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不同环境条件下生物气溶胶的组成与分布分析

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DOI：

10.3791/58795

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2019年1月7日

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1Academy of Military Medical Sciences, 2Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3The Experimental High School Attached to Beijing Normal University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

了解环境颗粒物的生物组成对于研究其对人类健康和疾病传播的重要影响具有重要意义。本文采用三种生物气溶胶采样方法及对空气微生物的生物学分析，以更深入地探究不同环境条件下空气微生物群落的特征。

摘要

不同环境条件下，颗粒物（PM）中多变的微生物可能对人类健康产生显著影响。本研究描述了一种用于分析环境颗粒物中生物组分的多种检测方法的实验方案。共包含五项实验：（1）使用激光颗粒计数器监测颗粒物数量；（2）利用旋风式气溶胶采样器采集颗粒物；（3）使用带滤膜的高流量空气采样器采集颗粒物；（4）采用安德森六级采样器采集可培养微生物；（5）通过细菌16S rDNA和真菌ITS区域测序检测环境颗粒物的生物组成。本研究选取雾霾天气和畜禽养殖场作为该方案应用的两个典型实例。结果表明，旋风式气溶胶采样器与滤膜采样器在采样效率上存在差异：在采集细菌方面，旋风式气溶胶采样器表现更优；而在采集真菌方面，两种方法效率相当。滤膜采样器可在低温条件下运行，而旋风式气溶胶采样器则存在温度使用限制。撞击式固相采样器（如安德森六级采样器）可将生物气溶胶直接采集至培养基中，从而提高可培养微生物的存活率。然而，该方法主要依赖培养技术，而超过99%的微生物无法被培养。从安德森六级采样器采集的可培养细菌、以及旋风式气溶胶采样器和滤膜采样器采集的样品中提取DNA，随后通过细菌16S rDNA和真菌ITS区域测序进行检测。上述所有方法在环境监测和空气传播病原体检测等多个研究领域具有广泛的应用前景。根据本研究结果，这些方法可在不同条件下使用，有助于其他研究人员进一步探究环境生物气溶胶对健康的影响。

引言

在自然环境中，生物气溶胶中含有多种微生物，包括真菌、细菌、病毒及其他微生物1。空气中的微生物可由某些人类活动释放，例如畜禽养殖场中的动物饲养作业，是大气环境的重要组成部分2。这些微生物不仅可能在大气环境中发挥重要作用，还可能对人类健康和疾病传播产生显著影响。

微生物气溶胶作为疾病传播的重要途径，已在全球范围内引起广泛关注。近期研究表明，许多人类疾病与不同地区环境颗粒物（PM）的复杂成分相关，例如化工厂、畜牧场和雾霾城市中的颗粒物3,4。PM 的生物成分可能对暴露于颗粒物的人群引发某些呼吸系统和心血管疾病5。人体不同部位，如黏膜、皮肤、消化道和呼吸道，均可能成为附着在颗粒物上的微生物的作用靶点6,7。长期暴露于 PM2.5 可能增加患肺癌的风险8。

全球多个国家的不同地点均已开展过空气传播细菌的调查，包括地铁站、兽医医院、屠宰场、堆肥设施、皮革厂、乳品加工场所、煤矿、牙科诊所及室内环境9,10,11,12,13,14,15,16,17，由此产生了大量关于生物气溶胶的报告。在雾霾天气下，与校园、养殖场和大城市相关的人员密集场所是三种尤为重要的公共环境，亟需探究人类健康与PM暴露潜在影响之间的关联。此外，在中国北方城市的冬季，较高的PM2.5浓度可能对人体健康造成影响。尽管PM2.5可通过作用于呼吸道表面并溶入血液而产生毒性效应18，但附着在PM2.5上的微生物是否以及如何可能影响人类健康仍不明确19,20。养殖场是空气中PM和微生物气溶胶的主要来源之一。在养殖场周边区域，气溶胶携带大量病原体，如流感病毒和Brucella melitensis，这些是导致 livestock 和家禽从业人员发生呼吸道疾病的重要因素。

