一种用于快速初步评估疾病抑制效果的平板竞争测定法

摘要

本文介绍了一种平板竞争实验方案，用于判断特定堆肥是否可能含有抑制立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）生长的细菌和真菌。

摘要

本研究旨在开发并优化一种简单、经济且有效的生物测定方法，用于检测特定堆肥对土传真菌Rhizoctonia solani的抑病能力。R. solani是一种在全球范围内危害多种植物的病原菌。该真菌可在土壤中以腐生方式存活，并在简单的水琼脂培养基上快速生长。平板测定法是一种快速比较不同堆肥抑制R. solani生长能力的方法。该测定结果与对其他以腐生方式在土壤中存活的土传真菌病原体（如链格孢属引起的早疫病、镰刀菌枯萎病、疫霉根腐病和腐霉根腐病）的抑制作用具有良好相关性。

引言

Rhizoctonia 是一个广泛的真菌复合群，其中 Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk（无性型 = Rhizoctonia solani Kühn）是引起根腐病和猝倒病的病原菌¹。Rhizoctonia solani 是一种侵袭性强的病原菌，同时也是一种腐生菌，可在不利环境条件下以菌核形式长期存活¹。因此，该菌具有全球性分布，可侵染多种植物寄主，包括茄科、豆科、菊科和十字花科植物，造成严重的经济损失。

堆肥能够容纳某些植物病原菌的生物防治因子²。然而，并非所有堆肥都具有相同特性，其对不同病原菌的作用也各不相同³。以木材为基质的碳源其木质素与纤维素的比值高于以干草或秸秆为碳源的堆肥。R. solani偏好秸秆中易获取的碳源；相比之下，当碳源较难获取时，生防真菌（如Trichoderma spp.）的防治效果更佳。有益真菌和细菌进入堆肥后，可通过竞争、拮抗或调节植物生长等方式抑制植物病害³。本研究所提出的检测方法主要用于检测由抗生素、胞外酶或螯合剂的产生所引起的拮抗作用，这些物质对病原菌具有抑制或破坏作用。

植物生物测定是确定堆肥是否促进或抑制植物生长的黄金标准⁴。然而，植物生物测定耗时较长（数周至数月），可能超出所需时间，并且需要投入更多人力来提取带根植物，以量化根系发育的程度。相比之下，稳健但更快速（数天内完成）的检测方法更适合质量控制项目。本文旨在展示一种相对快速且准确的检测方法，用于预测堆肥的抑菌潜力。该方法参照 Alfano et al.⁵ 的方案，但有两处改进：使用稀释的堆肥提取液，并以水琼脂替代马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）。R. solani 在简单的水琼脂培养基上生长迅速，而PDA则促进细菌和其他真菌生长，导致培养物污染⁶。

该平板检测法可用于指示对多种在土壤中以腐生方式存活的植物病原菌的抑制作用，这些病原菌包括R. solani⁷、链格孢属早期叶斑病菌、镰刀菌枯萎病、疫霉根腐病以及腐霉根腐病。平板竞争实验有助于筛选含有可作为土壤病原菌生物防治因子的微生物群落的各类堆肥产品。该检测法曾是商业堆肥产品中疾病抑制能力最一致的指标之一^6,8。所选产品在配方、成熟度和生产工艺方面具有差异性。

