单粒子冷冻电子显微镜在结构中测定脂质敏感分通道 trpc3 的表达与纯化

摘要

该协议描述了用低温电子显微镜测定离子通道结构的技术, 包括用于以最小的努力和毒性在哺乳动物细胞中有效表达基因的杆菌病毒系统, 蛋白质提取、纯化、和质量检查, 样品网格的制备和筛选, 以及数据的收集和处理。

摘要

典型 trp 亚家族的瞬态受体电位通道 (trpc) 是非选择性阳离子通道, 在钙稳态中发挥着至关重要的作用, 特别是在商店操作的钙进入, 这对于保持钙的适当功能至关重要。突触囊泡释放和细胞内信号通路。因此, trpc 渠道与各种人类疾病有关, 包括心血管疾病, 如心肌肥大, 神经退行性疾病, 如帕金森病, 和神经疾病, 如脊柱小脑共济失调。因此, trpc 通道是人类疾病中潜在的药理靶点。然而, 在这些通道中门控的分子机制仍不清楚。在结构测定研究中, 特别是对于哺乳动物膜蛋白, 如 trpc 离子通道, 获得大量稳定、均匀和纯化蛋白的困难一直是一个限制因素。在这里, 我们提出了一个协议, 大规模表达哺乳动物离子通道膜蛋白使用一个修改后的巴库氏病毒基因转移系统和纯化这些蛋白质的亲和力和大小排除色谱。我们进一步提出了一个协议, 收集单粒子冷冻电子显微镜图像从纯化的蛋白质, 并使用这些图像来确定蛋白质的结构。结构确定是了解离子通道中门控和功能机制的有力方法。

引言

钙参与大多数细胞过程, 包括信号级联, 转录控制, 神经递质释放, 和激素分子合成^1,2,3。细胞质游离钙的稳态维持对细胞的健康和功能至关重要。细胞内钙稳态的主要机制之一是储存钙进入 (sace), 在这个过程中, 储存在内质网 (er) 中的钙的耗尽会触发质膜上离子通道的打开, 以促进er 钙的补充, 然后可以在进一步信号^4,5,6中使用。瞬态受体电位通道 (trpc) 是属于 trp 超家族的透钙通道, 已被确定为 soce^7、8、9的主要参与者。

在 trpc 家族的7名成员中, trpc3、trpc6 和 trpc7 构成了同源亚群, 它们在被脂质二级信使二丙烯酸酯 (dag) 激活的能力上是独一无二的, 而二维信使二丙烯酸甘油是脂质信号的降解产物磷脂酰肌醇 4, 5-双磷酸 (pip2)^10,11。trpc3 在平滑肌和大脑的大脑和小脑区域中高度表达, 在这些区域中, 它在影响神经传递和神经发生的钙信号中发挥着至关重要的作用。trpc3 功能障碍与中枢神经系统疾病、心血管疾病和某些癌症 (如^卵巢腺癌^14、15、16) 有关。因此, trpc3 有望成为治疗这些疾病的药物目标。由于对其分子激活机制, 包括脂质结合位点 17^、18缺乏了解, 开发针对 trpc3 的有针对性的药物受到限制。我们报告了人类 trpc3 通道 (htrpc3) 及其两个处于封闭状态的脂质结合位点的第一个原子分辨率结构, 为这些机制提供了重要的见解¹⁹。

高分辨率膜蛋白结构的关键因素是获得高质量的蛋白质。相应的表达筛选和纯化条件的必要, 以获得高质量的蛋白质可能是一个耗时和昂贵的努力。在这里, 我们提出了一个协议, 详细描述了我们如何确定 htrpc3 的表达和纯化的最佳条件, 它在我们的初始筛选中表现不佳。我们就如何排除故障和优化蛋白质行为提出了几个要点, 为我们的低温电子显微镜 (低温 em) 研究奠定了坚实的基础。我们使用了由 gouaux 和他的同事开发的改良的杆菌病毒产生载体 (peg), 该载体经过优化, 用于在哺乳动物细胞^{20 中}筛选检测和高效生成巴库索病毒。这种表达方法适用于哺乳动物细胞膜中蛋白质的快速和具有成本效益的过度表达。我们将此向量的使用与基于荧光检测大小排除色谱 (fsec) 预置方法²¹结合起来。该方法采用绿色荧光蛋白 (gfp) 标记融合到感兴趣的结构中, 并提高了目标蛋白在小的全细胞溶解性样品中的可视化。这样就可以在不同的洗涤剂和添加剂的存在下筛选蛋白质稳定性, 并具有稳定的热稳定性突变, 并允许使用少量细胞进行小规模瞬态转染。通过这种方式, 在进入大规模蛋白质纯化之前, 可以快速筛选多种条件。在表达、筛选和纯化之后, 我们提出了一种从低温 em 中获取和处理图像的协议, 以生成蛋白质的新结构测定。我们相信, 这里描述的方法将作为一个通用的协议, 用于 trp 通道受体和其他膜蛋白的结构研究。