本研究探讨了生物气溶胶的多种分析方法，包括颗粒物数量监测、生物气溶胶采集及生物组分分析。空气样品通过旋风式气溶胶采样器、带滤膜的高流量空气采样器以及安德森六级采样器进行采集。随后，利用这三种采样器采集的样品通过细菌16S rDNA和真菌ITS测序等生物学分析方法，确定其生物组成。本文展示了在北京雾霾天气期间和畜禽养殖场采集的生物气溶胶样品的代表性结果，表明生物气溶胶可能对人类和动物健康产生重大影响。本研究还主要基于16S DNA和真菌ITS测序数据，比较了液体采样与滤膜采样方法。

方案

1. PM 数值监测

  1. 使用气载激光粒子计数器（参见 材料表）以确定总颗粒物数量。通过空气悬浮激光颗粒计数器顶部的空气采样口收集颗粒物。
    注意：该粒子计数器为自动化设备，当程序设定好采样时间、间隔时间和采集次数后，可独立运行工作。 等等。 已在触摸屏上设置。
    1. 为仪器配备用于监测温度和相对湿度的传感器。每5 min同时测量并记录一次温度和相对湿度数据。
    2. 总共测量并记录 6 个不同的粒径等级（0.3-0.5 μm, 0.5-0.7 μm, 0.7-2.5 μm, 2.5-5 μm, 5-10 μm 和 > 10 μm）每 5 分钟同步测量一次。另测量 4 个其他粒径类别（0.3-0.5 μm, 0.5-1 μm, 1-3 μm 且 ≥ 3 μm).
    3. 通过采样器顶部的采样孔采集空气样品，并利用采样器内部的检测模块测量各PM的粒径。随后数据将自动存储。在通过空气中激光粒子计数器的微型触摸显示屏设置相关参数（包括采样时间和计数范围）后，上述所有过程均可自动完成。
      注意：该颗粒计数器是一种自动化设备，配备有检测模块，可对不同粒径类别颗粒物（PM）的数量进行计数。
  2. 为评估实验标准误差，需确保不同粒径类别至少进行15次重复计数。读数应保存在仪器的内部存储器中，随后进行分析。
    1. 确保对原始数据的分析包括颗粒物数量浓度、方差分析（ANOVA）检验以及各粒径区间内颗粒物所占百分比。例如，如图所示 图1A，12 月份的 PM 数浓度（237.6 个粒子/cm³）3）显著高于10月份（平均值：110.2 个粒子/cm3（方差分析；P 值） < 0.05). 图1B 显示小于的颗粒数量 3 μm 占总数的99%以上。
    2. 使用激光颗粒物计数器监测PM数量浓度，并自动存储数据。使用U盘将数据导出至计算机，并进行方差分析（ANOVA）检验。

2. 旋风式气溶胶采样器采集颗粒物

  1. 在远离任何主要污染源的开阔区域，距地面约 2 m 处进行 PM 采样。
    1. 记录采样点的位置。例如，北京理工大学校园的位置如下：39°57’51.0’’ N；116°19’38.5’’ E。
  2. 使用旋风式气溶胶采样器采集空气样品。采样流量设为 323 L/min，采集时间为 6 h。
    注意：该采样器的流量固定，不可调节。由于采样器上仅有 开始 和 停止 按钮，采集时间需通过人工计时控制。
    1. 采集前，用无菌水清洗旋风式气溶胶采样器内部 3 次，并通过连续按压采集按钮 3 次，启动自动清洗功能清洗 3 次。
    2. 按下采集按钮开始采样，按下泵按钮停止采样。将采样器放置于架子或地面上，无需人员手持固定。
    3. 所有样品在后续分析前均需避光保存于 -20 °C 环境中。

