通过单个端粒可视化活细胞中端粒重复序列包含RNA（TERRA）的癌细胞克隆构建

摘要

本文介绍一种在单个亚端粒区域插入MS2序列标签以生成癌细胞克隆的实验方案。该方法基于MS2-GFP系统，可在活细胞中实现对单个端粒来源的端粒重复序列包含RNA（TERRA）内源性转录本的可视化观察。

摘要

端粒被转录产生含有端粒重复序列的长链非编码RNA（TERRA），据认为其在端粒生物学中发挥重要作用，包括异染色质形成和端粒长度稳态的调控。最新研究发现，TERRA分子还可与染色体内部区域相互作用，从而调控小鼠胚胎干细胞（ES细胞）中的基因表达。与此证据一致，RNA荧光 原位 杂交（RNA-FISH）分析表明，仅有一部分TERRA转录本定位于染色体末端。深入理解TERRA分子的动态行为将有助于阐明其功能及作用机制。本文介绍了一种利用MS2-GFP系统在癌细胞中标记并可视化单个端粒TERRA转录本的方法。为此，我们提供了一项实验方案，以AGS人胃癌细胞系为例，构建稳定克隆，使其在单一亚端粒区整合MS2序列。当带有MS2标签的端粒转录产生TERRA时，会表达出带有MS2标签的TERRA分子；通过共表达与GFP融合的MS2 RNA结合蛋白（MS2-GFP），可在活细胞荧光显微镜下观察到这些分子。该方法使研究人员能够研究癌细胞中单个端粒来源TERRA分子的动态变化，并可推广应用于其他细胞系。 关键词：TERRA转录本，端粒，MS2-GFP系统，活细胞成像，RNA-FISH，AGS细胞系，染色体末端，单分子标记

引言

长链非编码RNA TERRA从染色体的端粒近端区域转录，其转录方向朝向染色体末端，并在端粒重复序列区域内终止^1,2因此，TERRA 转录本的5'端包含由亚端粒区衍生而来的序列，并以端粒重复序列（在脊椎动物中为UUAGGG）结尾³TERRA 被认为在端粒处的异染色质形成中发挥重要作用^4,5DNA复制⁶促进染色体末端之间的同源重组^7,8,9，调控端粒结构¹⁰端粒长度稳态^2,11,12,13此外，TERRA 转录本与小鼠胚胎干细胞（ES 细胞）中大量端粒外位点相互作用，从而调控广泛的基因表达^....

方案

1 . 新霉素抗性克隆的筛选

1. 在添加了10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素（每毫升培养基0.5单位）和链霉素（0.2 µg 每毫升培养基）于 37 °C 和 5% CO₂₂以 1:10 的摩尔比将 sgRNA/Cas9 表达载体与 MS2 盒式元件共同转染至汇合度为 50–60% 的细胞中²¹.
   注意：在平行实验中，通过转染表达GFP的载体来验证转染效率（即， Cas9-GFP 载体）。转染效率应达到至少 60-70%。
2. 次日，将培养基更换为含有0.7 mg/mL新霉素的培养基 µg/mL 终浓度（选择性培养基）。
   注意：转染后的第二天将细胞分装并接种至选择性培养基中，可加快筛选进程。所有未转染的细胞将立即死亡。若转染在6孔板中进行，则每孔在60%汇合度时约含有0.7 × 10⁶个细胞。⁶ 细胞，次日可将细胞从单孔转移至含选择性培养基的10 cm培养皿中进行传代。
3. 将细胞置于选择性培养基中培养7-10天，每1至2天更换一次培养基，直至可见单个克隆。
4. 细胞克隆的挑选
   1. 准备一个96孔板，每孔含有10 µ每孔加入0.25%胰蛋白酶L。
      注意：若预计挑选的克隆数超过96个，请准备两块96孔板。

结果

图 1 展示了实验策略的总体概述。图中显示了在 AGS 细胞中生成 TERRA-MS2 克隆的主要实验步骤及相应的时间安排（图 1A）。第 1 天，将 MS2 插入片段（cassette）和表达 sgRNA/Cas9 的载体共转染至 6 孔板的多个孔中（如 图 1B 所示）。两条不同的 15q 端粒近端特异性引导 RNA 序列被克隆至表达 Cas9 切口酶的 pX335 载体中，生成两种 sgRNA-pX335 载体，并与 MS2 插入片段共同转染。6 孔板中的一个孔可转染表达 GFP 的载体，以验证转染效率。第 2 天，细胞经胰酶消化后，从单个孔转移至含筛选培养基的 10 cm 培养皿中。第 3 天更换培养基，此时大多数未转染的细胞已死亡。细胞在筛选培养基中持续培养，直至可见单克隆形成并可用于挑取。在此.......

