我们提出了一种使用乙醇作为溶剂提取和表征具有抗菌活性的中国台湾绿蜂胶的实验方案。
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摘要
摘要
中国台湾绿蜂胶富含具预酰基的黄酮类化合物，具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗菌和抗癌活性。中国台湾绿蜂胶中的活性成分为蜂胶素（propolins），主要包括蜂胶素C、D、F和G。中国台湾绿蜂胶中蜂胶素的含量因季节和地理区域的不同而有所变化。因此，建立一种标准化且可重复的质量评价方法至关重要。本文介绍了一种通过乙醇提取、高效液相色谱分析及抗菌活性检测来表征中国台湾绿蜂胶质量的实验方案。该方法表明，使用95%和99.5%的乙醇提取可获得最高的干物质得率，从而得到具有抗菌活性的蜂胶素最高浓度。根据上述结果，本方案被认为是一种可靠且可重复的中国台湾绿蜂胶质量评价方法。
引言
蜂胶是由蜜蜂（Apis mellifera）产生的一种天然树脂混合物。自古以来，蜂胶在民间医学中被广泛使用。最近一项研究表明，蜂胶有助于预防微生物感染和炎症1。大量研究证实，蜂胶中的主要生物活性成分包括黄酮类化合物、酚酸酯类、 prenylated p-香豆酸和二萜酸2,3。迄今为止，已通过高效液相色谱法（HPLC）从中国台湾绿蜂胶中鉴定出10种 prenylated 黄烷酮衍生物4,5,6,7。其中含量最丰富的为蜂胶素C、D、F和G5,7。中国台湾绿蜂胶显著的生物学效应与其高含量的蜂胶素密切相关8。
蜂胶中生物活性成分的浓度因采集季节和地理来源的不同而存在显著差异。欧洲蜂胶主要含有黄酮类苷元和酚酸9。巴西蜂胶中的主要生物活性成分是带有异戊烯基取代的p-香豆酸，例如阿替匹林C（artepillin C）10。一项研究表明，季节是决定中国台湾绿蜂胶中总原黄酮（propolin）含量的关键因素11。中国台湾绿蜂胶中的原黄酮含量在夏季（5月至7月）最高，在冬季最低11。蜂胶的抗菌特性通常被视为其生物活性的重要指标。总体而言，来自不同地区的蜂胶样品表现出相似的抗菌特性；例如，蜂胶通常对几乎所有革兰氏阳性菌有效，而对革兰氏阴性菌的抗菌作用则较为有限10,12,13。研究证实，蜂胶中的黄酮类化合物之间存在协同作用，从而产生抗菌效果14。类似地，中国台湾绿蜂胶也被报道对革兰氏阳性菌具有抗菌作用15。此外，有研究还发现，中国台湾绿蜂胶中原黄酮成分之间的相互作用也具有抗菌活性8。
蜂胶中生物活性化合物的表征较为困难，因其化学成分会随来源不同而变化。因此，有必要建立一种可行且可重复的方法，用于评估中国台湾绿蜂胶的质量。然而，目前尚未建立针对中国台湾绿蜂胶提取及其后续功能分析的标准操作流程。已有多种使用有机或无机溶剂的提取方法被提出用于蜂胶提取16,17,18,19,20。由于蜂胶是一种亲脂性混合物，研究表明，有机溶剂提取效果优于无机溶剂提取8,18,19。中国台湾绿蜂胶中总propolin含量及其抑菌特性是评价其质量的关键指标。因此，本研究旨在建立一种以乙醇为溶剂提取并表征中国台湾绿蜂胶抑菌特性的实验方案。
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方案
1. 乙醇提取物的制备
- 称取10 g从中国台湾蜂箱中采集（采集时间为5月至7月）的冷冻台湾青蜂胶，使用香料研磨机进行研磨。确认整块台湾青蜂胶已完全研磨成细粉，无任何大颗粒残留。
- 将100 mL不同浓度的乙醇（60%、70%、80%、95%和99.5%）及水分别加入不同的烧瓶中，并各自与10 g研磨后的蜂胶混合。
- 在25 °C条件下孵育，以250 rpm振荡48小时。
- 使用孔径为25 μm的滤纸过滤乙醇提取物。
- 使用容量瓶以95%乙醇将滤液重新定容至原始体积（100 mL）。
- 将乙醇提取物于-20 °C保存。
注意：本实验方案可在此处暂停。
2. HPLC 用乙醇提取物的制备
- 将10 mL乙醇提取物在40 °C下真空蒸发浓缩15分钟。
- 将干燥物在45 °C下烘烤24小时。
- 用10 mL 95%乙醇重新溶解干燥物。
- 使用孔径为0.45 µm的无菌注射器滤膜过滤1 mL乙醇提取物。
- 使用孔径为0.22 µm的无菌注射器滤膜再次过滤乙醇提取物，收集滤液，可直接用于HPLC分析。
3. 使用高效液相色谱法分析蜂胶素含量
- 蜂胶素标准曲线的建立
- 配制1 L流动相，甲醇:水（v/v）为88.8:11.2的溶液。
- 使用上述流动相作为溶剂，对蜂胶素标准品（C、D、F和G）进行系列稀释，浓度分别为15.625 mg/mL、31.25 mg/mL、62.5 mg/mL和125 mg/mL。
- 依次从低浓度到高浓度，将20 µL各浓度蜂胶素标准品注入反相色谱柱中。
- 将高效液相色谱柱温度设定为30 °C，流速设定为1 mL/min。
- 将紫外检测器的波长设定为280 nm，记录时间设定为20 min。
- 每种标准品至少分析3次。
- 使用计算表格软件，以测定响应值为纵坐标（y轴），浓度为横坐标（x轴），绘制标准曲线，并获得相应的方程和R²值。
- 乙醇提取物的分析
- 取步骤2.5中获得的乙醇提取物20 µL，注入反相色谱柱中。
- 将高效液相色谱柱温度设定为30 °C，流速设定为1 mL/min。
- 将紫外检测器的波长设定为280 nm，记录时间设定为20 min。
