通过钙网蛋白、S100蛋白和蛋白基因产物9.5的免疫组织化学染色诊断先天性巨结肠病直肠抽吸活检标本

摘要

本方案描述了对直肠抽吸活检组织进行钙视网膜蛋白、S100蛋白和蛋白基因产物9.5免疫染色的过程。这种用于先天性巨结肠病的新型辅助诊断方法具有较高的敏感性和特异性。

摘要

先天性巨结肠（Hirschsprung's disease, HD）是一种先天性肠道疾病，临床表现为婴儿无法排出胎便或儿童长期便秘。目前诊断HD最准确的方法是直肠抽吸活检（rectal suction biopsy, RSB），通过检测神经节细胞的缺失和神经增生情况来确诊。传统的苏木精-伊红染色缺乏足够的敏感性和特异性；乙酰胆碱酯酶染色由于操作过程复杂，难以广泛应用。我们建立了一种新的免疫组织化学染色方案，针对钙视网膜蛋白（calretinin）、S100蛋白以及蛋白基因产物9.5（protein gene product 9.5, PGP9.5）在RSB样本中进行检测，其敏感性和特异性分别高达96.49%（95%置信区间为0.88–0.99）和100%（95%置信区间为0.97–1.00）。HD病变肠段通常表现为黏膜下组织中作为神经增生标志物的calretinin、S100蛋白和PGP9.5表达缺失。本方案详细描述了这一新型诊断方法的具体操作流程。

引言

先天性巨结肠症（Hirschsprung's disease, HD）是一种常见的先天性肠道疾病，其特征是远端肠段不同部位缺乏神经节细胞¹。人体肠神经系统是在胚胎期神经细胞侵入并完成定植后形成的。如果该过程受到干扰，导致神经嵴细胞侵入未能完成，则新生儿的远端肠道将呈现无神经节状态²。这种可能危及生命的状况被称为先天性巨结肠症。成功的肠道定植主要包括细胞增殖、迁移能力以及肠道生长这三个关键环节。

传统的苏木精和伊红（H&E）染色在有限的黏膜下层活检组织上无法获得与手术获取的全层组织H&E染色同样满意的结果。此外，由于乙酰胆碱酯酶（AChE）染色在直肠吸引活检组织中的敏感性不足（为91%），且冷冻切片处理过程复杂，其应用在理论上存在挑战^3,4。目前，多种可用于福尔马林固定、石蜡包埋标本的神经节细胞和神经纤维免疫组织化学标志物正逐渐成为先天性巨结肠（HD）诊断的主流方法。钙视网膜蛋白（calretinin）是一种维生素D依赖性钙结合蛋白，在HD受累肠段的肌间神经丛和黏膜下神经丛中不表达⁵。S100蛋白表达于源自神经嵴的细胞，如神经纤维和胶质细胞，在HD受累肠段的黏膜下组织中常表现为神经组织肥大⁶。蛋白基因产物9.5（PGP9.5）可稳定地标记神经纤维和神经节细胞；PGP9.5染色可作为calretinin染色的补充，尤其适用于孤立性低神经节病的诊断。联合使用S100与PGP9.5进行双重染色可降低假阴性率并提高检测敏感性。本研究的前提是确保该新型诊断方法具备足够的特异性和高敏感性。我们提出的新方案联合使用上述三种标志物，以区分无神经节细胞肠段与神经纤维肥厚。本实验室此前已开展一项纳入318例儿童的前瞻性研究，并发表了相关结果，但未提供详细操作流程⁷。本文将详细阐述该染色方案的具体步骤及注意事项。所有自出生起即出现严重排便障碍的新生儿，或排除其他常见疾病后仍存在慢性便秘的儿童，均为直肠吸引活检（RSB）的潜在适用对象。我们提出的新方案不仅适用于RSB标本染色，也适用于全层活检或手术切除标本，以实现最终诊断。