方案

1. dh10α组成细胞转化为 bacm中 dna

1. 合成感兴趣的基因, 并将其亚化为一个修改版本的 peg 向量, 其中包含一个双链球标记、一个 his8 标记和 gfp, 在 n 终点 (pfastbaci) 20 处有凝血酶^裂解部位。
2. 通过在 1.5 ml 管中加入5纳克含有所需基因的质粒, 在 pFastBacI 中加入50μl 的 dh10α细胞, 并在冰上孵育 10分钟, 从而转化合格的细胞。在42°c 下, 热冲击细胞45秒。在管中加入200μl 的超最优肉汤, 并在37°c 时在225转/分的轨道振动台孵育4-8小时。
3. 在 bacme/lb 琼脂板上的细胞板 5μl (50μgml 卡那霉素, 7μgml 庆大霉素、10μgml 四环素、100μgml blu-gal 和40μgml 异丙基β-d-1-硫代卡醇 [iptg]、琼脂)。
4. 在37°c 下将板材培育48小时。
   注: 蓝加仑指示染色, 仍表示 lz (矢量插入不成功), 允许选择白色 (成功转换) 菌落。
5. 仔细选择一个孤立的白色群体, 避免任何与蓝色菌落接触的白色菌落, 并在225rpm 的轨道振动台的37°c 下, 在6毫升的 bacml b 中长出细胞 (50μgl 卡那霉素, 7μgl 庆那霉素, 10μgml 四环素)。

2. 分离 bacm中 dna 的细菌制剂

1. 要分离杆菌 dna, 在 2880 x g 的情况下, 将大肠杆菌细胞转至大肠杆菌细胞 10分钟。
2. 从微型制备试剂盒 (见材料表) 中移液中丢弃上清液并重新悬浮细胞再悬浮液中的颗粒。确保颗粒完全和均匀地悬浮。然后, 将细胞悬浮液转移到 1.5 ml 管中。
3. 从微型制备试剂盒中加入200μl 的细胞裂解溶液, 并通过倒置管几次进行混合。在室温下孵化 5分钟 (rt), 使细胞裂解。从微型制备试剂盒中加入200μl 的中和溶液, 通过倒置管混合几次, 以阻止裂解反应。
4. 在桌面离心机中, 在 21, 130 x g处旋转10分钟。在2毫升管中收集600μl 的上清液。加入600μl 苯酚: 氯仿: 异戊醇溶液 (见材料表), 并彻底混合, 从细胞裂解产物的剩余部分中提取 dna。
   注意: 苯酚: 氯仿: 异戊醇溶液是有毒的吸入, 与皮肤接触, 如果吞咽。它可以引起化学烧伤, 并可能致癌。戴上手套, 穿上带纽扣的实验室外套。在通风柜里工作。适当处置这些危险废物。
5. 在 21130 x g 的桌面离心机中旋转管10分钟。两个独立的液相将是可见的。小心地将上水相的300μl 转移到新的管中。加入600μl 的100% 乙醇来清洗 dna。轻轻倒置管混合。
   注: 不要涡流, 因为这可以剪切 bacm体 dna。
6. 将其放入-20°c 的冰柜中 10分钟, 在桌面离心机中向下旋转 10分钟, 在 21, 130 x g 。丢弃上清液并保存 dna 颗粒。
7. 加入1毫升的70% 乙醇来清洗颗粒。轻轻倒置管混合。在桌面离心机中旋转 10分钟, 21, 130 x g 。丢弃上清液, 让颗粒干燥约 5分钟, 或直到管中看不到液体, dna 颗粒变为半透明。
8. 将干颗粒重新注入50μl 的无菌、无 dnase、去离子水中。测量 dna 浓度。
   注: 不要冻结 bacmacm待 dna。在4°c 下存放长达数天。

