扫描电子显微镜（SEM）分析是辅助物种鉴定或表型区分的有效方法。本实验方案描述了检测三种代表性生物体特定形态学细节的方法，可广泛适用于多种生物体及组织类型的特征观察。
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本文内容
摘要
摘要
扫描电子显微镜（SEM）是一种广泛应用的技术，已被用于研究从单个蛋白质到细胞、组织、细胞器乃至完整生物体等多种生物样本。本实验方案重点介绍两种化学干燥方法——六甲基二硅氮烷（HMDS）和叔丁醇（TBA），及其在利用扫描电子显微镜观察原核生物与真核生物中的应用。本文详细描述了固定、洗涤、脱水、干燥、制片、溅射镀膜及成像三种生物体的操作步骤：蓝细菌（Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. 和一种未知种），两种来自眼虫属的裸藻 单形亚目 (M. aenigmatica 和 M. pseudopyrum），以及果蝇（黑腹果蝇本实验方案旨在描述一种快速、经济且简便的方法，用于获取有关样本结构、大小及表面特征的详细信息，可广泛应用于多种生物体的形态学评估。成功实施本方案将使研究者能够通过将这些技术应用于自身研究体系，利用扫描电镜（SEM）对样本进行可视化观察。
引言
扫描电子显微镜（SEM）利用聚焦的高能电子束激发样品产生二次电子，从而生成能够显示样品形态和表面形貌的图像1。SEM可用于直接测定样品的物理尺寸、表面结构以及三维形状，与光学显微镜相比，具有更高的分辨率和更大的景深。另一种电子显微镜（EM）技术——透射电子显微镜（TEM）——则利用穿过样品的聚焦电子束，生成反映样品内部结构精细细节的图像。尽管TEM的分辨率高于光学显微镜和SEM，能够分辨小至单个原子的结构，但它存在三个主要缺点：样品制备过程复杂、视场较小以及景深较浅2,3。虽然已有其他使用SEM观察特定细胞、细胞器或组织的可视化实验方案4,5,6,7,8,9,10，但本实验方案的独特之处在于，我们所描述的方法可广泛应用于多种生物体的形态学评估。
扫描电子....
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方案
1. 准备与固定
- 制备蓝细菌。
- 在F/2培养基中培养单藻类培养物24,25 在28 °C、14小时光照/10小时黑暗的条件下培养。转移足够量的培养物至1.5 mL微量离心管中，静置15分钟后，使细菌沉淀体积约为0.05 mL。吸除培养基，加入1.5 mL固定液（1.25% 戊二醛，0.1 M 磷酸缓冲液，pH 7.0），轻轻颠倒混匀数次，于4 °C过夜孵育。
- 用玻璃移液管将固定后的细胞转移至10 mL过滤装置中（图1）包含一个带有0.8或0.2 µm孔径的聚碳酸酯25 mm滤膜，具体孔径取决于细胞大小。用橡胶塞密封侧管和漏斗，以将培养物保留在漏斗中。移除两个橡胶塞后，通过滤瓶上的轻柔真空去除固定剂。
注意：如果聚碳酸酯滤膜上的细胞密度不理想，可调整起始培养物的使用量。
- 制备单细胞藻类（眼虫藻）。
- 在AF-6培养基中培养单藻培养物26 150 mL L-1 市售土壤-水培养基加入培养体系中，在22 °C、14:10小时光照-黑暗循环条件下培养。转移2 mL低密度（OD600 < 用玻璃移液管将0.5）培养....
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结果
蓝藻是一类原核生物，在全球碳、氧和氮循环中起着关键作用28,29。据估计，蓝藻约有6000个物种30，其中大多数具有胶质鞘，可包裹细胞并将细胞彼此连接或与其他结构相连31，这些结构特征连同细胞形态可通过显微镜观察分辨32。细胞大小、形态及所含色素可用于区分不同物种，在水生环境中可表现为蓝藻“水华”28。现代蓝藻分类结合了光学显微镜、透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）所能观察到的所有形态特征，并整合分子数据进行分类33。与蓝藻的胶质鞘类似，眼虫类物种的表膜条带也有助于系统发育分析。眼虫类是一类具有高度形态和行为多样性的水生鞭毛虫，扫描电镜分析已被证明在区分不同物种的分类中具有重要价值。具体而言，眼虫类在质膜.......
