通过钙网蛋白、S100蛋白和蛋白基因产物9.5的免疫组织化学染色诊断先天性巨结肠病直肠抽吸活检标本

摘要

本方案描述了对直肠抽吸活检组织进行钙视网膜蛋白、S100蛋白和蛋白基因产物9.5免疫染色的过程。这种用于先天性巨结肠病的新型辅助诊断方法具有较高的敏感性和特异性。

摘要

先天性巨结肠（Hirschsprung's disease, HD）是一种先天性肠道疾病，临床表现为婴儿无法排出胎便或儿童长期便秘。目前诊断HD最准确的方法是直肠抽吸活检（rectal suction biopsy, RSB），通过检测神经节细胞的缺失和神经增生情况来确诊。传统的苏木精-伊红染色缺乏足够的敏感性和特异性；乙酰胆碱酯酶染色由于操作过程复杂，难以广泛应用。我们建立了一种新的免疫组织化学染色方案，针对钙视网膜蛋白（calretinin）、S100蛋白以及蛋白基因产物9.5（protein gene product 9.5, PGP9.5）在RSB样本中进行检测，其敏感性和特异性分别高达96.49%（95%置信区间为0.88–0.99）和100%（95%置信区间为0.97–1.00）。HD病变肠段通常表现为黏膜下组织中作为神经增生标志物的calretinin、S100蛋白和PGP9.5表达缺失。本方案详细描述了这一新型诊断方法的具体操作流程。

引言

先天性巨结肠症（Hirschsprung's disease, HD）是一种常见的先天性肠道疾病，其特征是远端肠段不同部位缺乏神经节细胞¹。人体肠神经系统是在胚胎期神经细胞侵入并完成定植后形成的。如果该过程受到干扰，导致神经嵴细胞侵入未能完成，则新生儿的远端肠道将呈现无神经节状态²。这种可能危及生命的状况被称为先天性巨结肠症。成功的肠道定植主要包括细胞增殖、迁移能力以及肠道生长这三个关键环节。

传统的苏木精和伊红（H&E）染色在有限的黏膜下层活检组织上无法获得与手术获取的全层组织H&E染色同样满意的结果。此外，由于乙酰胆碱酯酶（AChE）染色在直肠吸引活检组织中的敏感性不足（为91%），且冷冻切片处理过程复杂，其应用在理论上存在挑战^3,4。目前，多种可用于福尔马林固定、石蜡包埋标本的神经节细胞和神经纤维免疫组织化学标志物正逐渐成为先天性巨结肠（HD）诊断的主流方法。钙视网膜蛋白（calretinin）是一种维生素D依赖性钙结合蛋白，在HD受累肠段的肌间神经丛和黏膜下神经丛中不表达⁵。S100蛋白表达于源自神经嵴的细胞，如神经纤维和胶质细胞，在HD受累肠段的黏膜下组织中常表现为神经组织肥大

方案

本方案已获得华中科技大学同济医学院附属协和医院研究伦理委员会批准。

1. 直肠吸引活检

1. 在取得监护人知情同意后，由经验丰富的儿科外科医生及其助手使用Rbi2负压吸引直肠活检系统进行直肠抽吸活检。
   1. 对具有以下指征的患者进行RSB：新生儿无法排出胎粪，或儿童长期腹胀伴或不伴便秘；长期便秘需依赖液体石蜡才能完成排便的儿童；因不明原因肠梗阻或肠穿孔而接受肠造口术的儿童。
      注意：RSB的禁忌证如下：症状严重、全身状况差或无法耐受RSB的儿童；处于肠炎急性期的儿童；肠道吻合术后尚未完全愈合的儿童。
2. 术前36小时进行生理盐水保留灌肠作为肠道准备，以避免稀便及黏膜过度水肿。若患儿便秘严重，可加入硫酸镁溶液。对新生儿给予维生素K（1 mg/kg）。
   注意：无需进行术前血液检查或使用抗生素，因二者均非必需。
3. 将患者置于截石位。在导管表面涂抹液体石蜡。将钝头导管插入直肠4–7 cm，使侧孔朝向后壁或侧壁。
4. 轻柔按压导管，使侧孔充分贴附于直肠壁。扣动扳机后立即撤出器械。
5. 使用活检器械在齿状线上方3 cm和6 cm处的前壁及后壁各获取4个直径为2 mm的负压吸引活检组织。用针将标本置于生理盐水浸湿的纱布上。
6. 观察患者至术后2小时，以排除直肠出血。RSB后24小时内避免进一步的直肠和肛门操作。

