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表面单分子成像用光驱动分子马达

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DOI：

10.3791/58750

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2019年3月13日

 ,  , 
1Stratingh Institute for Chemistry, University of Groningen

本文内容

摘要

该论文描述了如何在表面上合成并接枝分子马达，以实现单分子成像。

摘要

本文展示了旨在实现表面上单分子水平直接观察合成旋转马达的合成体系的设计与构建。该项工作需要精心的设计、大量的合成投入以及恰当的分析。通过1H NMR和紫外-可见吸收光谱技术，展示了该分子马达在溶液中的旋转运动。此外，还描述了将该马达接枝到氨基修饰石英表面的方法。该方法有助于深入理解分子机器。

引言

在生物体内，存在大量分子马达，它们发挥着维持日常生命活动的功能。这些分子马达能够执行诸如能量生成、物质运输、运动等多种任务1。受自然界中这些奇妙实例的启发，科学家在过去几十年中开发出一系列人工分子马达，旨在将不同形式的能量转化为分子水平上可控的运动2,3,4,5,6,7,8,9,10。2016年诺贝尔化学奖授予了该领域的三位先驱。获奖者之一本·费林加（Ben Feringa）开发出一种光驱动分子马达，能够实现持续的单向旋转运动。

然而，在分子层面，由于分子碰撞和振动引起的随机运动（即布朗运动）通常是这些分子马达进一步应用的主要障碍。布朗运动可能破坏任何定向运动。将分子马达固定在表面上可能是克服这一问题的途径之一。通过这种方式，分子一部分相对于另一部分的相对旋转可转化为转子相对于表面的绝对旋转11。此外，单分子成像技术的应用有助于直接观察该运动过程。因此，本研究获得的结果将有助于更深入地理解合成分子马达的工作机制。

Yoshida 和 Kinosita 的开创性工作（图 2a）12,13 为本研究的设计提供了灵感，如 图 2b 所示。将光驱动分子马达的下半部分固定在表面上作为定子，转子部分则连接一个刚性臂和荧光标记。当对系统施加两种不同波长的光照时，其中一种波长可触发马达的旋转，而另一种波长则激发荧光标记。原则上，转子部分的旋转运动会带动荧光基团的旋转。因此，可通过离焦宽场荧光显微镜追踪荧光标记的旋转。该方法首次提供了一种将分子马达的相对旋转转化为绝对旋转的途径，从而实现了对合成马达旋转的可视化观测。

