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方法文章

脂肪抽吸物的机械微粒化用于再生治疗

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DOI：

10.3791/58765

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2019年3月15日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic and Cosmetic Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍一种通过系列机械处理（包括乳化和多次离心）从脂肪组织中获取基质血管组分的实验方案。

摘要

基质血管组分（SVF）已成为多种疾病的再生治疗工具；然而，使用胶原酶的细胞产品在临床应用方面受到法规的严格限制。本文介绍一种通过纯机械方法从脂肪组织中制备可注射的SVF细胞与天然细胞外基质混合物的实验方案。将抽吸获得的脂肪组织置于离心机中，以1,200 × g 离心3分钟。收集中间层，并将其分离为两层（底部为高密度脂肪，顶部为低密度脂肪）。将上层直接通过双注射器反复推注进行乳化，流速为20 mL/s，重复6至8次。乳化后的脂肪以2,000 × g 离心3分钟，收集油层下方的黏性物质，定义为细胞外基质（ECM）/SVF凝胶。同时收集顶层的油脂。将约5 mL油脂加入15 mL高密度脂肪中，同样以20 mL/s的速度通过双注射器反复推注乳化6至8次。乳化后以2,000 × g 离心3分钟，所得黏性物质也为ECM/SVF凝胶。将ECM/SVF凝胶移植至裸鼠体内后，取出移植物并进行组织学检查。结果显示，该产物具有再生为正常脂肪组织的潜力。该方法是一种简单、有效的机械解离技术，可将嵌在天然支持性细胞外基质中的SVF细胞浓缩，用于再生医学目的。

引言

干细胞治疗为组织修复与再生提供了范式转变，因此可能为多种疾病提供替代性治疗方案1。干细胞（例如，诱导多能干细胞和胚胎干细胞）具有巨大的治疗潜力，但由于细胞调控和伦理问题而受到限制。脂肪来源的间充质基质/干细胞（ASCs）易于从吸脂术获取物中获得，且不受上述限制，因此已成为实用再生医学的理想细胞类型2。此外，它们具有非免疫原性，并可从自体脂肪中获得丰富的资源3。

目前，ASCs 主要通过胶原酶介导的脂肪组织消化法获得。脂肪组织的基质血管组分（SVF）包含 ASCs、内皮祖细胞、周细胞以及免疫细胞。尽管研究表明，通过酶法获得高密度的 SVF/ASCs 具有积极效果，但多个国家的法规对使用胶原酶的细胞治疗产品在临床应用方面进行了严格限制4。使用胶原酶消化脂肪组织 30 分钟至 1 小时以获取 SVF 细胞，会增加制剂中外源性物质残留和生物污染的风险。ASCs 的贴壁培养及纯化过程耗时数天至数周，需要特定的实验室设备。此外，在大多数研究中，SVF 细胞和 ASCs 均以悬浮状态使用。由于缺乏细胞外基质（ECM）或其他载体的保护，游离细胞较为脆弱，注射后细胞滞留率低，从而影响治疗效果5。上述种种因素限制了干细胞治疗的进一步应用。

为了从脂肪组织中获取脂肪间充质干细胞（ASCs）而不使用胶原酶消化，已开发出多种机械处理方法，包括离心、机械切碎、剪切、匀浆和研磨6,7,8,9。这些方法被认为可通过机械破坏成熟的脂肪细胞及其含油囊泡，从而浓缩组织和ASCs。此外，这些含有高浓度ASCs的制备物在动物模型中已显示出显著的再生医学治疗潜力8,9,10。

2013年，Tonnard 等人提出了纳米脂肪移植技术，该技术通过注射器间推移处理产生乳化后的脂肪抽吸物11。注射器间往复运动所产生的剪切力可选择性地破坏成熟脂肪细胞。基于他们的研究结果，我们开发了一种完全机械化的处理方法，可去除脂肪抽吸物中的大部分脂质和液体，仅保留基质血管组分（SVF）细胞和片段化的细胞外基质，即ECM/SVF凝胶12。本文中，我们详细描述了由人源脂肪组织制备ECM/SVF凝胶的机械处理过程。

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方案

本研究经中国广州南方医院伦理审查委员会批准。脂肪组织来自签署书面知情同意书并同意参加本研究的健康供体。所有动物实验均经南方医院机构动物护理和使用委员会批准，并依照国家卫生与医学研究委员会（中国）的指南进行。