3. 滤膜法颗粒物采集

  1. 在远离主要污染源的开阔区域，距地面约 2 m 处进行 PM 采样。
    1. 记录采样点的位置。例如，北京理工大学校园的位置如下：39°57’51.0’’ N；116°19’38.5’’ E。
  2. 使用大流量空气采样器（参见材料表），以 1,000 L/min 的流速，将 PM 样品采集到 20.32 × 25.4 cm2 的滤膜上（参见材料表）。通过相应的自动编程设置流速和采样时间。
    1. 将所有采集后的滤膜避光保存于 -20 °C，直至后续分析。

4. 生物组成分析

  1. 进行生物成分分析时，根据制造商提供的操作说明，使用旋风式气溶胶采样器的液体样品或滤膜样品，通过多源DNA提取试剂盒（见材料表）进行DNA提取。
    1. 对于使用大流量空气采样器采集的滤膜样品，取每份滤膜的1/8用于DNA提取。将滤膜放入50 mL离心管中，使样品面朝内，背面朝向管壁。在滤膜含有样品的一侧中央位置加入10颗研磨珠。
    2. 在室温下涡旋振荡管子15分钟。用移液器将管中的液体转移至洁净的50 mL离心管中，继续进行DNA提取步骤。
  2. 按以下步骤从样品中提取DNA。
    1. 将细菌样品在2,000 × g条件下离心5分钟，弃去上清液，并将菌体悬浮于2 mL无菌PBS缓冲液中。
    2. 将细菌悬液收集至2 mL离心管中，再以2,000 × g离心5分钟，弃去上清液。
    3. 向含有悬浮细菌的溶液中加入350 μL无菌PBS缓冲液。
    4. 加入0.8 mL RNase A。
    5. 加入150 μL Buffer CL和8 μL蛋白酶K，立即涡旋振荡1分钟以混匀。短暂离心（1,000 × g，30秒，确保管壁无残留）后，将离心管置于56 °C水浴中10分钟。
    6. 加入350 μL Buffer PD，混匀30秒，然后在12,000 × g条件下离心10分钟。
    7. 将DNA纯化柱放入一个2 mL离心管中，将步骤4.2.6中得到的混合液转移至纯化柱中，然后在12,000 × g条件下离心1分钟。
    8. 弃去滤液，将纯化柱内容物放回原2 mL离心管中，加入50 μL Buffer W1。在12,000 × g条件下离心1分钟。
    9. 弃去滤液，将纯化柱内容物放回原2 mL离心管中，加入700 μL Buffer W2。在12,000 × g条件下离心1分钟。重复此步骤，再次用700 μL Buffer W2洗涤一次。
    10. 弃去废液，将纯化柱内容物放回原2 mL离心管中，在12,000 × g条件下离心1分钟。
    11. 将DNA纯化柱中的内容物转移至另一个洁净的1.5 mL离心管中，向纯化柱膜中央加入100 μL洗脱液或去离子水（洗脱液或去离子水需预热至65 °C）。室温静置1分钟，然后在12,000 × g条件下离心1分钟。
  3. 进行定量实时聚合酶链式反应（Q-RT-PCR），以定量采样滤膜上细菌和真菌的相对丰度。
    1. 使用以下引物：针对细菌16S rDNA，515F（5’- GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3’）和806R（5’- GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3’）；针对真菌ITS，ITS1（5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’）和ITS1（5’-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3’）。
    2. 在实时荧光定量PCR系统上运行Q-RT-PCR实验（见材料表）。RT-PCR反应条件：预变性95 °C、10分钟；变性95 °C、15秒；退火与延伸60 °C、1分钟；从变性到退火延伸共进行40个循环。
  4. 对细菌和真菌群落结构进行分析时，通过PCR扩增细菌16S rDNA的V1–V3区和真菌rRNA操纵子的ITS区。
    1. 使用以下引物：细菌引物为V1-9F（5′-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG ACG AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3′）和V3-541R（5′-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-barcode-ACW TTA CCG CGG CTG CTG G-3′）；真菌引物为ITS-3F（5’-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG CAC ATC GAT GAA GAA CGC AGC-3’）和ITS-4R（5’-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-barcode-GCT CCT CCG CTT ATT GAT ATG C-3’）。
    2. 确保每个20 μL的PCR反应体系包含：2 μL 2.5 mM dNTPs、4 μL 5× FastPfu Buffer、每种引物（5 μM）各0.8 μL、0.4 μL FastPfu DNA聚合酶，以及10 ng模板DNA（见材料表）。
    3. PCR程序如下：94 °C预变性5分钟；随后进行10个循环：94 °C变性30秒，55–60 °C退火45秒，72 °C延伸90秒；再进行20个循环：94 °C变性30秒，55 °C退火45秒，72 °C延伸90秒；最后在72 °C延伸5分钟。
  5. 按照先前研究中所述方法进行DNA纯化、DNA定量及焦磷酸测序21。

