本文介绍了三种不同的实验方法，用于研究Aeromonas对C. elegans的感染。利用这些简便的方法，可轻松评估不同Aeromonas物种之间及同一物种内部的毒性差异。
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本文内容
摘要
摘要
人类病原菌Aeromonas在临床上已被证实可引起胃肠炎、伤口感染、败血症以及尿路感染。大多数人类疾病被报道与四种细菌物种相关：Aeromonas dhakensis、Aeromonas hydrophila、Aeromonas veronii和Aeromonas caviae。模式生物Caenorhabditis elegans是一种以细菌为食的线虫，为研究Aeromonas的细菌致病机制提供了优良的感染模型。本文介绍了利用C. elegans模型研究Aeromonas感染的三种不同实验方法，包括生存率测定、液体毒性试验和肌肉坏死检测。这三种方法在测定Aeromonas毒力方面的结果具有一致性。A. dhakensis被证实是引起临床感染的四种主要Aeromonas物种中毒性最强的菌种。这些方法为评估Aeromonas种间及种内毒力提供了便捷手段，并有助于加深我们对Aeromonas感染致病机制的理解。
引言
临床研究表明，人类病原体Aeromonas可引起胃肠炎、伤口感染、败血症以及尿路感染1,2。大多数相关人类疾病已被报道与四种细菌物种有关：Aeromonas dhakensis、Aeromonas hydrophila、Aeromonas veronii和Aeromonas caviae2,3,4,5。在Aeromonas引起的感染性疾病中，软组织感染可导致人类严重的发病率和死亡率。其中，肌肉坏死是最严重的软组织感染形式6。通过观察感染后秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的存活情况及肌肉坏死程度，是推测Aeromonas毒力的一种便捷方法。
科学家们已开发出多种模式生物用于研究细菌感染。在以往的研究中，小鼠、斑马鱼和线虫被用作动物模型，以研究病原菌的致病机制和毒力 气单胞菌属6,7,8每种动物模型都有其优势和应用。模式生物， 秀丽隐杆线虫是一种以细菌为食的食细菌线虫，可自然摄取细菌作为食物。 秀丽隐杆线虫在进化过程中，已形成针对细菌感染的复杂先天免疫系统。在细菌感染的压力下， 秀丽隐杆线虫 已被证实是研究细菌致病机制的优良感染模型 气单胞菌属6,7,9 以及其他病原体，如真菌10 肠出血性 大肠杆菌 O157:H711然而，目前仍没有专注于使用该方法的出版物 秀丽隐杆线虫 作为研究毒力的模型 气单胞菌属.
在此，我们介绍三种不同的实验方法来研究 气单胞菌属 使用感染 秀丽隐杆线虫 作为动物模型：生存率、液体毒性和肌肉坏死的检测方法。这些方法可便捷地用于评估不同种类之间及同一种类内部的毒性差异 气单胞菌属 物种并加深对发病机制的理解 气单胞菌属.
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方案
1. 培养基的制备
注意：溶液配制方法见表1。
- 配制 M9 培养基12：将 1.5 g KH2PO4、5.66 g Na2HPO4 和 2.5 g NaCl 溶解于 500 mL 去离子水中。在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。待冷却至室温后，首次使用前加入 0.5 mL 1 M MgSO4。
- 配制线虫生长培养基（NGM）12：将 3 g NaCl、2.5 g 细菌蛋白胨和 20 g 琼脂溶解于 1 L 去离子水中。在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。待其在水浴中冷却至 55 °C 后，加入 1 mL 1 M CaCl2、1 mL 1 M MgSO4、1 mL 5% 乙醇胆固醇溶液和 25 mL 磷酸盐缓冲液。轻轻旋转混匀。