3. bacid 对 Transfection 昆虫细胞的转染, 以生产 p1 杆状病毒

1. 种子 0.9 x 10 6 sf9 细胞/在2毫升的适当培养基 (见材料表) 在6孔组织培养板的每口井。在27°c 下培养细胞 20分钟, 以促进与板材的附着。
   注意: 细胞培养是一种潜在的生物危害。使用无菌技术在经批准的层流罩中工作, 并在进行实验之前检查机构和政府的建议防护服和适当处置废物的准则。
2. 连接后, 为在无菌管内转染的6个井板的每一口井加入8μl 转染试剂 (见材料表) 100μl 介质。在单独的无菌管中加入6μg 的 bacm中 dna, 加入100μl 培养基。在 rt 孵育 5分钟, 将两种溶液结合起来, 在 rt 孵育45分钟。
3. 将6口井中的介质更换为2毫升的新鲜培养基。将上一步的混合物加入到每个井 (每口井 200μl) 中。轻轻摇晃板, 以确保转染溶液混合到介质中。
   注: 不要旋转或摇晃板, 因为这会导致细胞分离。
4. 在27°c 加湿孵化器中孵育细胞 5 d (120小时)。在收获前检查 gfp 荧光, 以验证病毒在很大比例的细胞中产生;如果百分比较低, 请根据需要延长孵育时间 (参见图 1c)。
5. 收集含有 p1 病毒的上清液 (每口井约2毫升)。使用3毫升注射器和小0.2μm 过滤器将含有 p1 病毒的培养基过滤到2毫升管中。添加不育的胎儿牛血清 (fbs) 的最终浓度为1%。
   注: 此 p1 病毒库存应存储在 4°c, 并防止光线照射。

4. sf9 昆虫细胞感染 p1 杆状病毒产生 p2 杆状病毒

1. 在适当的培养基中 (见材料表), 在足够大的扁平底部 erlenmeyer 培养瓶中, 以 0.8-0.9 x¹⁰ 6 细胞的浓度制备 200 ml (或所需体积) 的 sf9 细胞。
   注: 对于悬浮培养, 使用的体积不应超过烧瓶总容量的40%。
2. 加入 1:2500 p1 病毒库存比例 (v/v), 从3.5 到 sf9 细胞悬浮培养。在115个小时的轨道振动台中, 在115级的轨道振动台中进行最佳病毒表达 (通常为 48-120小时, 取决于蛋白质结构)。
   注: 相对病毒表达可以通过查看培养物样本中病毒的 gfp 荧光来确定。
3. 在 1 1 520 x g处离心细胞悬浮液 40分钟, 并收集含有 p2 病毒的上清液。使用一次性0.2μm 过滤器过滤上清液。将 fbs 添加到0.5% 的最终浓度。
   注: 这种 p2 病毒的库存应储存在 4°c, 并防止光线。
4. 使用 sf9 简易细胞或病毒计数器获得 p2 病毒的滴度。

