原子力显微镜成像在核细胞结构和动力学研究中的应用

Summary

在这里, 我们提出了一个协议, 以表征核糖体粒子在单分子水平上使用静态和延时原子力显微镜 (afm) 成像技术。所描述的表面功能化方法允许在纳米尺度上以高分辨率捕获核糖体的结构和动力学。

Abstract

染色质是一个长链核糖体亚基, 是一个动态系统, 允许 dna 复制和转录等关键过程发生在真核细胞中。核糖体的动力学提供了通过复制和转录机制获得 dna 的机会, 并对染色质功能背后的分子机制做出了重要贡献。单分子研究, 如原子力显微镜 (afm) 成像, 极大地促进了我们目前对核糖体结构和动力学作用的理解。目前的协议描述了使高分辨率 afm 成像技术能够研究核糖体的结构和动态特性的步骤。该协议由获得的 fom 数据说明了集中核细胞的 h3 组蛋白被对应的丝粒蛋白 a (cenp-a) 所取代。该协议从使用连续稀释方法组装单核苷酸体开始。用氨基丙基硅膜 (aps-mica) 功能化制备云母基板, 用于核糖体成像, 对于所描述的核糖体的原子力显微镜可视化至关重要, 并提供了制备底物的程序。沉积在 aps-mica 表面的核细胞首先使用静态 afm 进行成像, 该原子力法捕获核糖体群的快照。通过对这些图像的分析, 可以测量包裹在核糖体上的 dna 大小等参数, 这一过程也是详细的。描述了液体中的延时 afm 成像过程, 描述了高速延时 afm, 它可以捕获每秒多个核糖体动力学帧。最后, 描述和说明了核糖体动力学的分析, 使动态过程的定量表征。

Introduction

在真核细胞中, dna 高度凝聚并组织成染色体。¹染色体中 dna 组织的第一级是核糖体的组合, 其中 147 bp 的 dna 紧紧地包裹在一个组蛋白八分体核上。^2,3核糖体颗粒聚集在一个长的 dna 分子上, 形成一个染色质阵列, 然后组织起来, 直到形成一个高度紧凑的染色体单元。⁴染色质的分解提供了基因转录和基因组复制等关键细胞过程所需的免费 dna, 这表明染色质是一个高度动态的系统。^5,6,7了解 dna 在不同染色质水平上的动态特性对于阐明分子水平上的遗传过程至关重要, 因为在分子水平上, 错误可能导致细胞死亡或癌症等疾病的发展。⁸非常重要的染色质性质是核糖体的动力学。^9,10,11,12这些粒子的高稳定性使其能够通过晶体学....

Protocol

1. 单核细胞的连续稀释组装

1. 生成和纯化包含一个离中心的 wiom 601 核糖体定位序列的大约 400 bp dna 基板。⁵⁵
   注: 为了限制二核苷酸的不需要的形成, 定位序列两侧的每个 "手臂" 不应超过 ~ 150 bp。
   1. 使用质粒 pgeem3z-601 与设计的引物一起, 利用 pcr 扩增底粒 dna。对于这里使用的具有122和 154 bp 臂长度的 423 bp 基板, 使用正向 (-catgattatagtatacc-3 ' ') 和反向 (5 '-acagcatgattactacattactacc-3 ') 引物。
   2. 将含有反应混合物的管加入预热至95°c 的热循环器中。在95°c 时初始变性5分钟后运行以下33次循环: 95°c 时30秒的变性, 49°c 时的退火 30秒, 72°c 时延长35秒。在33次循环后, 将最后延展设置为 72°c, 时间为10分钟。
   3. 使用市售的 pcr 纯化试剂盒纯化 pcr 混合物中的 dna。从 pcr 清理柱中洗脱 dna 时, 使用 10 mm tris 缓冲液 (ph 7.5) 代替试剂盒提供的洗脱缓冲液。
      注: 请格外注意, 不要在纯化步骤之间转移缓冲液。在测量 dna 浓度时, 受污染的洗脱液会导致下游出现问题, 或者可能会改变核糖体组合混合物的起始盐浓度。
2. 通过测量纯化 dna ....

Results

首次为原子力显微镜成像实验使用连续稀释组装方法制备了单核细胞 (图 1)。然后使用不连续的 sds-page 检查制备的核糖体 (图 2)。云母表面是使用 aps 进行功能化的, 它在表面捕获核糖体, 同时保持光滑的背景, 以实现高分辨率成像 (图 3)。核细胞沉积在 aps-mica 上, 并随后使用静态 afm 成像进行了成像。作为对组装和沉积的控制, 利用静态 afm 制备并成像了 h3 单核酶体。h3 单核核糖体的图像 (图 4a) 提供了在沉积前存在的核糖体群的快照, 证实核糖体已成功组装。2 nm 核糖体沉积在表面提供了核成和 dna 颗粒的均匀分布, 很少或没有拥挤。

随着 h3 控制组合的成功, 接下来将所提出的方法应用于 cenp-a 核糖体的研究。此样品的静态 afm 成像 (图 4b.......

