用于扫描电子显微镜（SEM）形态学分析的原核与真核生物化学干燥制备

摘要

扫描电子显微镜（SEM）分析是辅助物种鉴定或表型区分的有效方法。本实验方案描述了检测三种代表性生物体特定形态学细节的方法，可广泛适用于多种生物体及组织类型的特征观察。

摘要

扫描电子显微镜（SEM）是一种广泛应用的技术，已被用于研究从单个蛋白质到细胞、组织、细胞器乃至完整生物体等多种生物样本。本实验方案重点介绍两种化学干燥方法——六甲基二硅氮烷（HMDS）和叔丁醇（TBA），及其在利用扫描电子显微镜观察原核生物与真核生物中的应用。本文详细描述了固定、洗涤、脱水、干燥、制片、溅射镀膜及成像三种生物体的操作步骤：蓝细菌（Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. 和一种未知种），两种来自眼虫属的裸藻 单形亚目 (M. aenigmatica 和 M. pseudopyrum），以及果蝇（黑腹果蝇本实验方案旨在描述一种快速、经济且简便的方法，用于获取有关样本结构、大小及表面特征的详细信息，可广泛应用于多种生物体的形态学评估。成功实施本方案将使研究者能够通过将这些技术应用于自身研究体系，利用扫描电镜（SEM）对样本进行可视化观察。

引言

扫描电子显微镜（SEM）利用聚焦的高能电子束激发样品产生二次电子，从而生成能够显示样品形态和表面形貌的图像¹。SEM可用于直接测定样品的物理尺寸、表面结构以及三维形状，与光学显微镜相比，具有更高的分辨率和更大的景深。另一种电子显微镜（EM）技术——透射电子显微镜（TEM）——则利用穿过样品的聚焦电子束，生成反映样品内部结构精细细节的图像。尽管TEM的分辨率高于光学显微镜和SEM，能够分辨小至单个原子的结构，但它存在三个主要缺点：样品制备过程复杂、视场较小以及景深较浅^2,3。虽然已有其他使用SEM观察特定细胞、细胞器或组织的可视化实验方案^{4,5,6,7,8,9,10}，但本实验方案的独特之处在于，我们所描述的方法可广泛应用于多种生物体的形态学评估。

扫描电子显微镜（SEM）已广泛应用于无机材料的检测，包括纳米颗粒^11,12、聚合物¹³，以及在地质学、工业和材料科学中的众多应用^14,15,16。在生物学领域，SEM 长期以来被用作检测生物样品的方法，样品范围从单个蛋白质到完整生物体^17,18。SEM 具有特殊价值，因为其可提供形态学表面细节，从而推动科学发现。SEM 分析是一种快速、经济且简便的方法，可用于获取多种生物样品在结构、尺寸和表面特性方面的详细信息。

由于扫描电子显微镜（SEM）通常在高真空（最低10^-6 Torr）下运行，以维持高速电子束的相干性，因此样品室中不允许存在任何液体（如水、油、醇类），因为液体将阻碍真空的形成。因此，所有用于SEM观察的样品必须经过脱水处理，通常采用梯度乙醇系列脱水，再通过干燥工艺去除乙醇。用于SEM的生物组织干燥方法有多种，包括空气干燥、冷冻干燥、临界点干燥（CPD）装置干燥，或使用叔丁醇（TBA）或六甲基二硅氮烷（HMDS）进行化学干燥^19,20,21,22。干燥方法的选择通常依赖经验，因为不同生物样品对各种干燥方法的反应可能各异。对于特定样品，上述所有方法均可能适用，因此比较每种方法的优缺点有助于选择最合适的技术。