本文详细介绍了用于单分子成像的分子马达的设计、全合成及其在溶液中异构化行为的研究。分子结构如图3所示。此外，还描述了将分子马达固定在石英表面的方法。

方案

注意：有机合成是本项目的主要核心。图1展示了关键步骤以及如何获得目标分子。

1. 1b 的制备

注意：溶剂为分析纯级购买。

  1. 酮（3）的合成
    注意：最初为一个五元环酮 2 含碘基团因反应活性更高而被官能化。该反应在氩气氛围下进行。
    1. 在含有100 mL的密封试管中 2 （640 毫克，2.3 毫摩尔）、CuI（219 毫克，1.1 毫摩尔）和 NaI（3.44 克，23 毫摩尔），加入 1,4-二氧六环（50 毫升）和 N,N'-二甲基乙二胺（202 毫克，2.3 毫摩尔）。
    2. 将反应温度设定为 140 °C，搅拌反应 24 小时。
    3. 将混合物冷却至室温（RT），减压除去溶剂，并通过快速柱色谱纯化剩余物质：SiO₂2 (40 g)；洗脱剂：戊烷:乙酸乙酯 = 10:1（总体积 = 550 mL）。产物为黄色黏稠油状物（642 mg，91%）。
  2. 运动分子5的合成
    注意：使用Barton-Kellogg反应构建中心双键。该反应在氩气氛围下进行。
    1. 在50 mL圆底烧瓶中，加入劳氏试剂（415 mg，1.1 mmol）、酮 3 （219 毫克，0.68 毫摩尔）和甲苯（10 毫升）。
    2. 将混合物回流加热2小时，随后蒸发溶剂。
    3. 通过快速柱色谱纯化残余物：SiO₂2 （24 g），洗脱剂：戊烷:乙酸乙酯 = 30:1（总体积 = 155 mL），得到相应的硫代酮，随后将其重新溶解于20 mL四氢呋喃中，得到蓝色溶液。
    4. 加入重氮化合物的四氢呋喃溶液（20 mL） 4 将(476 mg, 1.37 mmol)加入蓝色溶液中，50 °C下搅拌反应过夜。
      注意：这是整个合成过程中最关键的一步。重氮化合物和硫酮溶液必须新鲜配制，并在反应前立即制备。
    5. 蒸发溶剂，并通过色谱法纯化残余物：SiO₂2 (24 g)，洗脱剂：戊烷:CH2Cl2 = 10:1（总体积 = 220 mL）以制备电机 5 （250 mg，50%）红色固体。
  3. 合成分子马达6
    注意：当中心双键形成后，用乙炔基取代碘原子。
    1. 向一个 20 mL 肖伦克管中加入 3 (165 毫克，0.26 毫摩尔)，Pd(PPh3)2Cl2 （2.5 摩尔％），CuI（5 摩尔％）。然后加入 THF（10 mL）和（i-Pr)2NH（2 mL），使用前应通入氩气鼓泡10分钟。
    2. 在室温下搅拌混合物10分钟。然后加入三异丙基硅基乙炔（42 mg，0.27 mmol）。
    3. 搅拌混合物15小时，然后将其倒入饱和水溶液NH₄Cl中4Cl 溶液（25 mL）。
    4. 用CH提取混合物2Cl2 （3 × 20 mL）。再用饱和食盐水洗涤合并的有机相，并干燥（Na2SO4).
    5. 除去溶剂，并通过快速柱色谱纯化残留物：SiO₂2 (12 g)，洗脱剂：戊烷:CH2Cl2 10:1（220 mL）以得到 8 为棕色油状物（171 mg，99%）。
  4. 合成分子马达8
    注意：该反应在氩气氛围下进行。
    1. 搅拌混合物 6 （161 毫克，0.24 毫摩尔），频哪醇酯 7 （240 毫克，0.71 毫摩尔），K3PO4 （300 毫克，1.44 毫摩尔），以及 Pd(PPh3)4 （98 mg，0.096 mmol）溶于1,4-二氧六环（20 mL）中，于50 mL史兰克管内90 °C反应16小时。
    2. 将混合物冷却至室温，用乙酸乙酯（30 mL）稀释，然后用玻璃滤器过滤。
    3. 除去溶剂，通过快速柱层析纯化残余物：SiO₂2 (12 g)，洗脱剂：戊烷: CH2Cl21:6（总体积 = 122 mL），以生成酯 8 呈棕色油状物（156 mg，56%）。
  5. 运动分子9的合成
    1. 向溶液中加入 TBAF（0.1 mL） 8 （120 mg，0.13 mmol）溶于10 mL THF中，置于20 mL Schlenk反应管内，0 °C条件下反应。
    2. 在 0 °C 下搅拌混合物 1 小时，然后将其倒入饱和 NH₄Cl 水溶液中4Cl 溶液（20 mL）。
    3. 氯仿萃取后3 （3 × 10 mL），用饱和食盐水洗涤合并的有机相，并用 Na₂SO₄ 干燥2SO4).
    4. 除去溶剂，并通过快速柱色谱纯化残余物：SiO₂2 （12 g），洗脱剂：戊烷:乙酸乙酯 = 1:3（124 mL），得到 9 为深红色油状物（116 mg，95%）。
  6. 合成马达12
    注意：该反应在氩气氛围下进行。
    1. 向一个20 mL史兰克管中加入马达 9 （75 毫克，0.10 毫摩尔），PBI 11 (68 毫克，0.10 毫摩尔) Pd(PPh3)2Cl2 （2.5 mol%）、CuI（5 mol%）。然后加入 THF（10 mL）和（i-Pr2NH（2 mL），使用前应通入氩气鼓泡10分钟。
    2. 搅拌混合物过夜，然后将其倒入饱和水溶液 NH4Cl 溶液。
    3. 氯仿萃取后3 （3 × 20 mL），用饱和食盐水洗涤合并的有机相，并干燥（Na2SO4).
    4. 除去溶剂，并通过快速柱色谱纯化残留物：SiO₂2 (12 g)，洗脱剂：CHCl3 (100 mL) 以获得运动功能 12 为暗红色固体（66 mg，57%）。
  7. 合成马达1b
    注意：当获得酯类化合物后，需将其水解以得到最终目标分子。
    1. 溶解酯 12 (90 mg，0.038 mmol) 溶于 THF (5 mL)、MeOH (5 mL) 和 NaOH（水溶液） 在50 mL圆底烧瓶中加入（1 M，5 mL）试剂，将混合物加热至75 °C并反应16小时。
    2. 将混合物冷却至室温，加入5 mL水。通过旋转蒸发除去THF和MeOH。
    3. 用 HCl 滴定该混合物（水溶液） (1 M) 直至 pH 达到 1，形成棕色沉淀。过滤混合物，并用冷水 (10 mL) 洗涤棕色固体，真空干燥。该棕色固体即为目标分子 1b （55 毫克，85%）