Discussion

上述协议相当简单, 并提供了高度可重现的结果, 尽管可以强调几个重要问题。功能化的 aps-mica 是获得可靠和可重复的结果的关键基板。aps-mica 的高稳定性是该基板的重要特性之一, 它允许用户提前准备成像基板以供使用, 可在制备后至少两周内使用。^59,61然而, 如果将其用于安装在金属皮球上的云母, 表面可能会被胶的蒸汽损坏。因此, 建议按照协议中的说明 (第2节) 对云母安装使用双棒胶带。在需要使用胶水的情况下, 例如, 一些用户使用胶水将云母安装在金属盘上进行液体成像, 建议使用以下程序, 从6.1.3 部分中描述的程序中修改, 用于 hs-afm 成像的样品制备.云母粘在金属盘或其他固体材料上, 并在胶水凝固后切割。用氩吹至云母, 以去除胶水中潜在的蒸气。然后, 云母可以用苏格兰胶带和 aps 云母的工作溶液进行切割, 以覆盖新鲜的切割云母条。溶液的用量取决于云母条的大小。让 aps 反应30分钟。为了最大限度地减少蒸发, 在湿培养皿中运行反应。使用以下步骤: 浸泡实验室擦拭纸, 放置在培养皿的底部。将5.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
质粒 pGEM3Z-601	Addgene，马萨诸塞州剑桥市	26656
PCR 引物	IDT，克拉尔维尔，爱荷华州	定制订单	（FP） 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' （RP） 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq
聚合酶	ThermoFischer Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州	EP0701	200 单位
PCR 纯化试剂盒	Qiagen，希尔登，德国	28104	50 单位
Tris 碱	基 Sigma-Aldrich 的货号，密苏里州圣路易斯	10708976001	250 g
EDTA	的货号 ThermoFischer Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆	15576028	500 g
（CENP-A/H4）2，重组人	EpiCypher，北卡罗来纳州达勒姆	16-0010	50 ug
H2A/H2B，重组人	EpiCypher，达勒姆，NC	15-0311	50 ug
H3 Octamer 的目录号，重组人	EpiCypher，北卡罗来纳州达勒姆	16-0001	50 ug
Slide-A-Lyzer MINI 透析装置试剂盒，10K MWCO，0.1 mL	ThermoFischer Scientific，Waltham，MA	69574	10 种装置的目录号
氯化钠	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易	S9888-500G	500 mg
的目录号Amicon Ultra-0.5 mL 离心过滤器	Millipore-sigma，密苏里州伯灵顿	UFC501008	8 个设备的目录号
HCl	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易	258148-25ML	25 mL
Tricine	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易	T0377-25G	25 g
SDS	的目录号 Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯	11667289001	1 kg
过硫酸铵 （AmmPS） 的目录号	Bio-Rad，Hercules，CA	1610700	10 g
30% 丙烯酰胺/双溶液，37.5：1	Bio-Rad，Hercules，CA	1610158	500 mL
TEMED	Bio-Rad，Hercules，CA	1610800	mL
4x Laemmli 蛋白样品缓冲液	Bio-Rad，Hercules，CA	1610747	10 mL
2-ME	的目录号Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯	M6250-10ML	10 mL
ageRuler 预染蛋白分子量标准品的货号	ThermoFischer Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州	26616	500 μL
Bio-Safe&trade 的目录号;考马斯染色	Bio-Rad，Hercules，CA	1610786	1 L
无纺布洁净室湿巾的目录号：TX604 TechniCloth	TexWipe， Kernersvile， NC	TX604
白云母块	阿什维尔Mica， Newport News， VA	1 级
氨丙基硅烷 （APS）	按照 22
HEPES	Sigma-Aldrich， St. Louis， MO	H4034-25G	25 g
苏格兰胶带	Scotch-3M 的目录号，明尼苏达州
圣保罗TESPA-V2 原子力显微镜探针（用于静态成像）	布鲁克原子力显微镜探针，加利福尼亚州
MSNL-10 原子力显微镜探针（用于标准延时成像）	布鲁克原子力显微镜探针，加利福尼亚州
Aron Alpha Industrial Krazy Glue	Toagosei America，俄亥俄州西杰斐	AA480	2 g 管
MgCl2 MgCl2	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易	M8266-100G	100 g 的目录号
Millex-GP 过滤器， 0.22 &微;m	Sigma-Aldrich， St. Louis， MO	SLGP05010	10 个设备的目录号
BL-AC10DS-A2 AFM 探针（用于 HS-AFM）	奥林巴斯，日本
化合物 FG-3020C-20	FluoroTechnology Co.， Ltd.， Kagiya， Kasugai， 爱知县， 日本
化合物 FS-1010S135-0.5	FluoroTechnology Co.， Ltd.， Kagiya， Kasugai， 爱知县， 日本
多模式原子力显微镜	Bruker-Nano/Veeco，加利福尼亚州
高速延时原子力显微成像	Toshio Ando，金泽大学纳米生命科学研究所，日本