- 每 6 cm 培养皿中倒入约 5 mL NGM。避免平板表面产生气泡。将平板在室温下放置 1 夜，包装后于 4 °C 保存。使用前恢复至室温。
- 配制富集型 NGM（ENGM）：将 3 g NaCl、5 g 细菌蛋白胨、1 g 酵母提取物和 30 g 琼脂溶解于 1 L 去离子水中。在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。待其在水浴中冷却至 55 °C 后，加入 1 mL 1 M CaCl2、1 mL 1 M MgSO4、1 mL 5% 乙醇胆固醇溶液和 25 mL 磷酸盐缓冲液。轻轻旋转混匀。
- 每 9 cm 培养皿中倒入约 10 mL ENGM。避免平板表面产生气泡。将平板在室温下放置 1 夜，包装后于 4 °C 保存。使用前恢复至室温。
- 配制 S 培养基12：使用前将 40 mL S 基础液、0.4 mL 1 M 柠檬酸钾、0.4 mL 微量金属溶液、0.12 mL 1 M CaCl2、0.12 mL 1 M MgSO4、40 µL 5% 乙醇胆固醇溶液和 1 mL 8 mM 氟脱氧尿苷（FudR）混合均匀。
2. C. elegans 的同步化6,9,12
- 在15 mL离心管中，用10 mL无菌去离子水清洗约2,000条处于怀卵成虫阶段的线虫。用离心法洗涤3次以去除细菌，每次均将线虫保留在管底。
- 将样品在500 x g下离心1分钟 g 用以沉淀线虫。移除上清液，将线虫保留在3.5 mL去离子水中。
- 加入1 mL次氯酸钠（10–15%）和0.5 mL 5 M KOH至离心管中，振荡混匀 <6 分钟以裂解线虫虫体。
- 卵从线虫中释放后，加入10 mL去离子水以终止裂解。在1,200 x g下离心1分钟 g 收集卵子并尽可能吸除上清液。用15 mL M9培养基至少洗涤3次。
注：M9 培养基的成分见步骤 1.1。 - 将卵置于1 mL M9培养基中，转移至3.5 cm培养皿，在20 °C下孵育过夜（约12–18 h）。
注意：孵育后，卵将孵化成蠕虫幼虫，称为第一阶段幼虫（L1）。 - 用移液器吸取10 µL含L1期幼虫的M9培养基。计数线虫数量，并计算M9培养基中L1期幼虫的浓度。
- 用移液器将最多10,000条经孵化的L1期线虫接种至直径9 cm的ENGM平板上，平板表面已涂布 大肠杆菌 OP50
- 在此步骤中，取0.5 mL过夜培养的 E. coli 在9 cm ENGM平板上使用含Luria-Bertani (LB) 肉汤的OP50。将平板置于37 °C培养16–18 h
注意：为避免污染，涂布步骤应在超净工作台中进行。 - 冷却至室温后再接种L1幼虫。每个培养皿中接种的经孵化的L1期幼虫数量不得超过10,000条 含ENGM平板 E. coli OP50
- 在此步骤中，取0.5 mL过夜培养的 E. coli 在9 cm ENGM平板上使用含Luria-Bertani (LB) 肉汤的OP50。将平板置于37 °C培养16–18 h
- 在20 °C下孵育线虫44小时，或直至其生长至L4期th L4幼虫阶段
注意： 参见步骤1.3了解ENGM培养基的成分。在L4阶段，线虫体侧中部可见一个新月形的白色斑点。 - 在以下实验中使用同步化的L4期线虫。使用野生型N2线虫 秀丽隐杆线虫 生存实验与 Aeromonas dhakensis 以及 秀丽隐杆线虫 液体毒性检测实验 Aeromonas dhakensis. 使用 RW1596 蚯蚓（myo-3(st386);stEx30[myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]）在 秀丽隐杆线虫 肌肉坏死检测 Aeromonas dhakensis.
