本研究描述了一种用于原位递送分泌型玉米蛋白至三种不同类型玉米组织的Ustilago maydis特洛伊木马菌株的克隆方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
受荷马史诗中特洛伊木马传说的启发，我们对玉米病原菌Ustilago maydis进行改造，使其能够将分泌蛋白递送至玉米的胞间空间，从而实现体内表型分析。该方法不依赖于玉米的遗传转化，而是利用微生物的遗传特性和病原菌的分泌能力。该策略可在不同类型感染位点和组织中，以高时空分辨率检测体内递送的分泌蛋白。特洛伊木马策略可用于瞬时弥补玉米功能缺失表型、功能鉴定蛋白结构域、分析蛋白脱靶效应或研究蛋白过量表达的影响，因此成为玉米作物系统中蛋白研究的有力工具。本文提供了构建特洛伊木马菌株的详细实验方案，以及针对三种不同玉米组织类型的标准化接种操作流程。
引言
专性寄生真菌Ustilago maydis是玉米黑粉病的致病因子1。它可侵染玉米的所有地上部分，导致形成含有黑色、黑色素化的孢子的大型肿瘤。在全球范围内，U. maydis估计每年造成约2%的玉米产量损失，而其形成的肿瘤在中国台湾和墨西哥则被视为一种美味佳肴。植物侵染始于附着胞，该结构分泌细胞壁降解酶以穿透玉米表皮细胞的第一层。从初始侵染位点开始，U. maydis在细胞内和细胞间生长，每天侵入一到两层细胞1,2。成功侵染后引发植物细胞肥大，通常在侵染后五天形成可见的肿瘤1,3,4。在整个侵染过程中，真菌菌丝向内凹陷植物细胞质膜，但不与寄主细胞质发生直接接触1,2。侵染菌丝与植物原生质膜之间狭窄的质外体空间被认为是寄主与病原体相互作用的区域，称为活体营养相互作用区。为了克服植物的先天免疫系统，U. maydis向活体营养相互作用区分泌一系列效应蛋白1....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 构建玉米黑粉菌（U. maydis）特洛伊马
注意： 参见图1。
- 使用基因特异性引物和具有校对功能的DNA聚合酶，从玉米cDNA中扩增目的基因。克隆初级PCR产物，并将重组质粒转化至 E. coli 按照质粒供应商的说明进行操作. 在进行后续克隆步骤之前，通过Sanger测序验证目的基因序列的正确性。
注意： 由于引物序列的特异性以及DNA聚合酶反应条件的最优化要求，需要对PCR参数进行优化。 - 设计引物以扩增目标玉米基因，但不包含编码信号肽（SP）的序列。
- 将反向引物的5´端延伸，加入RSIATA基序和一个 NcoI型切割位点（表1).
- 使用1.1中构建的PCR产物作为模板，以具有校对功能的DNA聚合酶扩增目标玉米基因。
- 双酶切PCR产物和 U. maydis 转化质粒，p123-P嗯pit2-Sp嗯pit2-Zmmac1-mCherry-H....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
用于构建的载体 U. maydis 特洛伊木马实验被克隆至质粒 p123-P 中嗯pit2-Sp嗯pit2-目的基因-mCherry-Ha. 将目标玉米基因与一个 mCherry 荧光报告基因和表位 HA-标签。融合蛋白的表达由 U. maydis 嗯pit2 在感染过程中特异性激活的启动子21为了将目标蛋白肽定向分泌至活体营养相互作用区，需将该蛋白的编码区与信号肽序列融合 U. maydis 嗯pit221 (图1）。当 U. maydis 转化，外源基因被插入到SG200中 ip-.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
现代作物研究需要在基因和蛋白质水平上进行分子分析的实验方案。基因可及性 通过 对于大多数作物物种（如玉米）而言，遗传转化技术要么不可行，要么效率低下且耗时。此外，可靠的遗传工具（如启动子报告系统）十分有限，这使得在不同组织位点上以高时空分辨率原位研究蛋白质功能变得困难。胞外途径蛋白可通过将异源表达并纯化的蛋白质渗入组织进行研究。然而，尽管异源蛋白表达技术已取得进展，但将蛋白质靶向渗入作物组织仍存在困难，且常因效率低下而不适用于蛋白质功能分析。特洛伊木马策略是一种无需遗传转化或蛋白质渗入的替代方法，该方法利用玉米病原菌的分泌系统 U. maydis，理论上可将任何目的蛋白递送至感病组织的植物质外体中。关于目的蛋白的大小，该技术的适用尺寸范围仍有待进一步探索。在先前的实验中，已成功递送了含有290个氨基酸的蛋白 U. maydis 效应子Cmu1与mCherry融合后成功分泌7然而，特洛伊木马法在较大蛋白质上的适用性仍有待验证。如果不需要对目标蛋白添加翻译后修饰，则可采用非经典分泌途径作为经典分泌途径的替代方案。 通过 S.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Thomas Dresselhaus、Martin Parniske、Noureddine Djella 和 Armin Hildebrand 提供实验室空间和植物材料。关于“特洛伊木马”方法的原始研究得到了德国利奥波第那科学院博士后奖学金以及美国国家科学基金会项目 IOS13-39229 的资助。本文所展示的研究工作得到了德国研究基金会（DFG）SFB924 项目（A14 和 B14）的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2 mL 注射器 | B. Braun | 4606027V | |
| 23 G × 1 1/4 皮下注射针头 | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| 玉米cDNA | 从表达目的基因的玉米组织中 | ||
| 炭粉 | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | 使用本地可获取的设备 | ||
| 比色皿（10 mm × 4 mm × 45 mm） | Sarstedt | 67742 | |
| 28℃ 恒温摇床 °C，200 转/分钟 | 使用本地可获取的设备 | ||
| 400倍放大倍数的光学显微镜 | 使用本地可获取的设备 | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-P嗯pit2-分泌蛋白嗯pit2-玉米Zmmac1-mCherry-Ha | 请联系通讯作者 | ||
| 巴斯德吸管（玻璃，长头） | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | 可以替换为其他基础克隆载体，如 pENTR 或 pJET |
| 马铃薯葡萄糖琼脂 | VWR | 90000-745 | |
| 记号笔 | 使用本地可获取的设备 | ||
| 分光光度计 | 使用本地可获取的设备 | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA连接酶 | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| 酵母提取物 | BD | 212750 |
参考文献
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Jour....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
