脂肪抽吸物的机械微粒化用于再生治疗

摘要

本文介绍一种通过系列机械处理（包括乳化和多次离心）从脂肪组织中获取基质血管组分的实验方案。

摘要

基质血管组分（SVF）已成为多种疾病的再生治疗工具；然而，使用胶原酶的细胞产品在临床应用方面受到法规的严格限制。本文介绍一种通过纯机械方法从脂肪组织中制备可注射的SVF细胞与天然细胞外基质混合物的实验方案。将抽吸获得的脂肪组织置于离心机中，以1,200 × g 离心3分钟。收集中间层，并将其分离为两层（底部为高密度脂肪，顶部为低密度脂肪）。将上层直接通过双注射器反复推注进行乳化，流速为20 mL/s，重复6至8次。乳化后的脂肪以2,000 × g 离心3分钟，收集油层下方的黏性物质，定义为细胞外基质（ECM）/SVF凝胶。同时收集顶层的油脂。将约5 mL油脂加入15 mL高密度脂肪中，同样以20 mL/s的速度通过双注射器反复推注乳化6至8次。乳化后以2,000 × g 离心3分钟，所得黏性物质也为ECM/SVF凝胶。将ECM/SVF凝胶移植至裸鼠体内后，取出移植物并进行组织学检查。结果显示，该产物具有再生为正常脂肪组织的潜力。该方法是一种简单、有效的机械解离技术，可将嵌在天然支持性细胞外基质中的SVF细胞浓缩，用于再生医学目的。

引言

干细胞治疗为组织修复与再生提供了范式转变，因此可能为多种疾病提供替代性治疗方案¹。干细胞（例如，诱导多能干细胞和胚胎干细胞）具有巨大的治疗潜力，但由于细胞调控和伦理问题而受到限制。脂肪来源的间充质基质/干细胞（ASCs）易于从吸脂术获取物中获得，且不受上述限制，因此已成为实用再生医学的理想细胞类型²。此外，它们具有非免疫原性，并可从自体脂肪中获得丰富的资源³。

目前，ASCs 主要通过胶原酶介导的脂肪组织消化法获得。脂肪组织的基质血管组分（SVF）包含 ASCs、内皮祖细胞、周细胞以及免疫细胞。尽管研究表明，通过酶法获得高密度的 SVF/ASCs 具有积极效果，但多个国家的法规对使用胶原酶的细胞治疗产品在临床应用方面进行了严格限制⁴。使用胶原酶消化脂肪组织 30 分钟至 1 小时以获取 SVF 细胞，会增加制剂中外源性物质残留和生物污染的风险。ASCs 的贴壁培养及纯化过程耗时数天至数周，需要特定的实验室设备。此外，在大多数研究中，SVF 细胞和 ASCs 均以悬浮状态使用。由于缺乏细胞外基质（ECM）或其他载体的保护，游离细胞较为脆弱，注射后细胞滞留率低，从而影响治疗效果⁵。上述种种因素限制了干细胞治疗的进一步应用。

方案

本研究经中国广州南方医院伦理审查委员会批准。脂肪组织来自签署书面知情同意书并同意参加本研究的健康供体。所有动物实验均经南方医院机构动物护理和使用委员会批准，并依照国家卫生与医学研究委员会（中国）的指南进行。

1. ECM/SVF凝胶制备

1. 获取脂肪。
   1. 使用带有多个直径为1 mm侧孔的3 mm多孔套管，在-0.75 atm负压条件下对人类受试者进行吸脂术。
   2. 将200 mL脂吸物收集至无菌袋中。
2. 制备Coleman脂肪。
   1. 将脂吸物转移至四个50 mL离心管中，静置10分钟，使所获取的脂肪分层。
   2. 使用宽口移液管将上层脂肪转移至两个50 mL离心管中，弃去下层液体部分。
   3. 将脂肪层在室温（RT）下以1,200 × g 离心3分钟。
   4. 将上层部分（约80 mL）定义为Coleman脂肪。
   5. 使用宽口移液管将Coleman脂肪上层的2/3转移至一个20 mL离心管中，定义该部分为低密度脂肪。
   6. 使用宽口移液管将Coleman脂肪下层的1/3转移至另一个20 mL离心管中，定义该部分为高密度脂肪。
3. 从低密度脂肪制备ECM/SVF凝胶。
   1. 使用两个20 mL注射器，通....

结果

将Coleman脂肪处理为ECM/SVF凝胶后，弃去的油相体积占最终总体积的80%，仅有位于油层下方的20%脂肪组织被视为ECM/SVF凝胶（图1A）。ECM/SVF凝胶具有光滑的液态质地，可通过27 G细针；而Coleman脂肪则由带有粗大纤维的完整脂肪结构组成，仅能通过18 G套管（图1B）。

移植后第3天，出现大量含有多个细胞内脂滴的小型前脂肪细胞、广泛且血管化良好的结缔组织以及浸润的炎性细胞。从第15天开始，炎性细胞数量逐渐减少，脂肪细胞开始成熟。至第90天，移植物中大部分血管化的结缔组织已被成熟的脂肪细胞所取代（图2，上图）。

讨论

基于干细胞的再生治疗在多种疾病中已显示出巨大的潜在益处。脂肪来源的干细胞（ASCs）是极具前景的治疗候选细胞，因为它们易于获取，并具有组织修复及新生组织再生的能力¹⁵。然而，其临床应用的拓展仍存在局限，因其需要复杂的细胞分离程序以及使用胶原酶进行处理⁶。因此，开发一种无需使用胶原酶即可获取干细胞的简便技术显得尤为重要。

本研究介绍了一种完全通过机械方法处理脂肪组织以获取基质血管组分（SVF）细胞的技术，该方法可使SVF细胞受到天然脂肪细胞外基质（ECM）的保护，且整个过程无需使用胶原酶。先前的研究比较了不同注射器间转移处理时间，结果表明，将标准Coleman脂肪以10 mL/s的流速在注射器间转移处理1分钟，是制备ECM/SVF凝胶的最优方案¹²。通过注射器间转移处理，脂肪抽吸物中的大多数脂肪细胞被破坏，而大部分SVF细胞和ECM则得以保留。因此，注射器间转移是整个流程中的关键步骤。转移速度及操作时间决定了脂肪组织的破坏程度，因为注射器间处.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 488 标记的异凝集素 GS-IB4	Molecular Probes	I21411
豚鼠抗小鼠 perilipin 抗体	Progen	GP29
DAPI	Thermofisher	D1306
宽头移液器	Celltreat	229211B
共聚焦显微镜	Leica	TCS SP2
裸鼠	南方医科大学	/
光学显微镜	Olympus	/
50 mL 离心管	Cornig	430828
无菌袋	莱士	/
切片机	Leica	CM1900
离心机	Heraus