讨论

本文介绍一种生成含MS2序列的人类癌细胞克隆的方法，其中MS2序列已整合至15q亚端粒区域。利用这些克隆，可通过共表达MS2-GFP融合蛋白，利用荧光显微镜检测由15q亚端粒转录的MS2标记的TERRA分子。该方法使研究人员能够在活细胞中研究来自单个端粒的TERRA动态行为²¹。在本实验方案中，TERRA-MS2克隆选自AGS细胞系，该细胞系是研究TERRA的一个理想模型系统，因为TERRA在人类胃癌样本中的表达水平上调²⁴。然而，本文所述方案可经调整后适用于其他细胞系中TERRA-MS2克隆的筛选。原则上，通过使用特异性的MS2表达盒和CRISPR策略，可将MS2序列整合至除15号染色体端粒以外的其他亚端粒区域。本方法中采用Cas9切口酶（nickase）和双导向RNA，以提高整合的特异性²²。采用该策略，在AGS细胞中预计可鉴定出约2%的阳性克隆。也可尝试测试其他类型的Cas9酶，以提高克隆筛选的成功率²⁵。此外，为最大化克隆筛选效率，需特别注.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AGS细胞	-	-	Christian Baron（Université 德蒙特é等）
F12K 营养混合物 1X	GIBCO	21127022	AGS细胞培养基
L-谷氨酰胺	CORNING	MT25005CI	细胞培养基成分
青霉素-链霉素溶液	CORNING	30-002-CI	细胞培养基成分
胎牛血清	Sigma Aldrich	F2442	细胞培养基成分
DMEM 1X	GIBCO	21068028	phoenix细胞培养基
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016	用于凤凰细胞转染
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	用于凤凰细胞转染（HBS 溶液）
KCl	Sigma Aldrich	P9333	用于凤凰细胞转染（HBS 溶液）
葡萄糖	Sigma Aldrich	D9434	用于凤凰细胞转染（HBS 溶液）
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	用于凤凰细胞转染（HBS 溶液）和逆转录病毒沉淀
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S3264	用于Phoenix细胞转染（HBS溶液）
1×胰蛋白酶EDTA溶液	CORNING	59430C	用于细胞传代
DPBS 1X	GIBCO	14190250	杜氏磷酸盐缓冲液
DMSO	Sigma Aldrich	D8418	细胞冻存液组分（80% FBB 和 20% DMSO）
G-418 硫酸二氢盐	福麦迪亚	G4185	筛选药物
明胶溶液 生物试剂	Sigma Aldrich	G1393	96孔DNA板的封板与冻存
Tris碱	Fisher BioReagents	10376743	基因组DNA提取用细胞裂解缓冲液组分
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	基因组DNA提取用细胞裂解缓冲液组分
SDS	Sigma Aldrich	71729	基因组DNA提取用细胞裂解缓冲液组分
蛋白酶K	赛默飞世尔科技	AM2546	基因组DNA提取用细胞裂解缓冲液组分
RNA酶A	赛默飞世尔科技	12091021	DNA 提取过程中的 RNA 降解
琼脂糖	Sigma Aldrich	A5304	DNA凝胶制备
Atlas ClearSight	Bioatlas	BH40501	用于在琼脂糖凝胶中检测DNA和RNA样品的染色试剂
乙醇	Fisher BioReagents	BP28184	DNA沉淀
乙酸钠	Sigma Aldrich	71196	用于在3M浓度、pH 5.2条件下进行DNA沉淀
Wizard SV 凝胶与 PCR 纯化系统	Promega	A9282	从琼脂糖凝胶中提取PCR片段以进行新霉素阳性克隆的PCR筛选
Trizol	AMBION	15596018	用于RNA提取的有机溶剂
Dnase I	赛默飞世尔科技	89836	基因组DNA从RNA中的降解
dNTPs 混合物	Invitrogen	10297018	用于逆转录和PCR反应
DTT	Invitrogen	707265ML	用于RT反应
焦碳酸二乙酯	Sigma Aldrich	D5758	用于以1:1000稀释度使水中的RNase失活
Ribolock	赛默飞世尔科技	EO0381	RNase 抑制剂
MOPS	Sigma Aldrich	M9381	RNA凝胶的制备
多聚甲醛	电子显微镜科学公司	15710	变性RNA凝胶的制备（含1% PFA的1x MOPS）
Superscript III 逆转录酶	Invitrogen	18080-093	逆转录反应
Pfu DNA聚合酶（重组）	赛默飞世尔科技	EP0501	PCR反应
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX	PCR BIOSYSTEMS	PB 20.14	qPCR 反应
Cre-GFP 腺病毒	https://medicine.uiowa.edu/vectorcore	1174-HT	用于感染 TERRA-MS2 克隆以去除 neomycn 基因
丁酸钠	Sigma Aldrich	B5887	用于促进Phoenix细胞中逆转录病毒颗粒的产生
PEG8000	Sigma Aldrich	89510	逆转录病毒颗粒的沉淀
35µ玻璃底培养皿	Ibidi	81158	用于TERRA-MS2克隆的活细胞成像分析