2. 运动功能化单层MS-1b的制备

  1. 将石英载玻片浸入piranha溶液（30% H2O2 与 H2SO4 按3:7体积比混合）中，在90 °C下处理1小时以进行清洗。用双蒸水彻底冲洗3次，再用甲醇（MeOH）冲洗。在表面修饰前，用氮气（N2）气流吹干载玻片。
  2. 将经piranha溶液清洗的石英载玻片浸入含1 mM 3-氨丙基(二乙氧基)甲基硅烷的 freshly distilled 甲苯溶液中，在室温（RT）下反应12小时以进行硅烷化。随后用甲苯和甲醇（MeOH）充分冲洗。
  3. 将石英载玻片依次在甲苯和甲醇（MeOH）中超声处理，然后在氩气气流下吹干。
  4. 将带有氨基的载玻片浸入含1b的DMF溶液（10-4 M）中，在室温（RT）下放置12小时。
  5. 用DMF、水和甲醇（MeOH）洗涤载玻片，然后在氩气气流下吹干。干燥后，载玻片即可使用。

结果

使用紫外光照射分子马达λ最大 = 365 nm）。照射时，发生光诱导 E-Z 中心双键周围的异构化发生。在此过程中，分子从稳定态转变为不稳定异构体。随后通过热活化的螺旋反转步骤，释放整个分子的张力，最终恢复至原始的稳定状态。 1随后采用氢核磁共振（1H NMR）波谱法评估旋转过程（图4a). 将样品溶液置于核磁共振管中，然后用紫外灯（λ最大 = 365 nm）置于试管旁。照射2小时后，可观察到明显的变化 1H NMR 谱。这些变化表明生成了一种新的异构体，该异构体被认为是不稳定的-1b（图4b）。在 1H NMR 谱学中的 Ha 从2.9 ppm（双峰）位移到3.3 ppm（双二重峰）。1.4 ppm处的信号可归属于甲基的吸收峰，其向低场位移至1.6 ppm。当样品在室温避光条件下放置过夜后，原始谱图可恢复图4a）它表示热致螺旋反转过程，该过程将不稳定-1b 转化为稳定-1b。