尽管在室温下或干燥烘箱（60 °C）中空气干燥样品是最简单的方法，但大多数生物样品会出现由干燥引起的损伤，如皱缩和塌陷，导致样本形变。冻干法同样可从样品中去除水分（或冰），但需要先将样品快速冷冻，再置于真空条件下以升华去除冰 通过 升华过程可能会损坏样品。此外，操作者必须能够使用冻干机。扫描电镜（SEM）样品脱水最常用的方法是临界点干燥（CPD）。在CPD过程中，样品中的乙醇被液态二氧化碳（CO₂）取代₂）并且，在被称为临界点的特定温度和压力条件下（31.1 °C 和 1,073 psi），CO₂ 在不产生表面张力的情况下使样品干燥，从而有效保持样品的形态和结构特征。尽管临界点干燥法（CPD）通常是标准方法，但其存在若干缺点：首先，该过程需要使用临界点干燥仪，这种设备不仅价格昂贵，还需使用液态二氧化碳；其次，可干燥样品的尺寸受限于临界点干燥仪腔室的大小；第三，CPD过程中液体的置换可能引起湍流，从而对样品造成损伤。

化学干燥法相较于临界点干燥法（CPD）具有多种优势，正逐渐成为扫描电镜（SEM）样品制备中广泛应用的一种合适替代方法。使用叔丁醇（TBA）和六甲基二硅烷（HMDS）等化学脱水剂，可提供一种快速、经济且操作简便的替代方案，同时仍能保持样品的结构完整性。我们近期的研究表明，在成年果蝇（Drosophila）视网膜组织的干燥过程中，采用临界点干燥法或叔丁醇（TBA）作为干燥方法，其组织完整性及最终成像质量并无差异²³。与临界点干燥法不同，TBA和HMDS无需专用干燥仪器或液态CO₂，且对样品尺寸无限制。除获取相应化学品外，仅需标准化学通风橱及适当的个人防护装备（手套、实验服和护目镜）即可完成干燥过程。尽管TBA和HMDS均属易燃物质，但TBA的毒性更低，且成本更便宜（约为HMDS的三分之一）。

在本文中，我们介绍如何对三类生物体进行固定、洗涤、脱水、干燥、制片、喷镀和成像：蓝细菌（Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. 和一种未知的裸藻属物种），两种来自裸藻属的裸藻 单形藻 (M. aenigmatica 和 M. pseudopyrum），以及果蝇（黑腹果蝇）。这些生物在大小（0.5 µm 至 4 mm）和细胞多样性（单细胞至多细胞）方面具有广泛差异，但均易于进行扫描电镜（SEM）分析，仅需对样品制备步骤进行微小调整即可。本实验方案描述了利用化学脱水法结合扫描电镜分析技术观察三类生物形态学细节的方法，该方法可广泛适用于多种生物体及组织类型的观察。

方案

1. 准备与固定

1. 制备蓝细菌。
   1. 在F/2培养基中培养单藻类培养物^24,25 在28 °C、14小时光照/10小时黑暗的条件下培养。转移足够量的培养物至1.5 mL微量离心管中，静置15分钟后，使细菌沉淀体积约为0.05 mL。吸除培养基，加入1.5 mL固定液（1.25% 戊二醛，0.1 M 磷酸缓冲液，pH 7.0），轻轻颠倒混匀数次，于4 °C过夜孵育。
   2. 用玻璃移液管将固定后的细胞转移至10 mL过滤装置中（图1）包含一个带有0.8或0.2 µm孔径的聚碳酸酯25 mm滤膜，具体孔径取决于细胞大小。用橡胶塞密封侧管和漏斗，以将培养物保留在漏斗中。移除两个橡胶塞后，通过滤瓶上的轻柔真空去除固定剂。
      注意：如果聚碳酸酯滤膜上的细胞密度不理想，可调整起始培养物的使用量。
2. 制备单细胞藻类（眼虫藻）。
   1. 在AF-6培养基中培养单藻培养物²⁶ 150 mL L^-1 市售土壤-水培养基加入培养体系中，在22 °C、14:10小时光照-黑暗循环条件下培养。转移2 mL低密度（OD₆₀₀ < 用玻璃移液管将0.5）培养物转移至10 mL过滤装置中（图1) 包含一个带有8 µm孔径的聚碳酸酯25 mm滤膜。用橡胶塞密封侧管和漏斗，以将培养物保留在漏斗内。
      注意：如果聚碳酸酯滤膜上的细胞密度不理想，可调整起始培养物的使用量。
   2. 加入三滴4%四氧化锇（OsO₄）₄) 直接加入培养物中，孵育30分钟。移除两个塞子后，通过抽滤瓶轻轻抽真空以除去固定剂。
      注意：OsO₄ 是一种急性毒素（可通过皮肤、口服和吸入途径），对皮肤具有腐蚀性，对眼睛有损伤性，并可引发呼吸道致敏反应。OsO₄ 应在化学通风橱中操作，并使用适当个人防护装备，包括手套、实验服和护目用具。
3. 准备 黑腹果蝇 （果蝇）²³.
   1. 使用100%二氧化碳麻醉成虫。将麻醉后的成虫（约10至30只）放入小型塑料螺口小瓶或1.5 mL离心管中。
   2. 将麻醉的果蝇浸入1 mL固定液（1.25% 戊二醛，0.1 M 磷酸缓冲液，pH 7.2）中，在4 °C下固定2小时（或过夜）。若果蝇漂浮于固定液表面，可加入数滴2.5% 聚乙二醇叔辛基苯基醚以降低固定液的表面张力，使组织完全浸没。用玻璃移液管移除固定液。