1. ECM/SVF凝胶制备

  1. 获取脂肪。
    1. 使用带有多个直径为1 mm侧孔的3 mm多孔套管，在-0.75 atm负压条件下对人类受试者进行吸脂术。
    2. 将200 mL脂吸物收集至无菌袋中。
  2. 制备Coleman脂肪。
    1. 将脂吸物转移至四个50 mL离心管中，静置10分钟，使所获取的脂肪分层。
    2. 使用宽口移液管将上层脂肪转移至两个50 mL离心管中，弃去下层液体部分。
    3. 将脂肪层在室温（RT）下以1,200 × g 离心3分钟。
    4. 将上层部分（约80 mL）定义为Coleman脂肪。
    5. 使用宽口移液管将Coleman脂肪上层的2/3转移至一个20 mL离心管中，定义该部分为低密度脂肪。
    6. 使用宽口移液管将Coleman脂肪下层的1/3转移至另一个20 mL离心管中，定义该部分为高密度脂肪。
  3. 从低密度脂肪制备ECM/SVF凝胶。
    1. 使用两个20 mL注射器，通过内径为2.4 mm的雌-雌鲁尔锁接头连接，将20 mL低密度脂肪在注射器间来回转移。
    2. 保持转移速度稳定（20 mL/s），重复6至8次。
    3. 将混合物在室温（RT）下以2,000 × g 离心3分钟。
    4. 在室温下使用宽口移液管将上层油相部分收集至10 mL离心管中，留待后续使用。
    5. 使用宽口移液管收集中间层的黏性物质，即ECM/SVF-gel（图1A），并弃去下层液体。
  4. 从高密度脂肪制备ECM/SVF-gel。
    1. 将5 mL油相（来自步骤1.3.4）加入15 mL高密度脂肪中。
    2. 在注射器之间来回转移混合脂肪6至8次，直至乳液中观察到絮状物形成。
    3. 将混合物在室温（RT）下以2,000 × g 离心3分钟。
    4. 弃去上层油相部分。
    5. 使用宽口移液管收集中间层的黏性物质（ECM/SVF-gel），并弃去下层液体。
    6. 将步骤1.3.5和1.4.5所得的ECM/SVF-gel混合。

2. 裸鼠 ECM/SVF-凝胶移植模型

  1. 在动物手术室中，使用异氟烷（1% - 3%）吸入麻醉法对裸鼠（8周龄，雌性）进行麻醉。
  2. 将ECM/SVF凝胶转移至1 mL注射器中。
  3. 将1 mL注射器与钝头浸润套管连接。
  4. 将套管插入小鼠双侧 flank 的皮下。
  5. 注射0.3 mL的ECM/SVF凝胶。

3. ECM/SVF凝胶注射后第3、15和90天的组织采集

  1. 使用异氟烷（1% - 3%）吸入麻醉法对小鼠进行麻醉。
  2. 采用颈椎脱位法处死小鼠。
  3. 用手术剪在小鼠背部皮肤正中线处做切口。
  4. 解剖并采集小鼠双侧脂肪移植物。将脂肪移植物置于4%多聚甲醛中，室温固定过夜。
  5. 用浓度递增的乙醇对组织进行脱水：70%乙醇，换两次，每次1 h；80%乙醇，换一次，1 h；95%乙醇，换一次，1 h；100%乙醇，换三次，每次1.5 h；二甲苯，换三次，每次1.5 h。
  6. 用石蜡（58 - 60 °C）对组织进行浸蜡处理，换两次，每次2 h。
  7. 将组织包埋于石蜡块中，切片厚度约为4 µm，并将切片置于载玻片上。

4. 苏木精和伊红染色

  1. 将石蜡包埋切片依次浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中脱蜡（每次10分钟）。
  2. 将组织切片依次通过浓度递减的乙醇溶液（100%、100%、95%、80%、70%）进行水化，每步3分钟。
  3. 用蒸馏水冲洗组织切片（5分钟）。
  4. 用苏木精染色液对组织切片染色5分钟。
  5. 用流动自来水冲洗切片20分钟。用1%酸性乙醇（1% HCl溶于70%乙醇）分化5秒。再用流动自来水冲洗至切片重新呈现蓝色。
  6. 用移液器直接向切片滴加2至3滴伊红Y染液，染色10分钟。
  7. 用自来水冲洗切片1至5分钟。
  8. 将切片依次浸入浓度递增的乙醇溶液（70%、80%、95%、100%、100%）中脱水，每步3分钟。
  9. 将切片依次浸入二甲苯Ⅰ和Ⅱ中透明，每次5分钟。
  10. 用封片剂封片。

5. 免疫荧光染色

  1. 将组织切片依次浸入二甲苯 I、II 和 III 中脱蜡（每次 5 分钟）。
  2. 将组织切片依次通过不同浓度（100%、100%、95%、95%、70%）的酒精溶液进行水化，每次 3 分钟。
  3. 在室温下用含 3% H2O2 的甲醇溶液孵育切片 10 分钟。
  4. 用蒸馏水漂洗载玻片 2 次，每次 5 分钟。
  5. 将载玻片放入染色架中，加入 300 mL 10 mM 枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0），于 95–100 °C 孵育 10 分钟。
  6. 在室温下冷却 20 分钟。
  7. 用磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗载玻片 2 次，每次 5 分钟。
  8. 每张载玻片上加入 100 µL 10% 胎牛血清，在湿盒中室温孵育 1 小时。
  9. 加入一抗溶液（豚鼠抗小鼠 Perilipin 抗体，1:400），于 4 °C 孵育过夜。
  10. 用 PBS 漂洗载玻片 3 次，每次 5 分钟。
  11. 加入二抗溶液（山羊抗豚鼠 IgG-Alexa Fluor 488），室温孵育 2 小时。
  12. 用 PBS 漂洗载玻片 3 次，每次 5 分钟。
  13. 用干净的纸巾擦去切片周围的水分。
  14. 在圆形区域内滴加 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和 Alexa Fluor 488 标记的异凝集素，覆盖载玻片上的切片。
  15. 加盖盖玻片，并在避光条件下干燥。
  16. 用荧光显微镜观察载玻片。

