利用原子力显微镜成像研究核小体的结构与动力学

摘要

本文介绍了一种利用静态和时间序列原子力显微镜（AFM）成像技术在单分子水平上表征核小体颗粒的实验方案。所述的表面功能化方法可实现对核小体结构及其动态行为在纳米尺度下的高分辨率捕捉。

摘要

染色质是由核小体亚基组成的长链结构，是一种动态系统，使得真核细胞中DNA复制和转录等关键过程得以进行。核小体的动态特性为复制和转录机器提供了接触DNA的途径，并在染色质功能的分子机制中发挥关键作用。单分子研究技术（如原子力显微镜（AFM）成像）极大地促进了我们对核小体结构与动态功能的理解。本实验方案描述了利用高分辨率AFM成像技术研究核小体结构与动态特性的具体步骤。该方案以着丝粒核小体的AFM数据为例进行说明，其中组蛋白H3被其同源蛋白着丝粒蛋白A（CENP-A）所取代。方案首先采用连续稀释法组装单核小体。用于核小体成像的云母基底需经氨基丙基硅杂环（APS-云母）功能化处理，该基底的制备对AFM可视化核小体至关重要，文中也提供了详细的基底制备流程。沉积在APS-云母表面的核小体首先通过静态AFM成像，以获取核小体群体的静态图像。通过分析这些图像，可测量核小体周围DNA缠绕长度等参数，该分析过程亦有详细说明。文中还描述了在液体环境中进行时间序列AFM成像的步骤，该高通量时间序列AFM技术每秒可捕获多个核小体动态过程的图像帧。最后，介绍了对核小体动态行为的分析方法，可用于对动态过程进行定量表征，并附有实例说明。

引言

在真核细胞中，DNA 高度压缩并组织成染色体。¹ 染色体内的第一级 DNA 组织形式是核小体的组装，其中 147 bp 的 DNA 紧密缠绕在组蛋白八聚体核心周围。^2,3 核小体颗粒在长链 DNA 分子上组装形成染色质阵列，随后进一步折叠，最终形成高度压缩的染色体结构。⁴ 染色质的解聚使得关键的细胞过程（如基因转录和基因组复制）能够接触到游离的 DNA，这表明染色质是一个高度动态的系统。^5,6,7 理解 DNA 在不同染色质层次上的动态特性，对于阐明分子水平上的遗传过程至关重要，因为这些过程中的错误可能导致细胞死亡或癌症等疾病的发生。⁸ 染色质的一个重要特性是核小体的动力学行为。^9,10,11,12 这些颗粒的高度稳定性使其能够通过晶体....

方案

1. Continuous Dilution Assembly of Mono-nucleosomes

1. Generate and purify an approximately 400 bp DNA substrate that contains an off-centered Widom 601 nucleosome positioning sequence.⁵⁵
   NOTE: To limit the unwanted formation of di-nucleosomes, each ‘arm’ flanking the positioning sequence should not exceed ~150 bp.
   1. Use plasmid pGEM3Z-601 along with the designed primers and amplify the substrate DNA using PCR. For the 423 bp substrate with 122 and 154 bp arm lengths used here, use forward (5’-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3’) and reverse (5’-ACAGCTATGACCATGATTAC-3’) primers.
   2. Add ....

结果

首先采用连续稀释组装法（图1）制备单核小体，用于原子力显微镜（AFM）成像实验。制备好的核小体随后通过非连续SDS-PAGE进行检测（图2）。接下来，使用APS对云母表面进行功能化处理，该处理可在捕获核小体的同时维持表面光滑，从而实现高分辨率成像（图3）。将核小体沉积在APS修饰的云母表面后，采用静态AFM成像技术进行成像。作为组装与沉积过程的对照，制备了H3单核小体并进行静态AFM成像。H3单核小体的图像（图4A）展示了沉积前瞬间的核小体群体状态，证实核小体已成功组装。2 nM的核小体沉积浓度在表面形成了均匀分布的核小体和DNA颗粒，几乎未观察到聚集或拥挤现象。

在H3对照组装成功的基础上，接下来将所述方法应用于CENP-A核小体的研究。该样品的静态原子力显微镜成像（图4B）显示组装成.......

