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方法文章

CAR T细胞介导的类球体杀伤实验

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DOI：

10.3791/58785

⸱

2018年12月12日

 ,  ,  , 
1Department of Cellular Therapy, Department of Oncology, Oslo University Hospital-Radiumhospitalet

本文内容

摘要

本方案旨在实时评估免疫治疗性重定向T细胞（CAR T细胞）对三维结构癌细胞（球状体）的细胞毒性作用。

摘要

免疫疗法已成为治疗其他疗法难以治愈的癌症领域中日益受到关注的方向。在所有免疫治疗方法中，嵌合抗原受体（CAR）重定向T细胞取得了最显著的成果，尤其是在儿童B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）的治疗中。传统的CAR T细胞验证方法依赖于对悬浮状态下的靶细胞以及异种移植模型中CAR T细胞特异性和功能性的检测。然而，体外观察结果常常与体内实验结果脱节，若增加一个环节——使用三维（3D）培养技术，则有望大幅减少人力和动物资源的消耗。利用潜在靶细胞生成类球体，模拟肿瘤细胞在动物模型中移植后的三维结构，是一种理想的替代方案。本文介绍一种经济、可靠且操作简便的方法，用于从转导的结直肠癌细胞系制备类球体，作为过继性细胞治疗（本文以CD19 CAR T细胞为例）的验证工具。该方法结合先进的活细胞成像系统，可实时监测类球体的生长、效应细胞的细胞毒性以及肿瘤细胞的凋亡过程。

引言

过继性细胞转移（ACT）代表了下一代癌症治疗方法。该方法依赖于将效应细胞（T细胞或NK细胞）注射到患者体内。这些细胞可通过基因改造携带一种受体，引导其靶向并摧毁肿瘤。最近的研究表明，当将一种针对B细胞标志物CD19的嵌合抗原受体（CAR）导入患者T细胞后，能够有效杀灭其癌症1。在CAR这一人工受体的设计中，包含特异性抗体片段，即抗原结合域被简化为称为单链可变区片段（scFv）的结构单元，并与T细胞信号传导结构域相连。尽管存在多种设计，但目前最常用的是被称为第二代CAR的设计，其结构包括用于TCR信号传导的CD3z结构域和一个共刺激结构域（如CD28、4-1BB、OX40等）1,2。当CD19 CAR-T细胞成功治疗了大量B细胞恶性肿瘤患者后，免疫治疗领域将主要关注集中于这种新型ACT形式3,4。在此成功基础上，研究人员尝试采用类似设计靶向实体瘤的其他表位，但收效有限。遗憾的是，由于肿瘤特异性抗原稀缺以及更为严苛的肿瘤微环境，CAR-T细胞在实体瘤治疗中的效果受到限制5。

目前最常用的 体外 验证策略依赖于二维（2D）系统，这些系统仅能解决上述实体瘤挑战中的一部分。传统上，2D 体外 系统采用CAR T细胞与作为单层培养的靶向癌细胞系混合，以评估这些效应细胞的功能性和特异性。尽管这些策略在研究中具有重要且关键的作用，但并未考虑癌细胞复杂的形态学特征及其三维（3D）结构。6癌细胞在三维培养系统（称为球状体）中培养时，会通过基因表达谱的改变获得新的表型特征7，这可能会影响被重定向的效应细胞的识别。Birgersdotter 及其同事证明，当霍奇金淋巴瘤（HL）细胞系仅在三维培养模型中生长时，会获得与原发性肿瘤样本相似的基因表达谱8因此，类球体或类似的三维培养方法相较于标准的二维体系，可提供更贴近生理状态的体外模型。此类系统也更接近体内研究，而体内实验被视为特定CAR验证过程的最终步骤。鉴于二维体系无法模拟癌细胞簇的形态特征，类球体则可形成类似结构，用于在体内实验前评估CAR T细胞的功能性 体内模型。在一项研究中，Pickl 等人发现，人表皮生长因子受体2（HER2）过表达癌细胞的球形模型表现出与体内模型相似的信号通路特征9这进一步支持了类球体能够为CAR T细胞提供更贴近体内环境且更具相关性的评估。此外，利用类球体对CAR T细胞进行验证，可能有助于更严格地评估其有效性，并防止部分设计方案过早进入体内研究阶段10；因此，通过减少动物使用量，有助于符合伦理要求的研究。此外，使用类球体的实验方案并不比传统的二维培养系统更昂贵，且比传统方法更快。 体内 综上所述，可以预见将类球体研究纳入体外与体内研究之间的关联分析，将很快成为常规做法。