- 每种样品至少分析3次。
- 根据步骤3.1.7中所得标准曲线方程，利用每种蜂胶素的峰面积计算乙醇提取物中蜂胶素的浓度。
4. 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分析
注意：采用微量稀释法评估来自中国台湾绿蜂胶的乙醇提取蜂胶素的抗菌效果。
- 试验生物的制备
- 将细菌菌株Staphylococcus aureus和Escherichia coli解冻，随后分别在胰蛋白胨大豆肉汤和营养肉汤中于37 °C培养24 h。
- 将S. aureus用胰蛋白胨大豆肉汤、E. coli用营养肉汤连续传代两代，然后通过计数琼脂平板上的单个菌落来计算菌落形成单位。
- 用于抗菌活性检测的乙醇提取物的制备
- 将步骤1.5中获得的乙醇提取物在40 °C下真空蒸发15 min进行浓缩。
- 用二甲基亚砜（DMSO）重新溶解干燥物，并将提取物浓度调整至12.8 mg/mL。
- 使用肉汤对乙醇提取物进行系列稀释（浓度分别为：5、10、20、40、80、160、320和640 µg/mL）。
- 最低抑菌浓度测定
- 将浓度范围为0.156至640.0 µg/mL的稀释乙醇提取物各10 µL加入96孔板中。
- 用肉汤将体积调至100 µL，并确保所有稀释液中DMSO终浓度为5%。
- 向96孔板中接种100 µL细菌培养液（1 × 106/mL）。
- 将含有不同浓度乙醇提取物的接种物在37 °C下培养48 h。
- 根据浊度并通过在590 nm处测定光密度（使用酶标仪）分析细菌生长情况，以确定最低抑菌浓度（MIC）。
- 最低杀菌浓度测定
- 从最低抑菌浓度试验中无可见生长的各孔中取10 µL液体培养物接种至琼脂平板上。
- 在37 °C下培养24 h。
- 通过确定未出现可见细菌生长的最低浓度来判断杀菌活性。能够完全消除细胞生长的浓度即为最低杀菌浓度（MBC）。
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结果
乙醇提取的代表性阳性数据见表1。中国台湾绿蜂胶的干物质得率与乙醇浓度呈正相关。使用95%和99.5%乙醇提取时，中国台湾绿蜂胶的干物质得率最高；而以水作为提取溶剂时，干物质得率最低。这些结果表明，有机溶剂（如乙醇）在提取中国台湾绿蜂胶时效果最佳。采用HPLC对标准蜂胶素C、D、F和G的信号进行鉴定与定量分析（图1a）。通过各蜂胶素标准品及HPLC对中国台湾绿蜂胶乙醇提取物中的蜂胶素信号进行表征（图1b）。通常情况下，中国台湾绿蜂胶中蜂胶素（C、D、F和G）的含量随提取过程中乙醇浓度的升高而增加（表1）。中国台湾绿蜂胶中蜂胶素得率最高的提取条件为95%和99.5%乙醇提取。
乙醇提取物抗菌效果的代表性阳性数据见表2。检测了乙醇提取物对<...
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讨论
一项研究报道，使用不同浓度的乙醇进行浸渍法可用于巴西蜂胶的提取17；然而，该方法耗时较长17。从巴西蜂胶中提取酚类等生物活性成分至少需要10天17。另一种方法是采用乙醇提取并结合37 °C、50 °C或70 °C加热30分钟，已被提出用于巴西蜂胶的提取19,21,22。研究确定，巴西蜂胶中生物活性成分的提取效果因乙醇浓度的不同而有所差异19。由于巴西蜂胶与台湾绿蜂胶的化学成分存在差异，其生物活性成分的提取效率也可能不同。本文提供了一种可靠且可重复的台湾绿蜂胶提取方案。使用乙醇作为溶剂，可在2天内完成台湾绿蜂胶中生物活性成分的提取。类似的研究结果也支持本文所述方案，并证实使用95%乙醇结合3天提取可有效提取台湾绿蜂胶中的蜂胶素（C、D、F和G）
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
本文由 Wallace Academic Editing 进行编辑。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Whatman no. 4 滤纸 | Sigma-Aldrich | WHA1004125 | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| 反相 RP-18 柱 | Phenomenex Inc. | 00G-0234-E0 | |
| 金黄色葡萄球菌 | ATCC | BCRC 10780 | |
| 大肠杆菌 | ATCC | BCRC 10675 | |
| 胰蛋白胨大豆肉汤 | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| 营养肉汤 | Sigma-Aldrich | 70122 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 香料研磨机 | Waring | WSG60K | |
| 酶标仪 | Molecular Devices | EMAX PLUS | |
| HPLC 系统 | Agilent | 1200 Series | |
| 真空蒸发 | BÜCHI | Rotavapor R-215 |
参考文献
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