讨论

上述方案相当直接，并能提供高度可重复的结果，尽管有几个重要问题需要强调。功能化的APS云母是获得可靠且可重复结果的关键基底。APS云母具有高稳定性，这是该基底的一个重要特性，允许提前制备成像基底，并可在制备后至少两周内使用。^59,61 然而，若使用胶水将云母固定在金属载片上，胶水蒸气可能会损坏表面。因此，建议按照本方案（第2节）所述，使用双面胶带固定云母。在必须使用胶水的情况下（例如，某些用户在液体成像时将云母粘附于金属圆片上），推荐采用以下改进步骤，该步骤源自第6.1.3节中针对HS-AFM成像样品制备的描述：先将云母粘接到金属圆片或其他固体材料上，在胶水固化后进行解理。用氩气吹扫云母表面，以去除可能残留的胶水蒸气。随后可用透明胶带对云母进行解理，并将APS工作液滴加至新鲜解理的云母条表面，溶液用量取决于云母条的尺寸。让APS反应30分钟。为尽量减少蒸发，应在湿润的培养皿中进行反应。具体操作如下：将实验室擦拭纸浸湿后置于培养皿底部，再将一个5 mm厚的塑料圆片放在湿纸上，然后将带有粘附云母的金属圆片放置于塑料圆片上，避.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
质粒 pGEM3Z-601	Addgene，马萨诸塞州剑桥	26656
PCR 引物	IDT，爱荷华州科拉尔维尔	定制订购	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq 聚合酶	赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆	EP0701	200 单位的目录编号
PCR 纯化试剂盒	Qiagen，德国希尔登	28104	50 单位的目录编号
Tris 碱	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯	10708976001	250 g 的目录编号
EDTA	赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆	15576028	500 g 的目录编号
(CENP-A/H4)2，重组人源	EpiCypher，北卡罗来纳州达勒姆	16-0010	50 µg 的目录编号
H2A/H2B，重组人源	EpiCypher，北卡罗来纳州达勒姆	15-0311	50 µg 的目录编号
H3 八聚体，重组人源	EpiCypher，北卡罗来纳州达勒姆	16-0001	50 µg 的目录编号
Slide-A-Lyzer MINI 透析装置套件，10K MWCO，0.1 mL	赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆	69574	10 个装置的目录编号
氯化钠	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯	S9888-500G	500 mg 的目录编号
Amicon Ultra-0.5 mL 离心滤膜	Millipore-sigma，密苏里州伯灵顿	UFC501008	8 个装置的目录编号
HCl	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯	258148-25ML	25 mL 的目录编号
Tricine	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯	T0377-25G	25 g 的目录编号
SDS	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯	11667289001	1 kg 的目录编号
过硫酸铵 (AmmPS)	伯乐公司，加利福尼亚州赫拉克勒斯	1610700	10 g 的目录编号
30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，37.5:1	伯乐公司，加利福尼亚州赫拉克勒斯	1610158	500 mL 的目录编号
TEMED	伯乐公司，加利福尼亚州赫拉克勒斯	1610800	5 mL 的目录编号
SDS-PAGE 用 4x Laemmli 蛋白上样缓冲液	伯乐公司，加利福尼亚州赫拉克勒斯	1610747	10 mL 的目录编号
2-ME	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯	M6250-10ML	10 mL 的目录编号
ageRuler 预染蛋白 Marker	赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆	26616	500 µL 的目录编号
Bio-Safe™ 考马斯亮蓝染色液	伯乐公司，加利福尼亚州赫拉克勒斯	1610786	1 L 的目录编号
无纺洁净室擦拭布：TX604 TechniCloth	TexWipe，北卡罗来纳州凯尔纳维尔	TX604
云母片（Muscovite Block Mica）	AshevilleMica，弗吉尼亚州纽波特纽斯	Grade-1
氨基丙基三烷氧基硅烷 (APS)	按文献22所述方法合成
HEPES	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯	H4034-25G	25 g 的目录编号
透明胶带（Scotch Tape）	Scotch-3M，明尼苏达州圣保罗
TESPA-V2 原子力显微镜探针（用于静态成像）	Bruker AFM Probes，加利福尼亚州卡马里奥
MSNL-10 原子力显微镜探针（用于标准时间序列成像）	Bruker AFM Probes，加利福尼亚州卡马里奥
Aron Alpha 工业级强力胶	Toagosei America，俄亥俄州西杰斐逊	AA480	2 g 管装的目录编号
MgCl₂	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯	M8266-100G	100 g 的目录编号
Millex-GP 滤器，0.22 µm	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯	SLGP05010	10 个装置的目录编号
BL-AC10DS-A2 原子力显微镜探针（用于高速原子力显微镜，HS-AFM）	奥林巴斯，日本
化合物 FG-3020C-20	FluoroTechnology Co., Ltd.，日本爱知县春日井市鹿ケ谷
化合物 FS-1010S135-0.5	FluoroTechnology Co., Ltd.，日本爱知县春日井市鹿ケ谷
MultiMode 原子力显微镜	Bruker-Nano/Veeco，加利福尼亚州圣塔芭芭拉
高速时间序列原子力显微成像系统	安藤俊夫，金泽大学纳米生命科学研究所，日本金泽市额田町