为了研究马达1b在表面上的旋转运动，需制备表面固定的马达组装体MS-1b（MS = 表面马达）。首先将石英载片进行胺基功能化处理。随后，将石英载片浸入DMF溶液（10-4 M）中含1b的溶液，在室温下静置过夜。所得石英载片依次用DMF、水和甲醇冲洗。制备好的石英载片随后用于紫外/可见光吸收研究。MS-1b的紫外/可见吸收光谱（实线）如图5b所示。由光谱可见，其主要吸收带和吸收特征与溶液中观测结果相似（图5a）。光谱中还显示出马达特征吸收峰（420 nm）以及PBI的特征吸收峰（456 nm、490 nm、524 nm）。这些吸收峰表明马达1b已成功固定在胺基修饰的表面上。此外，对石英载片进行15分钟的光照后，观察到与溶液体系相似的光谱变化，表明不稳定的MS-1b已生成。

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图1：目标分子1b的合成路线。 该路线显示了每一步所使用的试剂、溶剂和反应条件。 

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图 2：（a）固定于表面用于观测单向旋转的 F0F1-ATPase 结构示意图（经许可转载12）。（b）用于单分子成像的合成表面结合光驱动分子马达的概念设计。 

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图3：表面固定的分子马达1b的结构，其在马达核心与PBI标记之间带有刚性长臂。 

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图4: 脂肪族区域的 1H-NMR 谱图，化合物 1b（CD2Cl2, -20 °C，c = 10-3 M) (a) 稳态-1b，辐照前（365 nm）。b) 光照后的光稳态混合物。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图5：紫外/可见吸收光谱。 （a）分子马达1b（CH2Cl2，0 °C）在光稳态（PSS）下稳定异构体（实线）与不稳定异构体（虚线）的紫外/可见吸收光谱。（b）MS-1b（石英，4 °C）在光照前（实线）和光照后（虚线）的紫外/可见吸收光谱。 

讨论

该项目涉及大量的合成工作，因此最关键的步骤是最终分子的有机合成。在整个合成路线中，巴顿-凯尔科反应是关键步骤，因为该反应形成了分子马达的核心双键。目前已有多种方法用于构建此类结构。本文采用重氮-硫代酮偶联法，并分别将上半部分和下半部分制备为重氮化合物和硫代酮化合物。硫代酮和重氮化合物通常在空气中不稳定，因此该反应必须在严格惰性气氛下快速操作。

目前将分子马达固定在表面上的方法主要基于双足体系。然而，先前设计的双足马达由于分子间相互作用而阻碍了其异构化过程。此外，部分双足体系实例在固定前还需额外活化步骤。本方法采用四足方式实现这一目标，可在表面上为分子马达提供牢固的附着，并确保足够的空间隔离。

该方法的一个局限性在于荧光标记的选择。仅允许使用具有特定波长的染料，因为分子马达的旋转由365 nm波长触发，因此染料的发射波长不应与此重叠。此外，本方案中所描述的合成路线在合成目标分子时需要多步反应，且部分步骤需在较剧烈的条件下才能完成。未来若需获得更先进的单分子成像分子，可能需要设计更为简便的合成路径。

综上所述，首次报道了一种高度功能化的光驱动分子马达的设计与合成。同时讨论了合成过程中的若干细节。此外，还展示了将该分子马达接枝到石英片表面的方法，所得样品可进一步用于单分子运动的可视化检测14。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了荷兰科学研究组织（NWO-CW）、欧洲研究理事会（ERC；高级资助编号 694345，授予 B.L.F.）以及教育、文化与科学部（引力计划编号 024.001.035）的经费支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
核磁共振波谱仪VarianAMX400用于质子核磁共振研究
有机反应试剂Sigma分析纯有机反应用试剂
硅胶 Merck230-400目 ASTM快速柱色谱 
溶剂Acros分光光度级 快速柱色谱 
紫外灯ENB280C用于紫外-可见光照射
紫外-可见吸收光谱仪JASCOV-630 紫外-可见测量

参考文献

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