2. 清洗与脱水

1. 洗涤并脱水蓝细菌。
   1. 用 5 mL 0.1 M 磷酸缓冲液（pH 7.0）在室温下洗涤固定后的样品 3 次，每次 10 分钟。洗涤过程中保持锥形瓶和漏斗的塞子塞紧以保留洗涤液。每次洗涤后，取下两个塞子，通过抽滤瓶上的轻柔负压去除洗涤液。
   2. 使用梯度乙醇系列在漏斗中对样品进行脱水处理，每次加入5 mL乙醇，持续浸没样品10分钟。梯度乙醇浓度依次为：25%、50%、75%、95%以及两次100%乙醇。保持烧瓶和漏斗加盖，以确保乙醇保留在漏斗内，防止挥发损失 通过 蒸发和通过滤膜的被动流动。
   3. 拔掉过滤瓶上的两个塞子，用温和的真空除去乙醇。将滤膜/样品转移至一次性铝制称量皿中，加入足量的100%乙醇以浸没样品，然后再进行干燥。
2. 清洗并脱水单细胞藻类（眼虫藻）。
   1. 用5 mL去离子水在室温下洗涤固定后的样品3次，每次10分钟。保持漏斗和烧瓶的塞子处于塞紧状态，以使洗涤液保留在漏斗中。每次洗涤后，取下两个塞子，通过轻柔抽真空从过滤烧瓶中移除洗涤液。
   2. 使用5 mL体积的梯度乙醇系列，在漏斗中对样品进行10分钟的脱水处理，同时保持样品持续浸没。梯度乙醇浓度依次为：25%、50%、75%、95%以及两次100%乙醇。保持烧瓶和漏斗加盖，以确保乙醇保留在漏斗内，防止挥发损失 通过 蒸发和通过滤膜的被动流动。
   3. 移除两个塞子后，通过过滤瓶上的温和真空除去乙醇。将滤膜/样品转移至一次性铝制称量皿中，皿内加入足量100%乙醇以完全覆盖样品，随后进行干燥。
3. 清洗并脱水 黑腹果蝇 （果蝇）
   1. 在1.5 mL微量离心管中，用1 mL 0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.2）于室温下洗涤固定样本3次，每次10分钟。每次洗涤后用玻璃移液管小心吸去缓冲液，注意勿吸出果蝇。
   2. 使用微离心管，依次用1 mL梯度乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理10分钟。乙醇浓度分别为：25%、50%、75%、80%、95%、100%。用玻璃移液器小心移除乙醇，注意勿将果蝇一并吸出。
   3. 将样本保留在1.5 mL微量离心管中，加入足量100%乙醇以浸没样本，再进行干燥。

