本研究描述了一种用于原位递送分泌型玉米蛋白至三种不同类型玉米组织的Ustilago maydis特洛伊木马菌株的克隆方法。
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摘要
摘要
受荷马史诗中特洛伊木马传说的启发，我们对玉米病原菌Ustilago maydis进行改造，使其能够将分泌蛋白递送至玉米的胞间空间，从而实现体内表型分析。该方法不依赖于玉米的遗传转化，而是利用微生物的遗传特性和病原菌的分泌能力。该策略可在不同类型感染位点和组织中，以高时空分辨率检测体内递送的分泌蛋白。特洛伊木马策略可用于瞬时弥补玉米功能缺失表型、功能鉴定蛋白结构域、分析蛋白脱靶效应或研究蛋白过量表达的影响，因此成为玉米作物系统中蛋白研究的有力工具。本文提供了构建特洛伊木马菌株的详细实验方案，以及针对三种不同玉米组织类型的标准化接种操作流程。
引言
专性寄生真菌Ustilago maydis是玉米黑粉病的致病因子1。它可侵染玉米的所有地上部分，导致形成含有黑色、黑色素化的孢子的大型肿瘤。在全球范围内，U. maydis估计每年造成约2%的玉米产量损失，而其形成的肿瘤在中国台湾和墨西哥则被视为一种美味佳肴。植物侵染始于附着胞，该结构分泌细胞壁降解酶以穿透玉米表皮细胞的第一层。从初始侵染位点开始，U. maydis在细胞内和细胞间生长，每天侵入一到两层细胞1,2。成功侵染后引发植物细胞肥大，通常在侵染后五天形成可见的肿瘤1,3,4。在整个侵染过程中，真菌菌丝向内凹陷植物细胞质膜，但不与寄主细胞质发生直接接触1,2。侵染菌丝与植物原生质膜之间狭窄的质外体空间被认为是寄主与病原体相互作用的区域，称为活体营养相互作用区。为了克服植物的先天免疫系统，U. maydis向活体营养相互作用区分泌一系列效应蛋白1。部分效应蛋白被植物细胞吸收，而另一些则保留在活体营养相互作用区中5,6,7,8。其中一个质外体效应蛋白是UmPit2，它与玉米质外体蛋白酶相互作用，抑制质外体蛋白酶活性介导的ZmPROZIP释放信号肽ZmZIP19,10。
在过去的几十年中， U. maydis 不仅成为植物病原真菌互作中真菌遗传学研究的模式生物，而且由于其生命周期明确、遗传操作简便以及能够异源表达分泌蛋白，也成为生物技术领域的重要工具11,12,13常规与非常规蛋白质分泌的信号均已确定，从而实现了对翻译后修饰的调控14最近， U. maydis 被用作“特洛伊木马”工具，以原位研究玉米分泌的小分子蛋白质15“特洛伊木马”策略被成功用于分析参与花药发育的小型分泌蛋白ZmMAC1的功能。ZmMAC1可诱导多能细胞的平周分裂以及新形成细胞的细胞命运决定。15采用相同方法揭示了玉米损伤相关肽ZmZIP1的生物学功能。 U. maydis 分泌玉米ZmZIP1导致肿瘤形成受阻10因此，特洛伊木马方法为蛋白质原位研究提供了一种有价值的替代途径，具有高时空分辨率，既无需构建稳定的玉米转基因品系，也无需通过异源表达和纯化蛋白进行组织渗透。特别是，该策略能够实现任何异源蛋白向玉米质外体的分泌，并可直接比较感染情况 与 同一组织内未感染的植物细胞
本方案阐述了生成一个的主要步骤 U. maydis 用于研究目标蛋白的“特洛伊木马”菌株。此外，还包括利用三种不同玉米组织类型（成年叶片、雄穗和雌穗）进行感染实验的详细操作步骤 U. maydis这是研究这些靶组织中感染时空进展及蛋白质功能的先决条件。由于玉米基因扩增和显微成像技术的具体操作因靶标而异且依赖于仪器，本文未对其作进一步说明。因此，本方案适用于具备标准分子生物学技术操作经验的用户。
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方案
1. 构建玉米黑粉菌（U. maydis）特洛伊马
注意： 参见图1。
- 使用基因特异性引物和具有校对功能的DNA聚合酶，从玉米cDNA中扩增目的基因。克隆初级PCR产物，并将重组质粒转化至 E. coli 按照质粒供应商的说明进行操作. 在进行后续克隆步骤之前，通过Sanger测序验证目的基因序列的正确性。
注意： 由于引物序列的特异性以及DNA聚合酶反应条件的最优化要求，需要对PCR参数进行优化。 - 设计引物以扩增目标玉米基因，但不包含编码信号肽（SP）的序列。
- 将反向引物的5´端延伸，加入RSIATA基序和一个 NcoI型切割位点（表1).