方案

本方案已获得华中科技大学同济医学院附属协和医院研究伦理委员会批准。

1. 直肠吸引活检

1. 在取得监护人知情同意后，由经验丰富的儿科外科医生及其助手使用Rbi2负压吸引直肠活检系统进行直肠抽吸活检。
   1. 对具有以下指征的患者进行RSB：新生儿无法排出胎粪，或儿童长期腹胀伴或不伴便秘；长期便秘需依赖液体石蜡才能完成排便的儿童；因不明原因肠梗阻或肠穿孔而接受肠造口术的儿童。
      注意：RSB的禁忌证如下：症状严重、全身状况差或无法耐受RSB的儿童；处于肠炎急性期的儿童；肠道吻合术后尚未完全愈合的儿童。
2. 术前36小时进行生理盐水保留灌肠作为肠道准备，以避免稀便及黏膜过度水肿。若患儿便秘严重，可加入硫酸镁溶液。对新生儿给予维生素K（1 mg/kg）。
   注意：无需进行术前血液检查或使用抗生素，因二者均非必需。
3. 将患者置于截石位。在导管表面涂抹液体石蜡。将钝头导管插入直肠4–7 cm，使侧孔朝向后壁或侧壁。
4. 轻柔按压导管，使侧孔充分贴附于直肠壁。扣动扳机后立即撤出器械。
5. 使用活检器械在齿状线上方3 cm和6 cm处的前壁及后壁各获取4个直径为2 mm的负压吸引活检组织。用针将标本置于生理盐水浸湿的纱布上。
6. 观察患者至术后2小时，以排除直肠出血。RSB后24小时内避免进一步的直肠和肛门操作。

2. RSB切片的制备

1. 将直肠吸引活检组织置于4%多聚甲醛中固定6小时，固定液体积应为组织体积的5倍。
2. 使用病理组织脱水机对组织进行11小时脱水。整个程序化过程包括以下5个步骤：
   1. 将组织置于甲醛中固定1小时。
   2. 将组织置于75%乙醇中4小时。
   3. 将组织置于无水乙醇中（更换两次，每次1小时）。
   4. 将组织置于无水乙醇中（更换两次，每次30分钟）。
   5. 将组织置于二甲苯中（更换三次，每次1小时）。
3. 将组织置于石蜡（58–60 °C）中（更换三次，每次1小时）。将直肠吸引活检组织包埋于石蜡块中。
4. 使用切片机修整石蜡块，直至组织完全暴露并形成完整的切面。
5. 用切片机将石蜡块切成0.4 μm的切片。
6. 将切片依次放入45–50 °C的水中数秒钟，使切片展开成平整状态。 
7. 将石蜡切片转移至载玻片上。
8. 将载玻片置于60 °C烘箱中烘烤3–5小时。避免烘烤时间过长，以免导致抗原丢失。
9. 将脱蜡后的载玻片放入二甲苯中（更换两次，每次15分钟）。
10. 将载玻片依次在无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇和75%乙醇中各水化5分钟，然后用反渗透（RO）纯化水冲洗5分钟。

3. 抗原修复

1. 通过将4 mL EDTA抗原修复缓冲液与200 mL反渗透纯化水混合，配制用于钙视网膜蛋白（calretinin）修复的工作液。通过将1 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（100倍浓缩液）与99 mL反渗透纯化水混合，配制用于S100和PGP9.5修复的工作液。
   注意：钙视网膜蛋白优先使用EDTA修复液进行修复。然而，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液更适用于S100和PGP9.5的抗原修复。
2. 将切片放入考兰染色缸中，加入修复液后置于预热的沸水浴中。煮沸20分钟后，将染色缸从水浴中取出，静置冷却至室温，冷却过程约需10分钟。取出切片后，用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗一次。
3. 用记号笔在组织周围画出圈线，并为后续操作准备湿盒。

4. 封闭

1. 通过将 3 mL 的 30% H₂O₂ 与 27 mL 反渗透纯化水混合，配制工作液。
2. 将两到三滴 3% H₂O₂ 溶液逐滴加入组织上，以阻断过氧化物酶活性。应迅速加入 H₂O₂ 溶液，确保液体不会溢出画圈区域。在 37 °C 培养箱中孵育 20 分钟，完成过氧化物酶的封闭。
3. 用 PBS 轻柔冲洗载玻片（每次 5 分钟，共洗三次）。
4. 用 5% 牛血清白蛋白（BSA）在 37 °C 下封闭载玻片 20 分钟（通过将 1.5 g BSA 粉末溶于 30 mL 反渗透纯化水中配制）。
   注意：使用 3% H₂O₂ 封闭可消除 95% 的非特异性染色，而使用 5% BSA 封闭可消除其余 5% 的非特异性染色。结合使用这两种方法可获得可靠的结果。

5. 抗原-抗体反应

1. 去除5% BSA，向切片中加入50 μL一抗（calretinin、S100或PGP9.5），于4 °C孵育过夜。
2. 用PBS洗涤切片（每次3分钟，共洗三次）。
3. 向切片中加入50 μL聚合物增强剂（试剂A；参见材料表），在37 °C孵育箱中孵育20分钟。随后用PBS洗涤切片（每次3分钟，共洗三次）。
4. 向切片中加入50 μL二抗B（山羊抗兔/小鼠IgG二抗），在37 °C孵育箱中孵育30分钟。用PBS洗涤切片（每次5分钟，共洗三次）。