结果

本研究共纳入318例患者。所有患者均接受了直肠黏膜下层活检（RSB），并对组织标本进行了钙视网膜蛋白（calretinin）、S100和PGP9.5染色。根据本研究提出的新方案，97例诊断为先天性巨结肠（HD），213例为非HD，8例为疑似HD。在132例接受手术治疗的患者中，术后通过全层组织标本免疫组化染色确诊99例为HD。S100和PGP9.5染色结果显示，这99例患者中分别有92%和93%存在神经干增粗。其余186例患者中的83例接受了全层活检，结果显示存在神经节细胞。共有103例患者经保守治疗后临床治愈，并排除了HD诊断。在8例疑似HD患者中，3例被归类为短段型HD，其余5例归类为非HD。

根据我们的结果，最初通过 RSB 诊断出 97 例患者。详细信息见表 1。我们在 RSB 上进行的钙视网膜蛋白、S100 和 PGP9.5 免疫组织化学染色方案具有较高的敏感性和特异性，分别为 96.49%（95% 置信区间.......

讨论

本文描述了一种使用三种不同免疫组织化学抗体对RBS切片进行染色以诊断亨廷顿病（HD）的实验步骤。本诊断方案的敏感性为96.49%（95%置信区间：0.88–0.99），特异性为100%（95%置信区间：0.97–1.00）。

该方案中最关键的步骤是 RSB 和抗原-抗体反应。活检组织的大小决定了染色的准确性。过小的活检样本无法提供足够的组织以做出精确诊断，而过大的活检则会增加出血风险。根据经验，直径为 2 mm 的活检样本为最佳尺寸。对于抗原-抗体反应，必须重视抗体的适当保存。操作时需严格按照步骤进行，并轻柔操作。建议在所有步骤中使用反渗透纯化水，以获得更清晰的观察视野，便于病理医生做出准确诊断。

对比灌肠、肛门直肠测压以及组织学活检是近年来使用的三种术前诊断方法。根据Takawira 等's 研究表明，组织学检查的活检具有最高的敏感性和特异性⁸. 迈尔-鲁格 等 1972年首次报道了在冷冻的直肠抽吸组织上进行乙酰胆碱酯酶（AChE）染色以辅助.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钙视网膜蛋白抗体	MXB Biotechnologies	MAB-0716 170416405c	抗体：一抗
S-100抗体	MXB Biotechnologies	Kit-0007	抗体：一抗
PGP9.5抗体	上海龙岛抗体有限公司	R-0457-03	抗体：一抗
增强试剂	MXB Biotechnologies	KIT-9902-A 170416405a	抗体：二抗A
山羊抗兔/小鼠IgG二抗	MXB Biotechnologies	KIT-9902-B	抗体：二抗B
DAB染色试剂盒（含试剂A、B和C）	MXB Biotechnologies	DAB-0031	染色试剂盒
恒温培养箱	上海一恒仪器有限公司	DHP-9082	仪器
Rbi2负压直肠活检系统	Aus Systems Pty Ltd, 南澳大利亚, 澳大利亚	CP1200 HP1000 SS1000	仪器
切片机	Leica	leica RM2016	仪器
柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(100X)	MXB Biotechnologies	MVS-0101	抗原修复缓冲液
病理组织脱水机	武汉俊杰电子有限公司	JT-12F	仪器