- 使用1.1中构建的PCR产物作为模板，以具有校对功能的DNA聚合酶扩增目标玉米基因。
- 双酶切PCR产物和 U. maydis 转化质粒，p123-P嗯pit2-Sp嗯pit2-Zmmac1-mCherry-Ha15，与 Xba我与 NcoI. 纯化消化后的PCR产物和质粒。
- 将消化后的PCR产物连接至p123-P嗯pit2-Sp嗯pit2-Zmmac1-mCherry-Ha 使用T4 DNA连接酶，按照制造商说明书进行连接反应。将连接产物转化至 E. coli 通过Sanger测序验证目标基因的正确序列。
- 将 p123-P 线性化嗯pit2-Sp嗯pit2-Zm目的基因-mCherry-Ha 用限制性内切酶 Ssp我并将DNA转化至自养致病菌中 U. maydis 菌株 SG20016分离 U. maydis 通过羧菌灵筛选转化子，并利用Southern印迹分析验证分离得到的转化子16.
注意： 对于每种目标蛋白，至少进行三次独立 U. maydis 应分离并分析转化子，以评估随机背景突变可能产生的表型效应。
2. 培养基
- 制备YEPSlight液体培养基16：1.0% (w/v) 酵母提取物、0.4% (w/v) 胰蛋白胨和0.4% (w/v) 蔗糖。将所有组分溶解于ddH2O中，在121 °C下高压灭菌15分钟；在更高温度、更长时间或反复灭菌会降低培养基质量。
- 制备马铃薯葡萄糖琼脂（PD-琼脂）20：3.9% (w/v) 马铃薯葡萄糖琼脂和1.0% (w/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0（终浓度0.01 M）。将所有组分直接在灭菌瓶中混合，并加入ddH2O和一个磁力搅拌子。在121 °C下高压灭菌15分钟；在更高温度、更长时间或反复灭菌会降低培养基质量。
- 制备PD-活性炭琼脂20：3.9% (w/v) 马铃薯葡萄糖琼脂、1% (w/v) 活性炭和1.0% (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0（终浓度0.01 M）。将所有组分直接在灭菌瓶中混合，并加入ddH2O和一个磁力搅拌子。在121 °C下高压灭菌15分钟；在更高温度、更长时间或反复灭菌会降低培养基质量。
3. 植物感染
- 通过特洛伊木马递送蛋白分析玉米细胞分裂反应例如， 基于显微镜的细胞计数 事先 U. maydis-诱导的玉米细胞增殖及随后的肿瘤形成始于感染后约4-5天。定量疾病评估依赖于组织类型，应在感染后6至14天进行。
注意： 不同玉米品种对病害的易感性存在差异 U. maydis 感染。玉米 c与 W23、A188、Gaspe flint、Early Golden Bantam 或 Va35 对该病原体表现出敏感性，因此适用于“特洛伊木马”研究的玉米品系。 - 样品制备 U. maydis 接种物
- 在所有“特洛伊木马”实验中，将前体菌株 SG200 作为阴性对照，以评估转基因菌株对感染过程可能产生的副作用。此处，使用一个 U. maydis 表达目标蛋白非分泌型版本的菌株作为阴性对照。然而，出于实用性的考虑（例如， 对于较大规模的筛选，前体菌株可能是更简便的对照选择。
- 实验开始前，估算所需感染培养物的用量。注意每株植物的感染需要 1 - 1.5 mL U. maydis 悬浮依赖于玉米组织类型。
注意： 约1 mL的过夜培养物足以稀释至所需OD600 0.2，溶于20 mL YEPS中光 培养基，以及25 mL的 U. maydis OD值培养600 0.8-1.0 的感染量足以感染 13-16 株植物。 - 划痕 U. maydis 从PD琼脂平板上用无菌巴斯德吸管挑取菌落，接种于5 mL YEPS中光 在28 °C、200 rpm持续振荡条件下培养16小时。
- 感染前，检查 U. maydis 在400倍标准光学显微镜下观察接种培养物，以评估正常生长情况及细菌污染。
注意： 在合适的培养条件下，仅可见杆状真菌（图2). - 混合 900 µL 新鲜的 YEPS光 用100 µL过夜培养物并测定OD600 使用 YEPS光 以培养基作为空白对照进行分光光度计分析。