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结果

将Coleman脂肪处理为ECM/SVF凝胶后，弃去的油相体积占最终总体积的80%，仅有位于油层下方的20%脂肪组织被视为ECM/SVF凝胶（图1A）。ECM/SVF凝胶具有光滑的液态质地，可通过27 G细针；而Coleman脂肪则由带有粗大纤维的完整脂肪结构组成，仅能通过18 G套管（图1B）。

移植后第3天，出现大量含有多个细胞内脂滴的小型前脂肪细胞、广泛且血管化良好的结缔组织以及浸润的炎性细胞。从第15天开始，炎性细胞数量逐渐减少，脂肪细胞开始成熟。至第90天，移植物中大部分血管化的结缔组织已被成熟的脂肪细胞所取代（图2，上图）。

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讨论

基于干细胞的再生治疗在多种疾病中已显示出巨大的潜在益处。脂肪来源的干细胞（ASCs）是极具前景的治疗候选细胞，因为它们易于获取，并具有组织修复及新生组织再生的能力15。然而，其临床应用的拓展仍存在局限，因其需要复杂的细胞分离程序以及使用胶原酶进行处理6。因此，开发一种无需使用胶原酶即可获取干细胞的简便技术显得尤为重要。

本研究介绍了一种完全通过机械方法处理脂肪组织以获取基质血管组分（SVF）细胞的技术，该方法可使SVF细胞受到天然脂肪细胞外基质（ECM）的保护，且整个过程无需使用胶原酶。先前的研究比较了不同注射器间转移处理时间，结果表明，将标准Coleman脂肪以10 mL/s的流速在注射器间转移处理1分钟，是制备ECM/SVF凝胶的最优方案12。通过注射器间转移处理，脂肪抽吸物中的大多数脂肪细胞被破坏，而大部分SVF细胞和ECM则得以保留。因此，注射器间转移是整个流程中的关键步骤。转移速度及操作时间决定了脂肪组织的破坏程度，因为注射器间处...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到中国国家自然科学基金（81471881、81601702、81671931）、中国广东省自然科学基金（2014A030310155）以及南方医院院长基金（2014B009、2015Z002、2016Z010、2016B001）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 488 标记的异凝集素 GS-IB4Molecular ProbesI21411
豚鼠抗小鼠 perilipin 抗体ProgenGP29
DAPIThermofisherD1306
宽头移液器Celltreat229211B
共聚焦显微镜 Leica TCS SP2
裸鼠 南方医科大学/
光学显微镜 Olympus/
50 mL 离心管Cornig430828
无菌袋莱士/
切片机Leica CM1900
离心机Heraus

参考文献

  1. Bateman, M. E., et al. Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
  2. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. , 812693(2012).
  3. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circulation Research. 100 (9), 1249-1260 (2017).
  4. Halme, D. G., Kessler, D. A. FDA regulation of stem-cell-based therapies. New England Journal of Medicine. 355 (16), 1730-1735 (2006).
  5. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  6. van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
  7. van Dongen, J. A., et al. The fractionation of adipose tissue procedure to obtain stromal vascular fractions for regenerative purposes. Wound Repair and Regeneration. 24 (6), 994-1003 (2016).
  8. Mashiko, T., et al. Mechanical Micronization of Lipoaspirates: Squeeze and Emulsification Techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (1), 79-90 (2017).
  9. Feng, J., et al. Micronized cellular adipose matrix as a therapeutic injectable for diabetic ulcer. Regenerative Medicine. 10 (6), 699-708 (2015).
  10. Zhang, P., et al. Ischemic flap survival improvement by composition-selective fat grafting with novel adipose tissue derived product - stromal vascular fraction gel. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 495 (3), 2249-2256 (2018).
  11. Tonnard, P., et al. Nanofat grafting: basic research and clinical applications. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 1017-1026 (2013).
  12. Yao, Y., et al. Adipose Extracellular Matrix/Stromal Vascular Fraction Gel: A Novel Adipose Tissue-Derived Injectable for Stem Cell Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (4), 867-879 (2017).
  13. Yao, Y., et al. Adipose Stromal Vascular Fraction Gel Grafting: A New Method for Tissue Volumization and Rejuvenation. Dermatologic Surgery. 44 (10), 1278-1286 (2018).
  14. Zhang, Y., et al. Improved Long-Term Volume Retention of Stromal Vascular Fraction Gel Grafting with Enhanced Angiogenesis and Adipogenesis. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (5), 676-686 (2018).
  15. Sun, B., et al. Applications of stem cell-derived exosomes in tissue engineering and neurological diseases. Reviews in the Neurosciences. 29 (5), 531-546 (2018).
  16. Allen, R. J., et al. Grading lipoaspirate: is there an optimal density for fat grafting. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (1), 38-45 (2013).
  17. Qiu, L., et al. Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).

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