本文介绍了三种不同的实验方法，用于研究Aeromonas对C. elegans的感染。利用这些简便的方法，可轻松评估不同Aeromonas物种之间及同一物种内部的毒性差异。
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本文内容
摘要
摘要
人类病原菌Aeromonas在临床上已被证实可引起胃肠炎、伤口感染、败血症以及尿路感染。大多数人类疾病被报道与四种细菌物种相关：Aeromonas dhakensis、Aeromonas hydrophila、Aeromonas veronii和Aeromonas caviae。模式生物Caenorhabditis elegans是一种以细菌为食的线虫，为研究Aeromonas的细菌致病机制提供了优良的感染模型。本文介绍了利用C. elegans模型研究Aeromonas感染的三种不同实验方法，包括生存率测定、液体毒性试验和肌肉坏死检测。这三种方法在测定Aeromonas毒力方面的结果具有一致性。A. dhakensis被证实是引起临床感染的四种主要Aeromonas物种中毒性最强的菌种。这些方法为评估Aeromonas种间及种内毒力提供了便捷手段，并有助于加深我们对Aeromonas感染致病机制的理解。
引言
临床研究表明，人类病原体Aeromonas可引起胃肠炎、伤口感染、败血症以及尿路感染1,2。大多数相关人类疾病已被报道与四种细菌物种有关：Aeromonas dhakensis、Aeromonas hydrophila、Aeromonas veronii和Aeromonas caviae2,3,4,5。在Aeromonas引起的感染性疾病中，软组织感染可导致人类严重的发病率和死亡率。其中，肌肉坏死是最严重的软组织感染形式6。通过观察感染后秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的存活情况及肌肉坏死程度，是推测Aeromonas毒力的一种便捷方法。
科学家们已开发出多种模式生物用于研究细菌感染。在以往的研究中，小鼠、斑马鱼和线虫被用作动物模型，以研究病原菌的致病机制和毒力 气单胞菌属....
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方案
1. 培养基的制备
注意：溶液配制方法见表1。
- 配制 M9 培养基12：将 1.5 g KH2PO4、5.66 g Na2HPO4 和 2.5 g NaCl 溶解于 500 mL 去离子水中。在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。待冷却至室温后，首次使用前加入 0.5 mL 1 M MgSO4。
- 配制线虫生长培养基（NGM）12：将 3 g NaCl、2.5 g 细菌蛋白胨和 20 g 琼脂溶解于 1 L 去离子水中。在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。待其在水浴中冷却至 55 °C 后，加入 1 mL 1 M CaCl2、1 mL 1 M MgSO4、1 mL 5% 乙醇胆固醇溶液和 25 mL 磷酸盐缓冲液。轻轻旋转混匀。
- 每 6 cm 培养皿中倒入约 5 mL NGM。避免平板表面产生气泡。将平板在室温下放置 1 夜，包装后于 4 °C 保存。使用前恢复至室温。
- 配制富集型 NGM（ENGM）：将 3 g NaCl、5 g 细菌蛋白胨、1 g 酵母提取物和 30 g 琼脂溶解于 1 L 去离子水中。在 121 °C 下高压灭菌 20....
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结果
通过遵循上述方案，可轻松区分四种毒性之间的差异 气单胞菌属 菌株。存活率测定 秀丽隐杆线虫 如图所示 图1. 存活率 秀丽隐杆线虫 感染了 气单胞菌属 物种，按从高到低顺序排列如下： A. caviae, A. veronii, A. hydrophila, 和 A. dhakensis. 尽管在不同种类之间以及同一种类内部的毒性方面存在差异 气单胞菌属 物种，存活率 秀丽隐杆线虫平均而言，在感染的蠕虫中表现出最高的死亡率 A. dhakensis毒力 A. hydrophila 差于 A. dhakensis (p < 0.01). 与之相比 A. dhakensis 和 A. hydrophila,两种减毒的毒力 A. veronii 和.......
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讨论
C. elegans 是一种以细菌为食的线虫，其在进化过程中自然摄取细菌作为食物，并发展出复杂的细菌先天免疫系统。维持和支撑这种免疫系统的两个主要器官是表皮和肠道9,13。C. elegans 的表皮和肌肉带在结构上类似于哺乳动物和人类的软组织6。由于这些特性，C. elegans 可作为研究气单胞菌（Aeromonas）感染发病机制的模式生物。
本文介绍了三种用于研究Aeromonas感染C. elegans的方法，这些方法代表了4种Aeromonas物种之间不同的毒性特征，并与临床观察结果相关联7。这些简便的方法可区分不同Aeromonas物种的毒性程度。利用这些方法，研究人员能够研究不同Aeromonas物.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢中国台湾的 C. elegans 核心设施，以及国立成功大学医院诊断微生物学与抗菌药物耐药性实验室提供 Aeromonas 分离株。同时感谢线虫遗传中心（CGC）和 WormBase。我们还感谢 Savana Moore 对稿件的编辑工作。
本研究部分得到了中国台湾科技部（MOST 105-2628-B-006-017-MY3）和国立成功大学医院（NCKUH-10705001）对 P.L. Chen 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 摇床培养箱 | YIH DER | LM-570R | 细菌培养 |
| K2HPO4 | J.T.Baker | MP021519455 | 培养基制备 |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-05 | 培养基制备 |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | MP021914405 | 培养基制备 |
| NaCl | SIGMA | 31434 | 培养基制备 |
| MgSO₄4 | SIGMA | M7506 | 培养基制备 |
| 琼脂 | Difco | 214530 | 培养基制备 |
| CaCl2 | SIGMA | C1016 | 培养基制备 |
| 胆固醇 | SIGMA | C8503 | 培养基制备 |
| 乙醇 | SIGMA | 32205 | 培养基制备 |
| KOH | SIGMA | P5958 | 培养基制备 |
| 6 cm 培养皿 | ALPHA PLUS | 46 | 琼脂平板制备 |
| 96孔板 | FALCON | 353072 | 液体检测 |
| 细菌蛋白胨 | Affymetrix/USB | AAJ20048P2 | 培养基制备 |
| 酵母提取物 | SIGMA | 92144 | 培养基制备 |
| 柠檬酸•H2O | SIGMA | C1909 | 培养基制备 |
| 三水合柠檬酸钾•H2O | SIGMA | 104956 | 培养基制备 |
| FudR | SIGMA | 1271008 | 培养基制备 |
| EDTA二钠 | SIGMA | E1644 | 培养基制备 |
| FeSO4•7 H2O | SIGMA | 215422 | 培养基制备 |
| MnCl2•4 H2O | SIGMA | 221279 | 培养基制备 |
| ZnSO₄4•7 H2O | SIGMA | 204986 | 培养基制备 |
| CuSO₄4•5 H2O | SIGMA | C8027 | 培养基制备 |
| 胰蛋白胨 | SIGMA | 16922 | 培养基制备 |
| 显微镜系统 | 尼康 | Eclipase Ti 倒置显微镜 | 显微镜成像 |
| 科学级CCD相机 | QImaging | Retiga-2000R Fast 1394 | 显微镜成像 |
参考文献
- Parker, J. L., Shaw, J. G. Aeromonas spp. clinical microbiology and disease. Journal of Infection. 62 (2), 109-118 (2011).
- Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. Skin and soft-tissue infections caused by Aeromonas species.....
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重印与许可
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