6. 3,3-二氨基联苯胺和苏木精染色

1. 向一个1.5 mL离心管中加入850 μL反渗透纯化水，并按A、B、C的顺序加入染色试剂（见材料表）。每种试剂各加50 μL，得到总量为1 mL的3,3-二氨基联苯胺（DAB）工作液。如有沉淀，请过滤后使用。
2. 向组织切片滴加一滴DAB工作液，染色3–10分钟。将切片在室温下孵育于DAB溶液中，直至出现棕褐色染色。使用明场显微镜密切观察。DAB工作液需避光保存。随后用PBS冲洗切片5分钟。
3. 滴加一滴苏木精对细胞核进行复染，约1分钟。然后手持柯林罐，在细流水中冲洗约30–40秒，直至去除多余染料。操作时注意避免损伤组织切片。
4. 将RSB切片浸入盛有PBS的柯林罐中，持续25–30秒。随后在1%盐酸-乙醇中分化10秒。再用PBS冲洗切片1分钟。
5. 按与水化相反的顺序进行脱水：75%、80%、95%及无水乙醇（每种浓度各5分钟）。
6. 将切片置于二甲苯中透明处理（更换两次，每次5分钟）。
7. 使用超净封片剂封片。封片后让切片干燥，再使用显微镜观察。

结果

本研究共纳入318例患者。所有患者均接受了直肠黏膜下层活检（RSB），并对组织标本进行了钙视网膜蛋白（calretinin）、S100和PGP9.5染色。根据本研究提出的新方案，97例诊断为先天性巨结肠（HD），213例为非HD，8例为疑似HD。在132例接受手术治疗的患者中，术后通过全层组织标本免疫组化染色确诊99例为HD。S100和PGP9.5染色结果显示，这99例患者中分别有92%和93%存在神经干增粗。其余186例患者中的83例接受了全层活检，结果显示存在神经节细胞。共有103例患者经保守治疗后临床治愈，并排除了HD诊断。在8例疑似HD患者中，3例被归类为短段型HD，其余5例归类为非HD。

根据我们的结果，最初通过 RSB 诊断出 97 例患者。详细信息见表 1。我们在 RSB 上进行的钙视网膜蛋白、S100 和 PGP9.5 免疫组织化学染色方案具有较高的敏感性和特异性，分别为 96.49%（95% 置信区间...

讨论

本文描述了一种使用三种不同免疫组织化学抗体对RBS切片进行染色以诊断亨廷顿病（HD）的实验步骤。本诊断方案的敏感性为96.49%（95%置信区间：0.88–0.99），特异性为100%（95%置信区间：0.97–1.00）。

该方案中最关键的步骤是 RSB 和抗原-抗体反应。活检组织的大小决定了染色的准确性。过小的活检样本无法提供足够的组织以做出精确诊断，而过大的活检则会增加出血风险。根据经验，直径为 2 mm 的活检样本为最佳尺寸。对于抗原-抗体反应，必须重视抗体的适当保存。操作时需严格按照步骤进行，并轻柔操作。建议在所有步骤中使用反渗透纯化水，以获得更清晰的观察视野，便于病理医生做出准确诊断。

对比灌肠、肛门直肠测压以及组织学活检是近年来使用的三种术前诊断方法。根据Takawira 等's 研究表明，组织学检查的活检具有最高的敏感性和特异性⁸. 迈尔-鲁格 等 1972年首次报道了在冷冻的直肠抽吸组织上进行乙酰胆碱酯酶（AChE）染色以辅助...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钙视网膜蛋白抗体	MXB Biotechnologies	MAB-0716 170416405c	抗体：一抗
S-100抗体	MXB Biotechnologies	Kit-0007	抗体：一抗
PGP9.5抗体	上海龙岛抗体有限公司	R-0457-03	抗体：一抗
增强试剂	MXB Biotechnologies	KIT-9902-A 170416405a	抗体：二抗A
山羊抗兔/小鼠IgG二抗	MXB Biotechnologies	KIT-9902-B	抗体：二抗B
DAB染色试剂盒（含试剂A、B和C）	MXB Biotechnologies	DAB-0031	染色试剂盒
恒温培养箱	上海一恒仪器有限公司	DHP-9082	仪器
Rbi2负压直肠活检系统	Aus Systems Pty Ltd, 南澳大利亚, 澳大利亚	CP1200 HP1000 SS1000	仪器
切片机	Leica	leica RM2016	仪器
柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(100X)	MXB Biotechnologies	MVS-0101	抗原修复缓冲液
病理组织脱水机	武汉俊杰电子有限公司	JT-12F	仪器