本文介绍了由结肠癌细胞系 HCT 116 制备类球体的方法。该细胞系经过改造，可表达人 CD19 分子，从而使其对 CD19 CAR T 细胞敏感，并可利用临床验证过的 CAR 结构清晰评估杀伤效果。

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方案

1. 从结直肠癌细胞系生成球状体

  1. 用磷酸盐缓冲液（PBS；25 cm2 培养瓶使用 5 mL，75 cm2 培养瓶使用 10 mL）洗涤 HCT 116（稳定转导表达分化簇 19（CD19）和绿色荧光蛋白（GFP））细胞单层。加入胰蛋白酶（25 cm2 培养瓶使用 0.5 mL，75 cm2 培养瓶使用 1 mL），于 37 °C 孵育 5 分钟。
  2. 在显微镜下观察细胞脱落情况，并用完全 Roswell Park Memorial Institute 1640 培养基（RPMI 1640）（RPMI 1640 + 10% FCS + 庆大霉素；25 cm2 培养瓶使用 10 mL，75 cm2 培养瓶使用 20 mL）中和细胞解离酶。
  3. 将细胞悬液以 500 × g 离心 5 分钟。用移液器吸去上清液，并用 5 mL 完全 RPMI 1640 培养基反复吹打数次重悬细胞。
  4. 使用台盼蓝染色法在兼容的细胞计数仪上计数细胞。
  5. 将细胞悬液以 500 × g 离心 5 分钟。用移液器吸去上清液，并用 RPMI 培养基重悬，调整至细胞浓度为 5 × 103 个细胞/mL。
  6. 在室温下，用 100 µg/mL 多聚-L-赖氨酸（PLL）的 PBS 溶液以每孔 100 µL 包被 96 孔圆底板，孵育 1 小时。用 PBS 洗涤两次，让平板自然干燥。
  7. 将细胞悬液转移至无菌储液槽中，使用多通道移液器将 200 µL/孔的细胞悬液加入已包被 PLL 的 96 孔圆底板中。
  8. 将平板转移至培养箱内的自动成像装置中（37 °C，5% CO2，95% 湿度）。
  9. 登录采集软件，依次选择 计划采集 | 启动添加容器 | 按计划扫描 | 创建容器：新建。
  10. 选择扫描类型：类球体。选择感兴趣的通道：相差 + 明场（用于监测类球体生长）、绿色（用于监测肿瘤信号，采集时间 300 ms）和红色（用于监测细胞凋亡，采集时间 400 ms）。
    1. 选择所需的放大倍数：10×。
    2. 选择平板型号及其在抽屉中的位置。选择需要成像的孔位。输入实验描述信息：名称、细胞类型、细胞数量。
  11. 在分析设置中，选择 延迟分析至后续时间。右键单击时间轴，选择 设置所选扫描组间隔，将 每隔 设为 4 小时，总共 设为 24 小时。设定期望的起始时间（至少为放入自动成像装置孵育后 1 小时）。
  12. 每隔 2 天登录成像软件，检查类球体的生长情况。
    1. 选择 查看最近扫描 选项，双击目标实验。在图像通道面板中选择 明场，然后使用 测量图像特征 工具测量类球体的直径。类球体通常需要 6 天达到目标大小：直径 0.5 mm。在第 4 天每孔补充 50 µL 完全 RPMI 培养基，以减少培养基蒸发的影响。