5. hek293 哺乳动物细胞与 p2 杆状病毒对大规模蛋白表达的感染

1. 在表达培养基中, 以 3.5-3.8 x 10 6 细胞/ml 的浓度 (见材料表) 中的浓度为 3.5-3.8 x 10 6 细胞/ml^,并以 1% ( v/b)的浓度, 准备一个理想的 hk293 哺乳动物细胞悬浮培养量 (建议为 4-6 l)v) 无菌 fbs 在挡板底部 erlenmeyer 培养瓶足够的大小。
   注: 对于悬浮培养, 使用的体积不应超过烧瓶总体积的40%。
2. 从步骤4.3 到 hek293 细胞悬浮培养, 加入8% 的 p2 病毒库存溶液。在37°c 时在135转/分的轨道振动台中进行孵化。
3. 在感染后12-18 小时加入 10 mm 丁酸钠。在30°c 下培育最佳蛋白表达时间 (通常为 36-72小时)。
4. 在 2 880 x g 的情况下离心20分钟收获细胞. 每公升收获的细胞, 通过在大约100毫升的三缓冲盐水 (tbs) 中重新悬浮清洗细胞。在 2, 880 x g处再次离心 20分钟, 并收集细胞颗粒。
   注: 协议可能会在此处暂停。细胞颗粒可在液氮中进行冷冻, 并在-80°c 下储存至纯化。
   注意: 液氮可能会导致低温烧伤或伤害。它可能会导致冻伤。它可能会取代氧气并导致快速窒息。戴冷绝缘手套和面罩。
5. 在不同的时间点收集小的1毫升收获, 并在4°c 时溶解 2小时, 在不同的洗涤剂和/或添加剂的存在下摇晃或搅拌。这些小的全细胞溶解性样品可以通过在 235xg的超离心澄清, 在4°c 下 10分钟, 并在大小排除色谱柱 (sec) 柱 (见材料表) 上作为30μl 样本运行, 以确定最佳时间。表达式和最佳的增溶条件。
   注: 就 htrpc3 而言, 这种筛选包括 ph 值为4.0-9.5 和盐浓度为 50-500 mm 的不同缓冲液;不同的离子成分 (如 mgcl₂或氯化钠);临界胶束浓度 (cmc) 值为 0.1-20 mm 的不同洗涤剂;还原添加剂, 如二硫醇、tris(2 羧基) 磷化氢和β-硫醇;和钙螯合添加剂乙二胺四乙酸 (edta)。

6. 冷冻细胞颗粒中 htrpc3 蛋白的纯化

1. 解冻含有 20 mm tris (ph 值 8.0) 的缓冲液中的颗粒, 500 mm 氯化钠、1 mm 苯基甲基磺酰氟 (pmsf)、0.8 微米的前列腺素、2μml 利妥芬酸、2 m 肽 a 和1% 的数宁, 每收获细胞100毫升缓冲液。解冻后, 通过移液或搅拌确保溶液的均匀性。允许在4°c 的烧杯中溶解 2小时, 浸泡在冰中, 搅拌杆旋转。
2. 在235.00xg 的超离心下, 在4°c 下, 以1小时的速度清除细胞碎片. 通过高效液相色谱 (hplc) 在 sec 色谱 (参见材料表) 上运行30μl 样本来验证蛋白质数量, 并通过 gfp 信号输出来可视化目标蛋白。
3. 在4°c 条件下, 用钴亲和性树脂将溶解性蛋白质 (上清液) 培养1-2小时。通过在 sec 色谱柱上运行30μl 样品来验证蛋白质与树脂的结合。
   注: 如果发生了蛋白质结合, gfp 标记的蛋白质靶标将保留在列上, 在流经中找不到。因此, 当流动在高效液相色谱法上运行时, 在与目标蛋白大小相对应的位置不会出现 gfp 信号。
4. 用10个柱体积的缓冲液 (20 mm tris、ph 值8.0、500 mm n运输l、15 mm 咪唑和0.1% 的数字素) 清洗树脂。通过在 sec 色谱柱上运行30μl 样本来检查蛋白质损失。
   注: 如果发生了列的蛋白质损失, gfp 标记的蛋白质目标将被发现在洗涤缓冲液已通过列。因此, 当洗涤缓冲液在高效液相色谱上运行时, gfp 信号将出现在与目标蛋白大小相对应的位置。如果发生蛋白质丢失, 可能需要降低洗涤缓冲液的咪唑浓度, 以防止干扰他的标签结合到亲和力柱。
5. 用缓冲液 (20 mm tris, ph 值 8.0, 500 mm ncl, 250 mm 咪唑, 0.1% digitonin)。以1:20 摩尔比添加凝血酶 (将 gfp 标记切割), 并在洗脱样品中添加 10 mm edta (htrpc3 稳定剂), 在4°c 下孵育3小时。检查蛋白质是否已被洗脱, 方法是在 sec 列中运行90μl 稀释的样品 1:100, 并验证 gfp 信号在与目标蛋白质大小相对应的位置是否存在。
   注: 此时, 还可以查看洗脱中总蛋白的色氨酸信号。只有目标亲和力纯化的蛋白质将保留在洗脱中, gfp 和色氨酸信号在剖面上几乎相同。如果目标蛋白在洗脱中没有大量出现, 但在流动或洗涤中没有丢失, 则该蛋白很可能仍与色谱柱结合, 并可在缓冲液中使用浓度较高的咪唑进行洗脱。
6. 将洗脱液浓缩到 15ml 100k 离心过滤管 (见材料表) 中500μl 或更低, 方法是在4°c 下以5分钟的增量以 2 880 x g的速度旋转。通过在旋转之间上下移液来重新释放蛋白质, 以避免过度浓缩。
   注: 随着体积接近所需的最终体积, 离心机时间可能会缩短。
7. 将精矿加载到 sec 柱的缓冲液 (20 mm tris、ph 值8.0、500 mm ncl、1 mm edta 和0.1% 的数码) 上。运行。
8. 结合含有完整的 trpc3 四聚体的峰值分数, 通过紫外线吸收信号进行可视化, 并再次浓缩到至少 5 mg/ml 的最终浓度。