3. 干燥

1. 使用叔丁醇（TBA）进行化学干燥²⁷。
   1. 将100%乙醇溶液替换为体积比1:1的TBA与100%乙醇混合溶液，处理20分钟。随后将1:1混合溶液替换为100% TBA，处理20分钟。重复此步骤两次。保持溶液温度在37 °C，以防止TBA冻结。
      注意：100% TBA的凝固点为25.5 °C；1:1混合溶液在室温下不会凝固。TBA具有可燃性，可引起严重眼刺激，吸入后有害，可能引起呼吸道刺激、嗜睡或头晕。操作TBA时应在化学通风橱中进行，并佩戴适当个人防护装备，包括手套、实验服和眼部防护装置。
   2. 若样品置于1.5 mL微量离心管中，将其转移至一次性铝制称量皿中。转移至铝制称量皿后，移除原有TBA，并加入足量新鲜的100% TBA以完全覆盖样品。在4 °C下冷冻TBA 10分钟。
   3. 将样品连同冷冻胶包一起转移至真空干燥器（钟罩式）中，以保持TBA处于冻结状态。使用旋转泵抽真空并维持真空状态，使冻结的TBA通过真空升华方式使样品干燥，至少持续3小时或过夜。
2. 使用六甲基二硅氮烷（HMDS）进行化学干燥²⁰。
   1. 将100%乙醇溶液替换为体积比1:2的HMDS与100%乙醇混合溶液，处理20分钟。随后将1:2混合溶液替换为体积比2:1的HMDS与100%乙醇混合溶液，处理20分钟。再将2:1混合溶液替换为100% HMDS，处理20分钟。重复此步骤一次。
      注意：HMDS具有可燃性，且为急性毒性物质（经皮途径）。操作HMDS时应在化学通风橱中进行，并佩戴适当个人防护装备，包括手套、实验服和眼部防护装置。
   2. 若样品置于1.5 mL微量离心管中，将其转移至一次性铝制称量皿中。转移至铝制称量皿后，将原有的100% HMDS替换为足量新鲜的100% HMDS以完全覆盖样品。
   3. 将样品转移至装有新鲜干燥剂（5–6 cm深）的塑料或玻璃非真空干燥器中，并置于化学通风橱内。或者，也可将样品直接放置于化学通风橱中，在容器上加盖松动的盖子（如一个盒子），以防止碎屑落入样品。让样品在通风条件下干燥12至24小时。

4. 封片

1. 固定蓝藻和眼虫藻。
   1. 在12 mm或25 mm铝制样品台的底部做好标记，以标明其上所放置的样品。若使用12 mm样品台，用洁净的剃刀刀片或解剖刀将带有干燥细胞的聚碳酸酯滤膜切成四等份；若使用25 mm样品台，则将整张滤膜直接放置于其上。
   2. 将每个滤膜置于粘附在载片顶部的胶带或碳导电胶上。
2. 安装 黑腹果蝇 （果蝇）
   1. 在铝制样品台底部做标记，以标明其上方放置的样品。
      在解剖显微镜下，使用精密镊子将干燥的果蝇放置于固定在样品台顶部的粘性胶带或碳导电胶带上所需的位置。
   2. 涂抹银导电胶， 即， 在样品台的外边缘涂上银漆。使用牙签将银漆与果蝇连接，以确保导电性。注意不要让银漆接触需要成像的区域。
   3. 将载片放入载片架盒中，并将打开的载片架盒置于干燥器内。让银浆至少干燥3小时，或过夜以获得最佳效果。

5. 溅射镀膜

1. 通过用氩气冲洗四到五次来准备溅射镀膜装置。如果湿度较高（i.e., 室内空气感觉潮湿，通常相对湿度约为50%），则进行六到七次冲洗。按照制造商的说明对载物台进行溅射镀膜。
2. 根据所用样品类型进行镀膜：
   1. 对于含有蓝细菌的滤膜，将计时器设置为直接溅射镀膜180秒。
   2. 对于含有真核藻类（i.e., 眼虫类）的滤膜，将计时器设置为直接溅射镀膜120秒，然后在三个侧面以45°角各镀20秒。
   3. 对于较大的样品（i.e., 果蝇头部），将计时器设置为直接溅射镀膜60秒，然后在每个侧面以45°角各镀30秒。
      注意：镀膜完成后，载物台应呈浅灰色。