方案

1. 提前准备

1. 真菌主培养物（测试生物）
   1. 从美国典型培养物保藏中心微生物收藏库⁹订购，以其有性型 Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) 或 MYA 4031 获取。
   2. 替代方法：可按照作者的方法采集本地分离株。红萝卜（Raphanus sativus）幼苗可作为良好的诱饵植物；采集已知曾发生由 R. solani 引起的猝倒病或根腐病的土壤区域的土样。将种子播种于该土壤中，并在幼苗生长至3至4周时从根部病斑处进行分离。
      1. 将幼苗从土壤中取出，并用自来水冲洗。观察子叶与根之间下胚轴区域是否存在褐色组织（图1）。
      2. 使用单刃剃刀切割呈褐色的下胚轴或根部约1 cm长的片段。用火焰灭菌的镊子夹取片段，浸入10%家用漂白剂溶液中处理1分钟，随后用无菌水冲洗10秒。
         注意：无菌培养皿的上下盖可作为此步骤的便利容器。
      3. 用火焰灭菌的镊子将植物组织块转移至纸巾内侧吸干水分，然后置于含水琼脂（15 g/L）的培养皿表面。
      4. 将培养皿放入带盖的塑料容器中，在室温（约20 °C）下培养。在放入培养皿前，先用10%漂白剂或75%乙醇擦拭容器内部，并使其自然风干。
      5. 将分离物长期保存于玉米粉琼脂斜面（17 g/L）的最低限度培养基上（5 °C保存）。

图1：病害症状。 含有R. solani的土壤导致出苗不齐和幼苗立枯（左图）。萝卜幼苗上的症状表现为下胚轴出现褐色病斑（右图）。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 使用马铃薯葡萄糖琼脂平板（每升含39 g）作为本平板测定的接种物。
   1. 建立子代培养物 立枯丝核菌 在测定前一到两天将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上进行培养，以确保在测定前菌种已在培养平板上充分生长。通过转移一小块（直径10 mm）的菌体至新的培养基中开始子代培养。 R. solani 从主培养物转移到新鲜马铃薯葡萄糖琼脂平板的中央图2).
      注意：在层流罩内操作，或用10%次氯酸钠溶液或75%乙醇擦拭实验台面，以最大限度降低污染风险。
3. 高压灭菌25 mL试管，每管加入10 mL蒸馏水（样本数量的2倍）。

2. 待测样品的制备

1. 将每种堆肥测试样品分别取两个独立的0.5 g样品，加入到25 mL试管中的10 mL已灭菌水中。将试管振荡过夜。
   1. 用唯一的样品编号标记试管，并将每对中的两个分别标记为A（对照）或B（样品）。
2. 24小时后，在两个125 mL锥形瓶中，将1.5 g普通琼脂加入90 mL蒸馏水中。
3. 将装有琼脂的两个锥形瓶以及每对中的A样品一起，在慢速排气模式下进行高压灭菌20分钟。
4. 高压灭菌后，将装有琼脂的锥形瓶放入45 °C水浴中，直至达到平衡温度（约30分钟）。在水浴温度降至45 °C之前，不得将任何样品悬液放入其中。

图2：实验方案示意图。 将 R. solani 菌块接种于含有堆肥水提取物的培养皿中。借助体视显微镜以提高分辨率和对比度，在接种后1–2天测量菌丝生长直径。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 将A样品（灭菌对照）堆肥悬液倒入A琼脂瓶的熔融琼脂中，轻轻旋转混匀，使堆肥在琼脂中均匀分散。
6. 将B样品（活体样品）堆肥悬液倒入B琼脂瓶的熔融琼脂中，轻轻旋转混匀，使堆肥在琼脂中均匀分散。
7. 将每个烧瓶中的混合物分别倒入五个直径为100 mm的塑料培养皿中。
8. 静置培养皿过夜，使琼脂完全凝固。

3. 添加 Rhizoctonia 挑战

1. 采用无菌技术，将大小相等的 R. solani 菌块转移至每对样品琼脂平板中（使用 3 至 5 mm 的打孔器可获得大小一致的菌块）。应从菌落的外缘区域取样，以确保菌丝处于活跃生长状态。
   注意：操作应在超净工作台中进行，或用 10% 次氯酸钠溶液或 70% 乙醇擦拭实验台面。
2. 将平板在室温下培养 1–2 天，直至菌落生长至 A 平板边缘约一半位置。