5. 生物气溶胶采样与培养

  1. 使用国际标准 Andersen 六级采样器（参见 材料清单使用采样速率为 28.3 L/min 的采样器采集可培养的空气细菌和真菌。采样时间为 35 min。将培养皿置于采样器的每一级中。每次采样后，用 75% 乙醇对采样器进行充分消毒。
    注意：采样器的流速是固定的，采集时间由人工计时控制。
    1. 使用安德森六级采样器对六个阶段进行采样，该采样器依据空气中颗粒物的空气动力学直径进行划分，包括第六级（0.65–1.1 μm），第V期（1.1–2.1 μm），IV期（2.1–3.3 μm），III 期（3.3–4.7 μm），II 期（4.7–7.0 μm）以及 I 期（≥7.0 μm).
    2. 收集各阶段的细菌颗粒，并接种至含有大豆胰蛋白胨琼脂（Soybean-Casein Digest Agar）的培养皿中（参见 材料表）。采样器的每一级均有一个顶部带有多处进气口的容器。
    3. 培养空气中的细菌收集平板于 37 °C 培养24-48小时后；然后，计数每个阶段样品培养皿中的细菌菌落数量。
  2. 为防止安德森六级采样器收集的粒子重叠，需按以下公式校正各级采样器上的菌落数：
    概率计算公式，Pr=N(1/N+1/(N-1)+...+1/(N-r+1))，数学方程。
    其中 Pr：每个水平校正后的菌落数，
    N：采样器各级采样孔的数量（400），以及
    r：菌落数的实际计数值。
  3. 计算每毫升的菌落数3 空气如下：
    浓度计算公式：C = (N1+N2+N3+N4+N5+N6)/(t×F)×1000。
    其中 C：浓度（CFU/m3),
    N1- N6：每个水平校正后的菌落数量，
    T：采样时间（min），以及
    F：采样流量（28.3 L/min）。
  4. 采用5.1–5.3步骤中的方法研究养猪场中的生物气溶胶，包括四种类型的猪舍。
    注意：该 livestock farm 位于中国长春。每个猪舍的采样位置选择距地面 2 m 的中心位置。细菌培养后，按照步骤 6.1 - 6.2 所述方法处理平板上的所有菌落。

6. 可培养细菌的鉴定

  1. 培养48 h或72 h后，将细菌转移至2 mL离心管中。使用多源DNA提取试剂盒提取这些细菌或真菌的DNA（参见 材料清单）。DNA 提取过程见第 4.2 节。
  2. 使用 200 μL 用于DNA提取的样本 16S rDNA 测序。在生物组成分析中采用与步骤4.2、4.3和4.4所述相同的方法.