7. 用否定染色电子显微镜筛选蛋白质

1. 打开发光放电机。设置使用氩和氧气放电碳涂层栅格的程序, 在添加蛋白质溶液之前, 运行该程序, 使铜400目网格亲水的碳涂层。
2. 设置 5个40μl 滴的无菌水和 2个40μl 滴1% 的甲酸铀酯溶液 (在实验室薄膜、蜡纸或类似表面, 请参见材料表)。从步骤7.1 中取出栅格, 在黑暗面上加入2.5μl 的蛋白质样本 5 mg/ml (50-200μm), 让它坐1分钟。
3. 1分钟后, 用滤纸擦干网格。不要将滤纸直接触摸到网格表面;相反, 将纸张带到液滴边缘, 并允许毛细管作用将液体从网格拉入滤纸。
4. 将网格浸入第一滴水。用滤纸擦干, 用剩余的水滴和第一滴甲酸的乌兰尼酯重复干燥。让第二滴甲酸铀的水, 然后用滤纸干燥, 然后再坐1分钟。在储存前, 让电网完全干燥 (约 1分钟)。
   注: 此染色协议可能不适合所有蛋白质洗涤剂组合。如果上述步骤不能提供具有良好对比度的染色, 则应测试不同浓度的甲酸铀染色和不同的染色时间。
5. 在电子显微镜上对网格进行成像 (见材料表), 以检查蛋白质颗粒质量。确保显微图像显示大量粒子在一般外观和分布上是均匀的, 显示良好的对比度, 并与目标蛋白的预测大小相匹配。
6. 使用50-100 个微图 (参见数据处理–步骤 10) 生成初步的低分辨率二维 (2d) 分类, 以检查粒子是否代表单一一致结构的不同视图。
   注: 如上所述, 微图和足够质量的初步2d 类是一个强有力的指标, 表明该协议已充分优化为蛋白质纯化。在这一点上, 有必要对低温电磁网进行准备和筛选。

8. em 样品制备

1. 如步骤7.1 所述, 发光排放一个金洞碳网格 (见材料表)。
2. 将浓度为 htrpc3 的蛋白样品 (5mg/ml) 应用于栅格。在100% 湿度和4°c 下, 使用1的模糊力和5秒的等待时间将栅格降至 1.5秒, 然后使用玻璃化机将栅格浸入液氮冷却的液态乙烷中。
   注: 此处列出的湿度、温度、斑点力、印迹时间和等待时间用于作者的 htrpc3 研究¹⁹。它们可能需要改变, 以产生其他蛋白质和洗涤剂的最佳玻璃化冰。
3. 使用低温-em 显微镜 (见材料表) 和手动查看厚冰 (看起来更小、更暗的网格方块)、薄冰 (看起来更大、更亮的网格方块) 和中等冰的区域, 筛选冻结的网格以获得最佳的冰条件.
   注: 较厚的冰通常含有更多的颗粒, 而较薄的冰通常会产生更好的对比度和分辨率。使用手动筛选图像, 以确定哪些冰条件导致大量具有良好对比度和分辨率的单分散颗粒。一旦验证了良好的条件, 就转移到300kv 低温 em 显微镜上的图像采集。

9. em 数据收集

1. 电子显微镜上的电子显微镜以300千伏的名义放大倍率为 130, 000x 直接电子探测器, 采用自动采集程序, 在超分辨率计数模式下记录图像堆栈。
2. 将每个图像的剂量分割为40帧, 总曝光时间为 8秒, 每帧 0.2秒, 剂量率为 6.76 e^- --^- -------- ------------------------------------------------------------------------