- 用新鲜的 YEPS 稀释过夜培养物光 中等至 OD600 0.2，并在28 °C、200 rpm持续振荡条件下培养，直至菌液达到对数生长中期，此时OD值为指示标准600 nm 0.8–1.0
注意： U. maydis 细胞在此条件下每2小时增殖一次，因此达到所需的OD600 培养4-5小时后达到。 - 在 OD 处收获细胞600 0.8–1.0，通过在3,000 × g下离心 g 10 分钟后弃去上清液。
- 用ddH₂O洗涤细胞沉淀一次2O。为此，加入一个培养物体积的ddH2O，以3000 x g离心 g 10 分钟后弃去上清液。
- 小心地用ddH₂O重悬细胞沉淀2使用20 mL玻璃移液管调节最终OD600 3.0（用于特洛伊木马实验）或1.0（用于疾病评级）。
- “特洛伊木马”的验证：玉米融合蛋白在植物体内的分泌
- 用特洛伊木马菌株侵染玉米幼苗17.
- 在接种后2至3天，使用共聚焦激光扫描显微镜对感染的幼苗进行显微成像。为此，剪取注射点下方1 cm处的叶片矩形片段，将样品置于载玻片上，并加入一滴ddH₂O。2O. 为观察mCherry融合蛋白，将样品在λ=561 nm处激发，并在λ=580–630 nm范围内记录发射光。
- 成年玉米叶片的感染
- 将玉米植株培养至成年叶阶段（即至少第七片叶在茎秆上生长出来时）。
注意： 在温室条件下，以14小时光照（28 °C）/10小时黑暗（22 °C）的光温周期播种cv. W23，约四周后达到此阶段。具体时长可能因玉米品种及温室条件而有所差异。 - 转移 U. maydis 将培养物（见3.2.9）吸入一个带有20G×1规格皮下注射针头的3 mL注射器中。
- 小心按压茎秆以定位茎中的分生组织。分生组织的基部可通过从较硬茎秆向较软组织的转变来识别。
- 用记号笔在茎上标记分生组织位置。
- 注入1.5 mL的 U. maydis 在茎尖分生组织或花序分生组织上方1 cm处进行培养。
- 在感染后第6天和第12天评估疾病症状。
- 将玉米植株培养至成年叶阶段（即至少第七片叶在茎秆上生长出来时）。
- 花丝感染
- 将玉米植株培育至抽穗期。
注意： 先前已对玉米自交系W23的花药和雄穗发育过程进行了详细的时间线描述18,19含有减数分裂前花药的穗子极易受到 U. maydis 感染；在玉米自交系W23中，雄穗的大小为4 - 7 cm。 - 小心按压茎秆，使穗子固定在茎上。
- 用笔在茎上标记穗的顶端和基部。
- 转移 U. maydis 将培养物（见3.2.9）吸入一个带有20G×1规格皮下注射针头的3 mL注射器中。
- 在穗部周围注入1.5 mL接种物。为确保接种物均匀分布，使用记号笔标记穗的顶端、中部和基部，并在每个位置缓慢注入0.5 mL。
- 接种后10天评估疾病症状。
- 将玉米植株培育至抽穗期。
- 耳部感染
注意： 不同玉米品种的耳组织发育在温室条件下存在差异，接种前必须仔细观察。开始长出花丝的果穗对侵染极为敏感 U. maydis 感染- 转移 U. maydis 将培养物（见3.2.9）吸入3 mL注射器，配备20 G × 1英寸皮下针头。
- 将接种针尽可能深地插入苞叶之间的空隙中，注意不要损伤果穗。
- 在耳部周围释放1.5 mL接种物。
- 移除注射器及针头，轻轻按摩玉米穗以使液体均匀分布 U. maydis 均匀分配溶液。
- 接种后14天评估疾病症状。
- 确认存活率 U. maydis 接种物
- 在PD活性炭琼脂平板上滴加10 µL接种物，于室温下培养2天。
注意： 如果相应的 U. maydis 培养物能够形成菌丝，可见蓬松的白色菌丝体图5)
- 在PD活性炭琼脂平板上滴加10 µL接种物，于室温下培养2天。
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结果