2. CD19 CAR T 细胞的制备

  1. CD19 CAR T细胞的扩增
    注意：通过逆转录病毒对健康供体外周血单个核细胞（PBMCs）进行批量转导，可获得稳定表达CD19 CAR的T细胞，方法如前所述16。编码CD19 CAR的逆转录病毒载体为第二代CAR，包含fmc63 scFv链、CD8铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激结构域以及CD3ζ结构域。
    1. 为进行扩增，将转导后的T细胞与抗CD3/28磁珠共同培养，细胞与磁珠比例为1:1，培养时间为10–11天。扩增期间，细胞培养于完全培养基中（X-VIVO 15培养基，5% 血清替代物，以及100 U/mL重组人IL-2）。
      注意：高效扩增的理想细胞密度为1至2 × 106 个细胞/mL。根据初始细胞数量，可在细胞培养瓶中进行扩增（25 cm2 培养瓶加至20 mL，75 cm2 培养瓶加至40 mL总体积），置于细胞培养箱中（37 °C，5% CO2，95%湿度）。
    2. 作为后续实验的阴性对照组，将未转导的PBMCs（记为Mock组）与CD19 CAR T细胞平行进行相同的扩增流程。
    3. 从第3天开始，每天添加新鲜培养基，并在必要时将细胞分种至更多培养瓶中。
    4. 在第10–11天，以500 × g离心5分钟。弃去上清液，将所有细胞合并至一个50 mL离心管中，并用约30 mL新鲜完全培养基重悬细胞。
    5. 将含有重悬细胞的50 mL离心管置于磁力架上，使磁珠与培养基分离。
    6. 静置2–3分钟，使磁珠聚集于管壁一侧。
    7. 用移液器小心吸除培养基并转移至新管，避免触碰磁珠聚集区域。
    8. 重复磁珠去除步骤（2.1.5–2.1.7）一次，以进一步减少最终培养基中的磁珠残留。
    9. 重悬细胞并计数，用完全培养基调整细胞密度至1至2 × 106 个细胞/mL。
    10. 将细胞静置至少4小时，最长可过夜。随后直接在-80 °C条件下冻存，并于次日转移至液氮罐中长期保存。或者，也可延长静置时间至过夜，以便立即使用。
  2. 原代T细胞中CD19 CAR表达的检测
    1. 对扩增后的T细胞进行计数，因经过过夜培养或冻融后，细胞数量可能略有变化。
    2. 分别从CD19 CAR T细胞和Mock组原代T细胞中各取5 × 105 个细胞，加入不同的流式细胞术检测管中。
    3. 用200 μL流式缓冲液（含2% FBS的PBS）洗涤细胞，以500 × g离心5分钟。重复洗涤一次，以彻底去除培养基可能带来的干扰物质。
    4. 用流式缓冲液将一抗（生物素标记的山羊抗小鼠IgG，F(ab')₂片段特异性）按1:200比例稀释。
    5. 每管中加入100 μL抗体混合液重悬细胞，冰上孵育15分钟。重复前述洗涤步骤两次，以去除未结合的过量抗体。
    6. 用流式缓冲液将二抗（链霉亲和素-PE）按1:400比例稀释。
    7. 每管中加入100 μL二抗混合液重悬细胞，冰上孵育15分钟。重复前述洗涤步骤两次，以去除未结合的过量抗体。
    8. 每管中加入200 μL流式缓冲液重悬细胞，随后在流式细胞仪上进行检测分析。
    9. 使用Mock T细胞设定阴性和阳性门控，据此分析CD19 CAR转导T细胞的表达情况。