10. em 数据处理

1. 使用数据处理软件 (见材料表) 24 实现对求和电影堆栈²²的运动校正, 并估计取消对焦值²³ .
2. 从微图中选取粒子。使用这些选取的粒子使用软件²⁴构造一个初始无参考的2d 分类。选择理想的2d 类平均值, 作为整个数据集的自动粒子拾取模板。
3. 手动检查自动拾取的颗粒的质量, 并去除不良颗粒。使用多轮二维分类来清理拾取的粒子。
4. 生成初始模型²⁵。研究对象二维选取粒子进行三维 (三维) 分类 (约5类), 采用 c1 对称性和初始重建低通滤波器60为参考模型。确定哪些类具有高分辨率特征, 并将粒子组合到此类中。
5. 进一步细化粒子使用局部细化与 c4 对称性 (在 htrpc3 的情况下) 应用和高分辨率极限为粒子^对齐设置为 4.5 26。

11. 模型建筑

1. 构建模型 (请参阅所使用软件的材料表)。对于 htrpc3, 使用瞬态受体电位甜瓜抑素 4 (trpm4) 结构蛋白数据库 (pdb) 5wp6 的跨膜域 (tmd) 作为指南²⁷。利用笨重的残留物和二级结构预测来指导新的建筑。
2. 将初始模型服从于二级结构约束的真实空间^{细化 28}。手动检查改进后的模型, 并根据需要重新修改 (请参阅所使用软件的材料表)。
3. 应用傅里叶壳相关 (fsc) 曲线计算最终模型与 em 映射之间的差异, 以验证细化结构。评估原子模型的几何形状 (请参阅所用软件的材料表)^29、30。

结果

图 1a 显示了 htrpc3 表达和纯化协议的示意图。图 1b 显示了 htrpc3 带理想白色菌落的图像, 类似于为 bacmacmt dna 纯化选择的基板。我们发现, 48小时是理想的明确蓝甲染色, 同时保持孤立的殖民地的存在。Sf9 荧光显示, htrpc3 p2 病毒的峰值产量是在 sf9 昆虫细胞感染 4 d 后出现的 (图 1c)。

从培养基中提取 p2 鲍鲁索病毒, 辅以1% 的 fbs, 用于感染 hek293 哺乳动物细胞的悬浮液。在病毒发生12-18小时后, 丁酸钠被添加到受感染的细胞中, 以促进蛋白质表达²⁰。然后在30°c 下对细胞进行额外的36小时孵育。fsec (

讨论

在过去几年里, 由于开发了新的摄像机和算法, 显著加快了蛋白质的结构测定, 而这些相机和算法并没有显著加快蛋白质的结构测定, 因此, 用低温 em 对蛋白质进行结构测定已经给结构生物学领域带来了革命性的变化。容易结晶, 特别是膜蛋白。尽管冷冻-em 技术最近取得了所有进展, 但在质量和数量上足以促进高质量成像的纯化蛋白的制备通常仍然是耗时、昂贵和具有挑战性的。如上述协议所述, 能够在各种纯化条件下快速表达和筛选多个基因结构, 从而通过快速、经济高效地生产高质量产品, 提高了这一过程的效率纯化蛋白, 用于低温-em 研究。