4. 测量R. solani 生长

1. 使用体视显微镜配合透射照明，用透明直尺测量每块平板菌丝的半径，精确到最接近的 1 mm。
   注意：斜射光或暗场照明将更有利于观察和测量透明的菌丝。此时，若堆肥具有抑菌作用，则在 B 平板中堆肥碎片周围可见抑制圈。
2. 每块平板在三个不同位置测量半径，并计算三个测量值的平均值，作为代表性测量结果。
3. 用 A 平板的平均值减去 B 平板的平均值。如果 B < A，则表明 B 平板中的微生物对 R. solani 病原菌具有抑制作用。
4. 将平均半径除以挑战培养的天数，以“每天菌丝生长毫米数（mm/d）”为单位表示相对抑制速率。

结果

腐熟完成的堆肥应具有稳定性和成熟度，这两个术语常被互换使用，以确保其可安全包装和运输，并在最终使用过程中不会产生不良影响⁴。稳定性指材料抵抗分解的能力，通常通过微生物活性指标来测定。虽然微生物呼吸作用的一般性测定可用于评估堆肥的稳定性，但未必能反映其对强侵染性病原菌和腐生菌（如R. solani）的抑病能力⁷。本研究关注的是成熟度，即材料已具备特定用途的适用性；对于园艺用途而言，成熟度通常通过植物发芽和生长试验来确定。

活体堆肥提取物对 R. solani 生长的抑制作用显著强于经高压灭菌处理的样品（P ≤ 0.0001）。高压灭菌处理会消除微生物活性，表明抑制作用由微生物介导。这证实了本方法中的平板 A 作为微生物介导生物防治的阴性对照（图 3...

讨论

既往研究表明，某些堆肥对抑制立枯丝核菌（R. solani）具有显著效果，且这种抑制作用源于堆肥中的微生物，而非堆肥的非生物特性^6,8。人们曾采用高压灭菌法来“杀灭”微生物群落，但这种方法因会改变培养基的碳化学性质而受到批评¹⁰。我们比较了高压灭菌与通过沃特曼（Whatman）一号滤纸进行真空过滤的方法。结果表明，既未过滤也未高压灭菌的处理组对R. solani生长的抑制作用最强⁶。过滤去除了较大的固体颗粒，而这些颗粒很可能为产抗生素的微生物提供了栖息环境，因此在病害抑制中起重要作用。

该方法的优点在于操作简便且成本低廉。与Alfano et al.²的结论和建议类似，平板竞争实验可用于快速初步评估对病害的抑制作用，但由于该实验仅包含病原菌而未包含植物寄主，因此不能作为独...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
可高压灭菌窄颈玻璃锥形瓶	Fisher Scientific	10-040D	125 mL
可高压灭菌玻璃试管	Fisher Scientific	14-925J	25 mL
脱水颗粒状琼脂	Fisher Scientific	DF0145-17-0	500 g 规格
耐热手套	Fisher Scientific	MEMGG1314WL	多个品牌可选
Parafilm（2–3 cm 宽条状）	Fisher Scientific	PM992 13-374-16	5 cm 或 10 cm 宽度均可使用
一次性聚苯乙烯培养皿	Fisher Scientific	R80116	每盒20个装或每箱500个装
脱水马铃薯葡萄糖琼脂	Fisher Scientific	DF0013-15-8	提供100 g、500 g 和 2000 g 规格
台式往复摇床	Thomas Scientific	1227Y31	其他型号亦可使用
水浴锅	ThermoScientific	S37363	5 L 通用型
透明直尺，平整，至少10 cm长	任意品牌		使用公制刻度
ATCC 菌种	American Type Culture Collection	ATCC 10154	有性型 Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) 或 MYA 4031；
实验室封口膜（lab tape）	Fisher Scientific	15935	可高压灭菌且可移除，推荐宽度为1"
防水标记笔	办公或实验用品供应商	Sharpie 细头笔	在封口膜上标注样品编号