3. 三维肿瘤球杀伤实验

  1. 培养6天后或类球体达到所需大小时，从培养箱中取出培养板。使用多通道移液器，从类球体培养板中每孔轻轻吸出100 µL完全RPMI 1640培养基。
    1. 此步骤中，将移液器吸头倾斜朝向96孔板内壁，避免接触孔底，以尽量减少对类球体的扰动。剩余体积应约为100 µL。
  2. 通过将50 µL Annexin V红色染料与9.95 mL完全RPMI 1640培养基混合，配制1:200的Annexin V红色染料溶液。
  3. 向每孔加入100 µL的1:200 Annexin V红色染料溶液。
  4. 将培养板转移至培养箱（37°C，5% CO2，95%湿度）中孵育15分钟。
  5. 收集转导的CAR CD19 T细胞至15 mL离心管中，在500 × g条件下离心5分钟。用移液器吸去上清液，并用2 mL完全RPMI 1640培养基上下吹打数次重悬细胞。
  6. 使用台盼蓝染色法在兼容的细胞计数仪上进行细胞计数。
  7. 将细胞悬液在500 × g条件下离心5分钟。用移液器吸去上清液，并用RPMI培养基重悬，调整细胞浓度至2 × 105 个细胞/mL。
  8. 将细胞悬液转移至无菌储液槽中，使用多通道移液器向96孔圆底类球体培养板每孔分配100 µL。
  9. 将培养板重新转移回培养箱内的自动成像装置中（37 °C，5% CO2，95%湿度）。
  10. 登录采集软件，选择“计划采集”。
    1. 右键单击扫描时间轴，选择编辑时间轴。右键单击扫描组并将其删除。再次右键单击时间轴，选择设置选定扫描组间隔选项，将每隔设为1.5小时，总共添加设为24小时。
    2. 设置所需的起始时间（至少为放入自动成像装置孵育后1小时）。选择保存扫描计划。

4. 自动化图像分析

  1. 登录采集系统，选择 查看近期扫描 选项，然后选择 启动分析。选择 创建新分析定义 | 分析类型：球体（Spheroid）。勾选需要分析的图像通道（相差 + 明场、绿色和红色）。
  2. 选择至少 10 张具有代表性的图像：通常每种条件选择 1 张，且至少包含 3 个时间点（采集开始、中期和结束时）。
  3. 在整堆图像上预览默认的分析流程。
  4. 调整明场掩膜的参数。典型参数为：灵敏度 10，填补孔洞 1,000 µm2，最小面积 1,000 µm2。在整堆图像上预览，并确认所选参数能准确识别球体结构。
  5. 调整绿色通道掩膜（GFP）的参数。典型参数为：顶部帽分割（Top hat segmentation），半径 200 µm，阈值 3 GCU，关闭边缘分割，填补孔洞 5,000 µm2，调整大小 -2 像素，最小面积 3,000 µm2。在整堆图像上预览，并确认所选参数能准确识别球体结构。
  6. 调整红色通道掩膜（Annexin V）的参数。典型参数为：顶部帽分割（Top hat segmentation），半径 150 µm，阈值 2 GCU，关闭边缘分割，填补孔洞 5,000 µm2，调整大小 0 像素，最小面积 1,000 µm2。在整堆图像上预览，并确认所选参数能准确识别球体结构。
  7. 启动分析器。
    1. 分析完成后，提取感兴趣的测量数据。选择已分析的文件，然后选择 图表指标 选项。选择感兴趣的指标、扫描图像和孔位。通常，以明场边界为限定范围的红色和绿色总荧光强度可提供最准确的测量结果，因为该方法将荧光信号限制在由明场掩膜确定的球体边界内（图 3）。通过点击“导出数据”按钮，可将选定的指标导出为多种文件格式。
  8. 选择已分析的文件，然后选择 导出图像和视频 选项，以进行图像和视频的提取。提供两种选项：“按显示导出”可获取成像软件中所见的图像和视频（通常为合成图像）；“按存储导出”则可获取原始数据，用于通过第三方软件进行外部分析。

