荷马大学健康科学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，并符合所有关于实验动物使用的机构伦理准则。此外，所有实验均遵循机构、州及联邦有关实验动物研究的法规进行。

注意：本实验方案使用了12至72周龄的雌性和雄性同源近交C57BL6/J小鼠。所有用于本实验的小鼠在手术前均在非屏障设施中饲养至少一周，以适应当地微生物环境。小鼠可自由进食直至手术前，且在手术前未进行口服机械性肠道准备或直肠冲洗。

1）吻合口的建立

1. 高压灭菌手术器械，预热生理盐水灌洗液，并用70%乙醇彻底清洁所有手术操作表面。
2. 将小鼠放入与麻醉蒸发器相连的诱导室中以诱导麻醉。以1-2 L/min的流量输送2-3%异氟烷，直至小鼠进入镇静状态。
3. 将动物置于加热装置（如加热垫）上，以防止低体温。
4. 皮下注射单次剂量0.1 mg/kg的丁丙诺啡（30 g小鼠注射3 µg）用于术后镇痛，以及单次剂量10 mg/kg的恩诺沙星用于术前抗生素预防。
   注意：尽管本手术无需常规使用术前和术后抗生素，但根据本机构的指南以及动物护理与使用委员会的建议，本机构设施内推荐使用。
5. 将麻醉鼻罩罩住小鼠的口鼻。在整个手术过程中，密切监测动物的呼吸频率，并根据需要调整麻醉气体流速。维持呼吸频率在每分钟30-40次。
6. 使用毛发修剪器，....

结果

术后7天，吻合口应已愈合良好。可在术后7天之前和之后的不同时间点取材，以更清晰地展示吻合口愈合的各个阶段。在图9中，组织学分析显示，由表达平滑肌α-肌动蛋白的肌成纤维细胞介导的纤维化反应（通过三色染色法显示胶原）。然而，我们发现组织学分析结果在不同小鼠之间存在差异，具体表现为吻合口处再上皮化的程度以及肌成纤维细胞的聚集浓度有所不同。本实验的术后死亡率低于10%，超过90%存活的小鼠在术后7天时吻合口愈合良好。

图1：

讨论

为确保该操作的成功并尽量减少相关的发病率/死亡率，有几个关键步骤需要注意。首先，应小心处理肠组织，在旋转内脏以暴露结肠时注意避免牵拉损伤。对肠管或肠系膜施加过度张力可能会损伤肠壁或血管，导致吻合部位以外的肠坏死。此外，不应使用锐性镊子或带齿镊子来处理肠管。

在计划进行吻合的部位以外发生肠管损伤，无论是在内脏旋转过程中还是因钝性探针穿孔所致，均应实施动物安乐死。根据我们的经验，肠坏死或损伤可导致腹腔内感染或动物死亡，并引发显著增强的炎症反应，使得愈合后吻合口标本的获取极为困难。

结肠横断应尽可能覆盖大部分降结肠，但需注意避免横断与肠系膜接触的肠壁浆膜层。根据我们的经验，若横断范围包括浆膜层——尤其是肠系膜部分——可能导致结肠近端回缩，使吻合更加困难，并在尝试恢复回缩肠段时造成进一步损伤。

吻合口可用5-6针间断缝合进行修复，较大的小鼠可能需要更多缝线。缝线间距应为1 mm。缝合时先在肠系膜边缘两侧置线，随后在断端两侧交替进针，最终于对系膜缘中点会合，有助于简化并加快吻合过程.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL6/J 小鼠	Jackson Labs	#00664
Fisherbrand 吸水垫，20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
带衬里无菌手术单，18" x 24"	Busse 医院一次性用品公司	696	剪一个矩形孔
Isothesia 异氟烷	Henry Schein	50033
Fisherbrand 无菌棉纱布垫，4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Puralube 凡士林眼膏，1/8 盎司管装	Dechra 兽药产品公司	NDC 17033-211-38
Nair 脱毛膏	Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex 布托啡诺  0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser 制药公司	NDC 12496-0757-5
1 cc 胰岛素注射器，27 G	Becton Dickinson	329412
Chloraprep 洗剂	Medline	APL82287
Webcol 酒精消毒棉片	Covidien	6818
BioGel PI 外科手套	Mölnlycke Health Care	ALA42675Z
带齿微型镊子	Roboz	RS-5150
精细剪刀——锋利型	精细科学工具公司	14060-09
直型锯齿镊	精细科学工具公司	11050-10
Castro-Viejo 持针器	精细科学工具公司	12565-14
0.9% 氯化钠冲洗液	Baxter	BHL2F7121	使用前预热至 37 °C
10 ml 注射器	Becton Dickinson	309604
4-0 Vicryl 可吸收编织缝线，18"，PS-2 针	Henry Schein	6546037
蓝色单股缝线，24”，BV-1 针	Henry Schein	8305H	通常为双针缝线。在中间位置剪断，可得到两条可用缝线。
Cole-Parmer 微型剪刀，标准级，直型，4"	Cole-Parmer	EW-10818-06
Medline 无菌润滑胶	Medline	MDS032273H