6. 成像

1. 使用配备二次电子（SE）探测器的扫描电子显微镜对样品进行成像。
   1. 对于蓝细菌，采用以下设置：3–5 kV 加速电压（AC）、20–30 探针电流（PC）和 5 mm 工作距离（WD）。对于眼虫类，使用 3 kV AC、30 PC 和 5 mm WD。对于蝇类，使用 5 kV AC、30 PC 和 5 至 10 mm WD。
2. 根据待观察细节或物体的大小调整放大倍数。调节消像散器、光阑和焦距，直至获得清晰图像。按照扫描电镜制造商的说明，使用高分辨率设置采集图像。

结果

蓝藻是一类原核生物，在全球碳、氧和氮循环中起着关键作用^28,29。据估计，蓝藻约有6000个物种³⁰，其中大多数具有胶质鞘，可包裹细胞并将细胞彼此连接或与其他结构相连³¹，这些结构特征连同细胞形态可通过显微镜观察分辨³²。细胞大小、形态及所含色素可用于区分不同物种，在水生环境中常表现为蓝藻“水华”²⁸。现代蓝藻分类结合了光学显微镜、透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）所能观察到的所有形态特征，并整合分子数据进行综合分析³³。与蓝藻的胶质鞘类似，眼虫类物种的表膜条带也有助于系统发育关系的确定。眼虫类是具有丰富形态和行为多样性的水生鞭毛虫，扫描电镜分析已被证明在区分不同物种的分类中具有重要价值。具体而言，眼虫类...

讨论

本文介绍了一种利用扫描电镜（SEM）获取三类生物体外部形态特征详细信息的实验方案，其他研究者可将其应用于多种生物体或组织特征的观察。在该方案的每个步骤中，均可能存在潜在的误差点，下文将对此进行详细讨论。

虽然此处给出的固定剂和洗涤液用量是具体的，但通常情况下，固定剂和洗涤液体积应为样本体积的5-10倍。所有固定、洗涤和脱水的时间均基于我们的经验；若出现问题， 例如， 样品出现皱缩时，可能需要延长每一步脱水或干燥的时间。根据您的单细胞样品，可能需要同时进行戊二醛固定和四氧化锇后固定。如果在蓝细菌实验步骤1.1.2之后需要进行双重固定，则用等量的2% OsO₄覆盖样品₄ 使用相同的缓冲液，并从单细胞实验步骤的1.2.2步骤开始继续操作。根据未在此展示的研究结果，我们发现 果蝇 可在麻醉后直接放入固定液，或在-20 °C条件下长期保存于微量离心管中冷冻，之后再放入固定液，两种方法最终成像质量无差异。

在洗涤和脱水步骤中，必须缓慢地依次经过梯度乙醇系列，不得跳过任一指定浓度。如...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
金–钯	Ted Pella, Inc.	91212
银导电胶 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
Whatman Nuclepore 径迹蚀刻膜；直径 25 mm，孔径 8 μm，聚碳酸酯材质	Sigma	WHA110614
Whatman Nuclepore 径迹蚀刻膜；直径 25 mm，孔径 0.8 μm，黑色聚碳酸酯材质	Sigma	WHA110659
Whatman Nuclepore 径迹蚀刻膜；直径 25 mm，孔径 0.2 μm，聚碳酸酯材质	Sigma	WHA110606
铝制称量皿	Fisher Scientific	08-732-100
铝制样品台（12 mm）	Electron Microscopy Sciences	75210
铝制样品台（25 mm）	Electron Microscopy Sciences	75186
粘附标签	Electron Microscopy Sciences	76760
导电碳粘附标签	Electron Microscopy Sciences	77825
F/2 培养基	德克萨斯大学奥斯汀分校藻类培养中心	https://utex.org/products/f_2-medium	未提供目录号 — 请参见链接
AF6 培养基	Bigelow — 国家海洋藻类与微生物组中心	https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf	未提供目录号 — 请参见链接
土壤浸出液培养基	Carolina Biological Supply Company	153785
聚乙二醇叔辛基苯基醚（Triton X-100）	VWR	97062-208
Hummer 6.2 溅射镀膜仪	Anatech USA	http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4	未提供目录号 — 请参见链接
Hitachi 3400N-II 扫描电子显微镜	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1 -2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA nfD_BwE	该公司似乎已不再销售此型号