结果

本研究对某奶牛场在9月至12月期间的总悬浮颗粒物（PM）分布情况及生物气溶胶进行了全面评估。多种环境因素影响气溶胶颗粒的分布。我们使用TSI激光粒子计数器测定了牛舍内颗粒物的浓度及其粒径分布。如图1A所示，气溶胶颗粒浓度在12月最高，10月最低，这可能与温湿度的变化有关（Table 1）。可吸入气溶胶颗粒（0.3–3.0 µm）的浓度占总颗粒物浓度的99%以上（图1B），此类颗粒可进入人和动物的深部呼吸道，造成严重危害。

可通过DNA提取以及细菌16SrDNA和真菌ITS区域测序，而非微生物培养，对样品进行生物组成分析。通过对使用旋风式气溶胶采样器或带滤膜的高流量空气采样器采集的生物气溶胶样品进行生物学分析，可初步比较这两种方法在收集细菌和真菌方面的效率。图2展示了2016年12月20日在北京理工大学校园内雾霾天气期间采集的生物气溶胶样品的分析结果。在细菌采集方面，结果显示旋风式气溶胶采样器采集到的属数量远多于带滤膜的高流量空气采样器（图2A）。在真菌采集方面，这两种采样器表现出相当的采集效率和几乎相同的属丰度（图2B）。根据图2所示结果，可评估这两种方法在细菌和真菌采集效率上的差异。在细菌采集方面，旋风式气溶胶采样器的表现明显优于带滤膜的高流量空气采样器，因为前者的样品显示出更高的属丰度（图2A）。然而，对两种不同采样方法所得样品的真菌测序分析显示，其群落结构几乎完全相同（图2B）。

我们采用安德森六级采样器研究了空气中的可培养细菌。如图3所示，I至VI级颗粒物中可培养细菌的菌落数量呈递减趋势。I级颗粒物（粒径 > 8.2 µm）中可培养细菌菌落数量最多。在四种不同类型的猪舍（包括产仔舍、妊娠母猪舍、育肥舍和断奶仔猪舍）中，I级菌落所占比例分别为33%、30%、26%和34%。II级菌落在上述四种猪舍中的比例分别为20%、22%、19%和20%。III级菌落在四种猪舍中的比例分别为18%、18%、18%和19%。IV级菌落在四种猪舍中的比例分别为17%、16%、16%和16%。V级菌落在四种猪舍中的比例分别为10%、10%、14%和6%。VI级颗粒物（粒径 < 1.0 µm）中可培养细菌菌落数量最低，在四种猪舍中的VI级菌落比例分别为3%、5%、6%和5%。

采用安德森六级采样器在四种不同类型的猪舍中采集空气样本，并在适宜条件下进行培养。提取各粒径阶段可培养细菌的全基因组DNA，并通过细菌16S rDNA和真菌ITS区域测序进行检测。在猪舍可培养细菌中，共鉴定出91个属、158种细菌。哺乳舍、妊娠母猪舍、育肥舍和断奶舍这四种不同类型猪舍中可培养细菌群落结构如图4所示，数据涵盖I至VI级阶段。不同猪舍中优势细菌属的组成含量存在差异。

颗粒物分析；箱线图，柱状图；不同月份颗粒物变化；颗粒物粒径分布。
图1：四种不同月份中颗粒物（PM）的浓度与粒径分布。（A）研究期间颗粒物数量的箱线图。每个箱线图包含数据集的最大值、最小值、中位数、两个四分位数以及异常值。（B）颗粒物平均粒径分布图。9月至12月牛舍内共有80头牛。四个月份（9月、10月、11月和12月）中粒径≥ 3 µm的颗粒物所占比例分别为0.005、0.005、0.002和0.002。请点击此处查看此图的放大版本。

微生物多样性分析，细菌和真菌丰度的柱状图，空气采样器研究。
图 2：两种采样器采集的生物气溶胶样本的生物学分析。 (A) 和 (B) 显示采用不同采集方法获得的生物气溶胶样本中细菌或真菌属的丰度。湿壁式空气采样器代表旋风式气溶胶采样器。石英滤膜代表带滤膜的高流量空气采样器。请点击此处查看该图的放大版本。