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讨论
本文介绍了一种利用扫描电镜（SEM）获取三类生物体外部形态特征详细信息的实验方案，其他研究者可将其应用于多种生物体或组织特征的观察。在该方案的每个步骤中，均可能存在潜在的误差点，下文将对此进行详细讨论。
虽然此处给出的固定剂和洗涤液用量是具体的，但通常情况下，固定剂和洗涤液体积应为样本体积的5-10倍。所有固定、洗涤和脱水的时间均基于我们的经验；若出现问题， 例如， 样品出现皱缩时，可能需要延长每一步脱水或干燥的时间。根据您的单细胞样品，可能需要同时进行戊二醛固定和四氧化锇后固定。如果在蓝细菌实验步骤1.1.2之后需要进行双重固定，则用等量的2% OsO₄覆盖样品4 使用相同的缓冲液，并从单细胞实验步骤的1.2.2步骤开始继续操作。根据未在此展示的研究结果，我们发现 果蝇 可在麻醉后直接放入固定液，或在-20 °C条件下长期保存于微量离心管中冷冻，之后再放入固定液，两种方法最终成像质量无差异。
在洗涤和脱水步骤中，必须缓慢地依次经过梯度乙醇系列，不得跳过任一指定浓度。如.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由中密歇根大学研究与研究生教育办公室向 MLS 提供的资助以及向 MAK 提供的暑期学者奖资助。蓝细菌由德克萨斯农工大学柯柏斯克里斯提分校海岸研究中心下属的 Zimba 与浮游生物实验室提供。&M大学科珀斯克里斯蒂分校。眼虫类生物由密歇根州立大学Triemer实验室提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 金–钯 | Ted Pella, Inc. | 91212 | |
| 银导电胶 503 | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | |
| Whatman Nuclepore 径迹蚀刻膜；直径 25 mm，孔径 8 μm，聚碳酸酯材质 | Sigma | WHA110614 | |
| Whatman Nuclepore 径迹蚀刻膜；直径 25 mm，孔径 0.8 μm，黑色聚碳酸酯材质 | Sigma | WHA110659 | |
| Whatman Nuclepore 径迹蚀刻膜；直径 25 mm，孔径 0.2 μm，聚碳酸酯材质 | Sigma | WHA110606 | |
| 铝制称量皿 | Fisher Scientific | 08-732-100 | |
| 铝制样品台（12 mm） | Electron Microscopy Sciences | 75210 | |
| 铝制样品台（25 mm） | Electron Microscopy Sciences | 75186 | |
| 粘附标签 | Electron Microscopy Sciences | 76760 | |
| 导电碳粘附标签 | Electron Microscopy Sciences | 77825 | |
| F/2 培养基 | 德克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养中心 | https://utex.org/products/f_2-medium | 未提供目录号 — 请参见链接 |
| AF6 培养基 | Bigelow — 国家海洋藻类与微生物组中心 | https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf | 未提供目录号 — 请参见链接 |
| 土壤浸出液培养基 | Carolina Biological Supply Company | 153785 | |
| 聚乙二醇叔辛基苯基醚（Triton X-100） | VWR | 97062-208 | |
| Hummer 6.2 溅射镀膜仪 | Anatech USA | http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 | 未提供目录号 — 请参见链接 |
| Hitachi 3400N-II 扫描电子显微镜 | Hitachi | https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1 -2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA nfD_BwE | 该公司似乎已不再销售此型号 |
参考文献
- Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , 2nd ed, Jones and Bartlett Learning. Boston. (1999).
- Goldstein, J., et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , Springer. New York. (2003).
- Egerton, R. F.
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重印与许可