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结果

如图1所示，通过流式细胞术检测T细胞上CD19 CAR的表达水平（图1A）以及HCT116肿瘤细胞系上CD19的表达水平（图1B）至关重要。图2展示了一个典型的类球体实验结果。自动成像设备在四个不同通道中拍摄图像：明场、相差、绿色荧光和红色荧光。相差通道用于显示类球体周围高对比度的边界，以确认类球体的形成（这是类球体形成的标志）。在分析过程中，明场图像用于检测类球体的大小，并将绿色信号（肿瘤）和红色信号（凋亡）限制在上述边界内。这可以排除与类球体无直接关联的事件（例如孤立的肿瘤细胞及其凋亡）。绿色和红色轮廓分别代表在指标计算中所考虑的绿色和红色信号。在图2中，明场、相差、绿色和红色通道的图像通过“As stored”选项提取，而复合图像则通过“As displayed”选项提取...

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讨论

近年来，类球体作为验证未来癌症治疗的一种创新工具，已成为备受关注的研究领域。类球体代表了传统二维体外分析与体内评估之间的中间环节。该方法在模拟肿瘤微环境以及基因表达谱分析方面展现出巨大潜力。7本出版物中所述方案改编自 Saheen 的方法。 等人11 连接至 Incucyte S3，是一种经济且简便的方法，可用于从结直肠癌细胞系生成三维肿瘤类球体。将类球体的生成与高通量成像设备相结合，可实现对多种抗肿瘤药物的快速、可靠筛选，并监测上述药物破坏肿瘤结构的能力。

关于本实验方案，有几个关键步骤需要特别注意。首先，起始的肿瘤细胞数量必须精确调整。如果起始细胞密度过高，细胞会迅速降解PLL涂层，并开始形成贴壁的单层细胞；相反，若细胞数量过低，则会导致每个孔中类球体的大小和数量出现较大变异性。其次，使用自动成像设备会使细胞暴露于潜在的光毒性风险中（尤其是当使用多个荧光通道时）；建议调整图像采集频率，以尽量减少对类球体的损伤。为了可靠地捕捉到感兴趣的事件，该参数至关重要（据我们所知...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由挪威研究理事会（资助号：#244388、#254817 和 #284983）、挪威癌症协会（资助号：#6829007）以及挪威东南卫生区（资助号：#17/00264-6 和 #2016006）提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液SIGMA-ALDRICHD8537-500ML批号： RNBG7037
75 cm² 培养面积培养瓶VWR430639批号： 2218002
75 cm² 培养面积培养瓶VWR734-2705批号： 3718006
胰蛋白酶-EDTASIGM-ALDRICHT3924-100ml批号： SLBTO777
RPMI 1640 培养基（含 L-谷氨酰胺），10 × 500 mLLife Technology (Gibco)21875-091批号： 1926384
胎牛血清Gibco10500064批号： 08Q3066K
庆大霉素Thermo Fischer15750060批号： 1904924A
台盼蓝溶液，0.4%Thermo Fischer15250061批号： 1886513
96 孔圆底板VWR734-1797批号： 33117036
Dynabeads 人 T 细胞激活剂 CD3/CD28Thermo Fischer11132D-
X-VIVO 15 培养基（含庆大霉素、L-谷氨酰胺、酚红），1 LBioNordikaBE02-060Q批号： 8MB036
CTS 免疫细胞血清替代物Thermo FischerA2596102批号： 1939319
IL-2 ProleukinNovartis批号： 505938M
IncuCyte Annexin V 红色试剂Essen Bioscience4641批号： 17A1025-122117
试剂储液槽VWR89094-672批号： 89094-672
15 mL 离心管VWR734-1867批号： 19317044
抗人 CD19-PEBD Biosciences555413批号： 4016990
RRID： AB_395813
生物素-SP（长间隔）AffiniPure F(ab')2 片段山羊抗小鼠 IgGJackson ImmunoResearch115-066-072批号： 129474：
RRID： AB_2338583
链霉亲和素-PEBD Biosciences554061批号： 5191579：
RRID： AB_10053328
HCT 116 结直肠癌细胞系ATCCCCL-247-
Incucyte S3Essen Bioscience

参考文献

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