显示按 S1-S6 分类的猪舍类型百分比的堆叠条形图。
图3：四种类型猪舍中可培养细菌的平均层级分布图。 四种类型的猪舍分别为产房、妊娠母猪舍、育肥舍和断奶舍。S1 至 S6 代表 Andersen 六级采样器采集的六个颗粒阶段（I 至 VI）。这些阶段根据空气颗粒的空气动力学直径进行划分，包括第 VI 阶段（0.65–1.1 µm）、第 V 阶段（1.1–2.1 µm）、第 IV 阶段（2.1–3.3 µm）、第 III 阶段（3.3–4.7 µm）、第 II 阶段（4.7–7.0 µm）和第 I 阶段（7.0 µm）。请点击此处查看此图的放大版本。

微生物多样性分析柱状图；按地点划分的相对丰度；细菌种类排序。
图4：不同丰度下空气样本中的细菌群落结构。 采用安德森六级采样器在四种不同类型的猪舍中采集空气样本，并在适宜条件下进行培养。提取安德森六级采样器各粒径阶段所收集的可培养细菌的全基因组DNA，并通过细菌16S rDNA测序进行检测。每种猪舍中的数字1至6代表安德森六级采样器测定的I至VI级粒子阶段。右侧文字列出每种细菌的属名。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

本研究提供了一些在雾霾天气及畜禽养殖场中获得的代表性结果。北京雾霾天气期间采集的生物气溶胶样品结果，有助于更好地理解无颗粒物（PM）存在时北京雾霾天气中PM的生物组成。来自畜禽养殖场样品的结果也将为猪舍环境空气质量控制提供基础数据，并为畜禽养殖场的健康养殖与安全生产提供理论依据和技术支持。许多环境因素，如温度、湿度和风速，可能影响牛舍内气溶胶颗粒的分布（图1）。以往研究表明，畜禽养殖场中的PM主要来源于饲料、粪便、毛发和羽毛，可能与动物活动有关。这些环境因素不仅影响动物活动，还会影响相对封闭牛舍内PM的聚集与扩散。因此，我们检测了四个不同月份PM的不同浓度和粒径分布。此外，四类猪舍在卫生状况、饲养方式和动物活动方面存在差异，这也可能影响空气中可培养细菌的群落结构（图4）。

然而，在本研究中，我们主要关注可用于研究不同环境条件下生物气溶胶组成与分布的现有方法。与其他微生物样本相比，空气传播微生物的浓度极低，且混有大量无机粉尘颗粒等杂质，这给此类微生物的采集与检测带来了一定困难21。因此，应针对微生物气溶胶选择合适的采集与检测方法。微生物气溶胶样本的采集通常采用沉降法或使用专用设备，将微生物收集至液体、半固体或固体采样介质中22,23,24。随后进行相应的技术处理及特定的检测与分析25。采样介质应保持微生物的完整性，以降低检测与分析过程中的误差26。然而，由于不同气溶胶微生物采样器的采样原理和介质不同，其对样本完整性的保持效果也存在差异。研究人员已设计出多种基于不同采样原理的生物气溶胶采样器，例如惯性撞击、过滤阻留和静电沉降等原理27。

撞击式采样器可通过抽气设备以高速将空气中的颗粒物（PM）推入采样介质中。撞击式采样器分为两种类型：固体撞击式和液体撞击式。固体撞击式采样器可用于低浓度生物气溶胶的采样，且几乎不受气流影响28。不同粒径的气溶胶颗粒可被初步筛分，并可将微生物直接采集到培养基中，从而提高可培养微生物的存活率10。由于惯性撞击作用，微生物气溶胶颗粒容易在同一位置发生碰撞，培养后菌落可能容易重叠。目前最常见的固体撞击式采样器是Andersen-6型微生物气溶胶采样器。本研究采用Andersen六级采样器，对不同粒径空气颗粒物（PM）中分布的可培养细菌进行分析。

旋风式气溶胶采样器利用旋风装置将空气高速螺旋进入圆柱或圆锥形容器。生物气溶胶颗粒可通过离心力从气流中分离，即微生物可撞击采样器内壁，随后被采样缓冲液收集。该方法操作便捷，适用于大流量和长时间采样操作。然而，由于该方法依赖液体运行，因此无法在低温条件下使用。本研究中使用的旋风式气溶胶采样器为旋风湿壁式气溶胶采样器，可将采样空气中的空气传播病原体和颗粒提取并转移至少量水中，用于后续分析29。