3. C. elegans 与气单胞菌（Aeromonas）共培养的生存分析实验6,9
- 在将L1幼虫接种到ENGM平板上的当天 E. coli OP50，挑取四种菌株的单个菌落 气单胞菌属 菌株或 E. coli OP50 并分别在 37 °C 下用 2 mL LB 肉汤培养 16 小时。
注意： 为避免污染，此步骤应在超净工作台中进行。本实验使用了以下菌株： E. coli OP50，秀丽隐杆线虫的常规食物来源 秀丽隐杆线虫。A. dhakensis AAK1，首个完成全序列测定的致病性临床 A. dhakensis 分离 A. hydrophila A2-066 A. veronii A2-007，以及 A. caviae A2-9307121 是来自中国台湾成功大学附属医院的代表性临床分离株。 - 测量OD600 细菌肉汤的吸光度测定及调整至OD600 = 2.0，使用LB肉汤。
- 在每个6 cm NGM平板上分别点样并涂布30 µL细菌培养液。将平板于室温下培养过夜。
注意： NGM 培养基的配方见步骤 1.2。 - 在L1幼虫发育至L4阶段的当天，随机挑选并转移50条线虫至含有四种不同条件之一的NGM平板 气单胞菌属 菌株或 大肠杆菌 OP50
- 在20 °C下孵育NGM平板，直至实验结束。
- 将所有存活的线虫转移至新制备的含细菌NGM平板上，每天统计活虫、死虫和感测虫的数量，直至最后一条线虫死亡。
注意： 每天将线虫转移至新制备的NGM平板，以维持感染状态，即使使用无菌线虫（例如glp-4，或使用 FudR。 - 根据每日数据计算结果绘制生存曲线。
4. 秀丽隐杆线虫 液体毒性检测实验 气单胞菌属7
注意：为避免污染，所有步骤应在层流罩内进行。
- 接种L1幼虫至ENGM平板后的第二天 E. coli OP50，挑取四种菌株的单个菌落 气单胞菌属 菌株和 E. coli OP50，并分别在37 °C下用5 mL LB肉汤培养16 h。
注意：在本实验方案中，使用了以下细菌菌株： E. coli OP50，秀丽隐杆线虫的常规食物来源 秀丽隐杆线虫。A. dhakensis AAK1，首个完全测序的致病性临床 A. dhakensis 分离 A. hydrophila A2-066 A. veronii A2-007，以及 A. caviae A2-9307121 是来自中国台湾成功大学附属医院的代表性临床分离株。 - 测量OD600 细菌肉汤的吸光度。
- 将细菌培养液在 3,500 x g 15分钟以去除LB肉汤。重悬细菌，并将菌液调整至OD600 3.0，加入S培养基。向96孔板的至少8个孔中，每孔加入195 µL含S培养基的细菌培养液。
注意： 参见步骤1.6中S培养基的成分。 - 用ENGM平板冲洗L4期蠕虫 E. coli 在96孔板的每个孔中加入5 µL线虫溶液，调整线虫溶液浓度为每µL含5条线虫，确保每孔约有25条线虫。
- 将96孔板置于摇床中，在25 °C、200 rpm条件下孵育。
- 在24、48和72小时后分别计数活线虫和死线虫的数量。按以下公式计算每个孔的存活率：（活线虫数 / 总线虫数）× 100%。
- 使用每日数据计算结果绘制散点图。
5. 秀丽隐杆线虫 肌肉坏死检测 气单胞菌属6
注意： 为避免污染，这些步骤应在层流罩中进行。
- L1幼虫接种至含有ENGM的培养皿当天 E. coli OP50，挑取四种菌株的单个菌落 气单胞菌属 菌株和 E. coli OP50 及各 2 mL LB 肉汤，37 °C 培养 16 小时。
注意： 此处使用了以下细菌菌株： E. coli OP50，秀丽隐杆线虫的常规食物来源 秀丽隐杆线虫。A. dhakensis AAK1，首个完全测序的致病性临床 A. dhakensis 分离 A. hydrophila A2-066 A. veronii A2-007，以及 A. caviae A2-9307121 是来自中国台湾国立成功大学医院的代表性临床分离株。 - 测量 OD600 细菌肉汤的吸光度，并将细菌肉汤调整至OD600 用LB肉汤稀释至2.0。取30 µL菌液点种并涂布于6 cm NGM平板上。将平板于室温下培养过夜。
- 在L1幼虫发育至L4阶段的当天，将50条线虫分别转移至含有四种不同条件的NGM平板上 气单胞菌属 菌株或 E. coli OP50。将NGM平板在20 °C培养。每隔24小时将线虫转移至新制备的含细菌NGM平板上。
- 使用荧光显微镜拍摄肌肉图像。
- 随机选取10条线虫置于载玻片上含M9培养基的2%琼脂糖凝胶中。在成像前，加入2 µL含1%叠氮化钠的M9培养基溶液处理线虫，使其在琼脂糖上麻痹，处理时间少于5分钟。
- 放置盖玻片，使用配备电荷耦合器件相机的荧光显微镜，通过绿色荧光蛋白（GFP）滤光片采集肌肉图像。分别在L4阶段后24、48和72小时采集肌肉图像。
- 使用图像处理软件进行图像分析和图件制作。
注意： 评分的定义及肌肉损伤程度如图所示 图3，评分标准如下：缺失肌纤维计3分；肌纤维断裂或破裂计2分；肌纤维弯曲计1分；健康肌纤维计0分。
6. 统计分析
- 所有实验至少独立重复三次。
- 采用Kaplan-Meier法评估秀丽隐杆线虫（C. elegans）的生存实验，并使用log-rank检验分析生存差异。统计学显著性水平设定为0.05。
- 采用Student t检验分析两组间秀丽隐杆线虫（C. elegans）液体毒性实验的统计学结果。对于单个自变量下三个或更多数值间的差异，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行分析。统计学显著性水平设定为0.05。
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结果
通过遵循上述方案，可轻松区分四种毒性之间的差异 气单胞菌属 菌株。存活率测定 秀丽隐杆线虫 如图所示 图1. 存活率 秀丽隐杆线虫 感染了 气单胞菌属 物种，按从高到低顺序排列如下： A. caviae, A. veronii, A. hydrophila, 和 A. dhakensis. 尽管在不同种类之间以及同一种类内部的毒性方面存在差异 气单胞菌属 物种，存活率 秀丽隐杆线虫平均而言，在感染的蠕虫中表现出最高的死亡率 A. dhakensis毒力 A. hydrophila 差于 A. dhakensis (p < 0.01). 与之相比 A. dhakensis 和 A. hydrophila,两种减毒的毒力 A. veronii 和...