用于构建的载体 U. maydis 特洛伊木马实验被克隆至质粒 p123-P 中嗯pit2-Sp嗯pit2-目的基因-mCherry-Ha. 将目标玉米基因与一个 mCherry 荧光报告基因和表位 HA-标签。融合蛋白的表达由 U. maydis 嗯pit2 在感染过程中特异性激活的启动子21为了将目标蛋白肽定向分泌至活体营养相互作用区，需将该蛋白的编码区与信号肽序列融合 U. maydis 嗯pit221 (图1）。当 U. maydis 转化，外源基因被插入到SG200中 ip-...
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讨论
现代作物研究需要在基因和蛋白质水平上进行分子分析的实验方案。基因可及性 通过 对于大多数作物物种（如玉米）而言，遗传转化技术要么不可行，要么效率低下且耗时。此外，可靠的遗传工具（如启动子报告系统）十分有限，这使得在不同组织位点上以高时空分辨率原位研究蛋白质功能变得困难。胞外途径蛋白可通过将异源表达并纯化的蛋白质渗入组织进行研究。然而，尽管异源蛋白表达技术已取得进展，但将蛋白质靶向渗入作物组织仍存在困难，且常因效率低下而不适用于蛋白质功能分析。特洛伊木马策略是一种无需遗传转化或蛋白质渗入的替代方法，该方法利用玉米病原菌的分泌系统 U. maydis，理论上可将任何目的蛋白递送至感病组织的植物质外体中。关于目的蛋白的大小，该技术的适用尺寸范围仍有待进一步探索。在先前的实验中，已成功递送了含有290个氨基酸的蛋白 U. maydis 效应子Cmu1与mCherry融合后成功分泌7然而，特洛伊木马法在较大蛋白质上的适用性仍有待验证。如果不需要对目标蛋白添加翻译后修饰，则可采用非经典分泌途径作为经典分泌途径的替代方案。 通过 S...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Thomas Dresselhaus、Martin Parniske、Noureddine Djella 和 Armin Hildebrand 提供实验室空间和植物材料。关于“特洛伊木马”方法的原始研究得到了德国利奥波第那科学院博士后奖学金以及美国国家科学基金会项目 IOS13-39229 的资助。本文所展示的研究工作得到了德国研究基金会（DFG）SFB924 项目（A14 和 B14）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2 mL 注射器 | B. Braun | 4606027V | |
| 23 G × 1 1/4 皮下注射针头 | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| 玉米cDNA | 从表达目的基因的玉米组织中 | ||
| 炭粉 | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | 使用本地可获取的设备 | ||
| 比色皿（10 mm × 4 mm × 45 mm） | Sarstedt | 67742 | |
| 28℃ 恒温摇床 °C，200 转/分钟 | 使用本地可获取的设备 | ||
| 400倍放大倍数的光学显微镜 | 使用本地可获取的设备 | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-P嗯pit2-分泌蛋白嗯pit2-玉米Zmmac1-mCherry-Ha | 请联系通讯作者 | ||
| 巴斯德吸管（玻璃，长头） | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | 可以替换为其他基础克隆载体，如 pENTR 或 pJET |
| 马铃薯葡萄糖琼脂 | VWR | 90000-745 | |
| 记号笔 | 使用本地可获取的设备 | ||
| 分光光度计 | 使用本地可获取的设备 | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA连接酶 | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| 酵母提取物 | BD | 212750 |
参考文献
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