滤膜采样器可在低温条件下工作，并能采集特定粒径以上的颗粒物。然而，该方法对微生物活性影响较大，且容易造成微生物损伤，从而显著影响后续关于采样活性的研究。本研究采用大流量空气采样器结合滤膜法与旋风式气溶胶采样器，采集了北京雾霾天气下的生物气溶胶样本。本实验旨在分析颗粒物（PM）的生物组成，而无需对空气中的微生物进行分离与培养。因此，这两种采样方法适用于本研究。在旋风式气溶胶采样器方法中，低浓度的空气微生物可被直接收集至流动缓冲液中，无需经过滤膜样本通常所需的额外处理步骤，便于后续分析。本研究中，旋风式气溶胶采样器与滤膜采样器表现出不同的采样效率。滤膜样本通常需要进行额外处理，例如从滤膜上回收样本，这是两种方法之间的主要差异之一。此外，旋风式气溶胶采样器可将空气样本直接采集至流动缓冲液中，而另一种方法则将样本采集在滤膜上。不同采样方法的特性可能是导致采样效率差异的原因。我们可以推测，旋风式气溶胶采样器是收集微生物的更优选择，但该推测仍需进一步验证。

本研究采用细菌16S rDNA和真菌ITS区测序技术对生物气溶胶进行生物学分析。16S rDNA测序是指测定微生物基因组中的16S rDNA片段30。16S rDNA在原核生物中广泛存在，具有高度保守性和特异性，因此可用于微生物物种的鉴定31。全基因组测序仅需提取基因组DNA并进行后续测序。该方法不仅能产生大量数据，还可对微生物群落结构进行更全面的分析。此外，宏基因组学也可应用于该研究领域，未来可提供更多相关信息。Handelsman et al. 在1998年一篇关于土壤微生物的研究论文中首次提出了宏基因组（metagenome）的概念32。在后续研究中，宏基因组的概念逐渐被接受，并在人体肠道、海洋及土壤所含微生物的研究中得到广泛应用33,34,35。在高通量测序技术的支持下，宏基因组学发展迅速，在病原体检测研究中发挥着日益重要的作用。传统的微生物研究方法主要依赖培养法进行分离与纯化，但由于超过99%的微生物无法培养，许多研究难以开展。相比之下，宏基因组学无需分离单个生物体，即可整体获取环境中所有微生物的遗传信息36，从而可直接对所有获得的微生物进行综合性分析。

综上所述，本研究展示了多种可用于环境颗粒物（PM）生物成分研究的检测、采样与分析方法，包括PM监测；使用安德森六级采样器、带滤膜的高流量空气采样器或旋风式气溶胶采样器进行PM采样；以及基于DNA测序的后续生物学分析。在实际应用中，这些方法可在多种环境条件下使用，例如各类畜禽养殖场。我们的实验方案与研究结果可为全球其他研究人员进一步探索环境中真菌和细菌生物气溶胶对健康的影响提供参考。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：41775148）的资助。资助机构在研究设计、数据收集与分析、发表决定以及稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
空气动力激光粒子计数器TSI Inc, MN, USAmodel 9306
安德森六级采样器Tisch Inc, USATE-20-600
AxyPrep 多源 DNA 小量提取试剂盒Axygen, NY, USAAP-MN-MIS-GDNA-50G
FastPfu 聚合酶TransGen Inc., 北京, 中国AP221-01
大流量空气采样器北京华瑞和安科技有限公司, 中国HH02-LS120
实时荧光定量 PCR 系统Thermo Fisher Scientific, USAApplied Biosystems® 7500
大豆酪蛋白消化琼脂Becton, Dickinson and company, MD, USA211043
Tissuquartz 滤膜Pall, NY, USA7204
湿壁式空气采样器Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE
Monroe, Washington 98272-1034 USA		SASS 2300

参考文献

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