虽然这里描述的方法提供了一种方法, 以更低的成本净化大量的哺乳动物膜蛋白比通过直接转染和更快的速度比生成一个稳定转染的细胞系, 它有许多步骤, 每个步骤都必须优化提供高质量的蛋白质产量。在用于生产和纯化 htrpc3 的生化技术中, 有许多关键的步骤和检查点。第一个关键检查点是生产 bacmacmt dna。正如结果中所描述的, 理想的群体选择是产生高质量的蛋白质表达病毒的第一步。此外, 如果从所选择的菌落中纯化的杆菌 dna 浓度小于 1μgμl, 则产生的病毒...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pEG BacMam 载体 （pFastBacI）	addgene	31488
DH10α 细胞	Life Technologies	10361-012
S.O.C. 培养基	康宁	46003CR	用于转化 DH10α 细胞 用于 Bacmid
Bacmam 培养板	Teknova	L5919	用于培养转化的 DH10α 细胞
孵育摇床用于细菌细胞	Infors HT	Multitron 标准
昆虫细胞的孵育轨道摇床	Thermo-Fisher	SHKE8000
哺乳动物细胞的 Reach-in CO2 培养箱	Thermo-Fisher	3951
台式轨道摇床	Thermo-Fisher	SHKE416HP	用于哺乳动物细胞
的 Reach-in CO2 培养箱用于	细菌平板	VWR	1535
QIAprep 离心小量制备试剂盒	质粒提取和纯化	Qiagen	27106
苯酚：氯仿：异戊醇	DNA 提取	Invitrogen	15593031
用于 Sf9 细胞	Life Technologies	12659017	昆虫细胞用于生产病毒
Sf-900 培养基	Gibco	12658-027	昆虫细胞培养基
FBS	Atlanta Biologicals	S11550
Cellfectin II	转染昆虫细胞	Gibco	10362100
lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027	用于转染乳腺细胞
0.2 mm 针头过滤器	VWR	28145-501	用于过滤 P1 病毒
0.2 mm 过滤瓶 500 mlresevoir	Corning	430758	用于过滤 P2 病毒
锥形瓶（平底 2 L）	Gene Mate	F-5909-2000	用于培养昆虫细胞
锥形瓶（挡板 2 L）	Gene Mate	F-5909-2000B	用于哺乳动物细胞培养
Nanodrop 2000 分光光度计	Thermo-Fisher	ND-2000	用于测定 DNA 和蛋白质浓度
HEK293	ATCC	CRL-3022	用于产生蛋白质的哺乳动物细胞
Freestyle 293 表达培养基	Gibco	1238-018	用于蛋白质表达的哺乳动物细胞培养基
丁酸钠盐	Acros	263195000	用于扩增蛋白质表达
PMSF	Acros	215740500	来自
牛肺的蛋白酶抑制剂抑肽酶	Sigma-Aldrich	A1153-100MG	蛋白酶抑制剂
酸亮肽素	Sigma-Aldrich	24125-16-4	蛋白酶抑制剂
胃蛋白酶抑制剂 A	Fisher Scientific	BP2671-250	蛋白酶抑制剂
洋地黄皂苷	EMD Millipore	300410	去污剂 - 溶解膜
咪唑	Sigma	792527	从填料柱中洗脱蛋白质
TALON 树脂	Clonetech	635504	，用于通过 His 标签
superose6 incease 柱	GE	29091596; 29091597	用于 HPLC 和 FPLC
突出 模块化 HPLC 系统	岛津	见下文
控制器模块	"	CBM20A
溶剂输送系统	"	LC30AD
荧光检测器	"	RF20AXS
带冷却功能的自动进样器	"	SIL20ACHT
纯 FPLC 系统，带分馏器	Akta
凝血酶 （α）血液	学技术公司	HCT-0020 用于	裂解 GFP 标签
Amicon Ultra 15 mL 100K 离心过滤管	Millipore	UFC910008	用于浓缩蛋白质
EDTA	Fisher	E478500	用于稳定蛋白质
400 目碳涂层铜网格	Ted Pella Inc.	01754-F	用于负染色
Quantifoil 孔碳网格（金，1.2/1.3 μm 尺寸/孔间距，300 目）	电子显微镜科学	冷冻电	Q3100AR1.3
Vitrobot Mark III	FEI		用于通过液态乙烷冷冻液氮制备样品网格
	Dura-Cyl	UN1977
乙烷气体	Airgas	UN1035
Solarus 等离子系统	Gatan	950 型	，用于清洁网格样品冷冻
Tecnai Spirit 电子显微镜	FEI		用于负染色 EM 成像
Talos Arctica 电子显微镜	FEI		用于冷冻电镜网格的筛选和低分辨率成像
Titan Krios 电子显微镜	FEI		用于高分辨率冷冻电镜成像
软件
Gautomatch 软件	http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/		从显微照片中挑选颗粒
Relion 2.1 软件	https://github.com/3dem/relion		构建 2D 和 3D 分类
CryoSPARC 软件	https://cryosparc.com/		生成初始结构模型
Frealign 软件	http://grigoriefflab.janelia.org/frealign		细化粒子
Coot 软件	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/		构建模型
MolProbity 软件	http://molprobity.biochem.duke.edu/		评估原子模型的几何形状
SerialEM 软件	http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/		用于自动串行图像堆栈采集
MortionCor2 软件			用于对总和电影堆栈进行运动校正
GCTF 软件	https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/		用于测量电影堆栈中的散焦值
Phenix.real_space_refine 软件	https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html		用于初始 3D 模型的真实空间优化