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讨论
C. elegans 是一种以细菌为食的线虫，其在进化过程中自然摄取细菌作为食物，并发展出复杂的细菌先天免疫系统。维持和支撑这种免疫系统的两个主要器官是表皮和肠道9,13。C. elegans 的表皮和肌肉带在结构上类似于哺乳动物和人类的软组织6。由于这些特性，C. elegans 可作为研究气单胞菌（Aeromonas）感染发病机制的模式生物。
本文介绍了三种用于研究Aeromonas感染C. elegans的方法，这些方法代表了4种Aeromonas物种之间不同的毒性特征，并与临床观察结果相关联7。这些简便的方法可区分不同Aeromonas物种的毒性程度。利用这些方法，研究人员能够研究不同Aeromonas物...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢中国台湾的 C. elegans 核心设施，以及国立成功大学医院诊断微生物学与抗菌药物耐药性实验室提供 Aeromonas 分离株。同时感谢线虫遗传中心（CGC）和 WormBase。我们还感谢 Savana Moore 对稿件的编辑工作。
本研究部分得到了中国台湾科技部（MOST 105-2628-B-006-017-MY3）和国立成功大学医院（NCKUH-10705001）对 P.L. Chen 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 摇床培养箱 | YIH DER | LM-570R | 细菌培养 |
| K2HPO4 | J.T.Baker | MP021519455 | 培养基制备 |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-05 | 培养基制备 |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | MP021914405 | 培养基制备 |
| NaCl | SIGMA | 31434 | 培养基制备 |
| MgSO₄4 | SIGMA | M7506 | 培养基制备 |
| 琼脂 | Difco | 214530 | 培养基制备 |
| CaCl2 | SIGMA | C1016 | 培养基制备 |
| 胆固醇 | SIGMA | C8503 | 培养基制备 |
| 乙醇 | SIGMA | 32205 | 培养基制备 |
| KOH | SIGMA | P5958 | 培养基制备 |
| 6 cm 培养皿 | ALPHA PLUS | 46 | 琼脂平板制备 |
| 96孔板 | FALCON | 353072 | 液体检测 |
| 细菌蛋白胨 | Affymetrix/USB | AAJ20048P2 | 培养基制备 |
| 酵母提取物 | SIGMA | 92144 | 培养基制备 |
| 柠檬酸•H2O | SIGMA | C1909 | 培养基制备 |
| 三水合柠檬酸钾•H2O | SIGMA | 104956 | 培养基制备 |
| FudR | SIGMA | 1271008 | 培养基制备 |
| EDTA二钠 | SIGMA | E1644 | 培养基制备 |
| FeSO4•7 H2O | SIGMA | 215422 | 培养基制备 |
| MnCl2•4 H2O | SIGMA | 221279 | 培养基制备 |
| ZnSO₄4•7 H2O | SIGMA | 204986 | 培养基制备 |
| CuSO₄4•5 H2O | SIGMA | C8027 | 培养基制备 |
| 胰蛋白胨 | SIGMA | 16922 | 培养基制备 |
| 显微镜系统 | 尼康 | Eclipase Ti 倒置显微镜 | 显微镜成像 |
| 科学级CCD相机 | QImaging | Retiga-2000R Fast 1394 | 显微镜成像 |
参考文献
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