诱导与评估实验性近视小鼠模型

摘要

在本实验方案中，我们描述了使用新设计的眼镜在小鼠中诱导实验性近视的完整过程，以及获得稳定且可重复的眼部参数测量结果所需的技术。

摘要

由于小鼠模型在遗传操作方面相对简便，因此可成为近视研究的有力工具。在动物中诱导近视的方法之一是在其眼前佩戴透明的负镜片数周（即镜片诱导性近视，LIM）。然而，目前各实验室在诱导和评估方法上尚无统一标准。本文介绍了一种高度实用且可重复的小鼠镜片诱导性近视建模方法，该方法采用新设计的眼镜装置，可将镜片稳定固定于小鼠眼前，同时允许取下镜片以便清洁或进行局部药物干预。该模型表型稳定、效率高且个体间差异小。本文所述方法适用于断奶后的小鼠，从而延长了实验的可操作时间。我们还提供了在屈光度和眼轴长度测量中获得可重复结果的技术建议。希望本文提供的分步操作方案和详细说明能帮助研究人员更顺利地开展近视相关实验，并促进不同实验室之间数据的可比性。

引言

近视的患病率近年来显著上升，而其发生和进展的机制在很大程度上仍不清楚¹。近视最典型的表型特征是眼轴长度（AL）的延长，这会增加视网膜并发症甚至失明的风险²。为了更好地理解近视的发病机制并开发有效的治疗方法，需要建立可靠的近视动物模型和稳定的表型评估方法。

简而言之，目前存在两种在动物中诱导近视状态的方法：形觉剥夺性近视（form-deprivation myopia, FDM）和透镜诱导性近视（lens-induced myopia, LIM）³。前者通过在眼前放置漫射器或缝合眼睑以模糊成像，干扰眼球的正常发育，从而导致近视表型；后者则通过在眼前佩戴负透镜，使焦点后移至视网膜之后。视网膜感知到焦点的偏移后，会促使眼球延长，以重新使视网膜与焦点对齐。在FDM模型中，眼睑闭合或漫射器固定后，几乎无需进一步维护；而在LIM模型中，需定期取下透镜进行清洁以保持其透明度。因此，从技术上讲，FDM相对更容易建立。然而，FDM与LIM的作用机制不同，哪种方法更能模拟人类近视仍存在争议³。LIM的一个优势在于其表型效应强于FDM，至少在小鼠中是如此⁴。

用于诱导近视的动物包括鸡

方案

所有实验程序均经庆应义塾大学医学院动物研究伦理委员会批准，并遵循ARVO关于眼科与视觉研究中动物使用声明、庆应义塾大学动物实验机构指南，以及动物研究：体内实验报告（ARRIVE）指南中关于实验动物使用的规定。

1. 组装小鼠用眼镜

1. 准备组装眼镜所需的部件（图1a）。每只小鼠需准备以下所有部件：一根头戴式尼龙棒、一个较高的和一个较低的钛框架、两片根据实验目的选择合适度数的镜片、一颗M1.4尺寸、长度为10 mm的螺丝、一颗M1.4尺寸的螺母、一个厚度为0.3 mm的M1.4平垫圈，以及两个人工指甲尖（材料表）。
   注意：存在两种不同高度的框架。每只小鼠使用一个较高框架和一个较低框架作为一组。较高框架应置于较低框架之上，以确保视野对称。框架和镜片由作者研究团队专门设计和制造，可通过联系本文通讯作者获取。其他部件可在零售工具商店中购得。
2. 分别组装左眼和右眼的框架。
   1. 将指甲尖朝向外侧放置，以达到最佳保护效果。调整指甲尖与框架之间的角度至约130°，以避免遮挡小鼠的视野（图1b）。使用氰基丙烯酸酯胶水将人工指甲尖粘附到框架上。
      注意：指甲尖有助于防止小鼠抓伤镜片。由于较高框架用于右眼、较低框架用于左眼，因此两个指甲尖的方向必须相反。

结果

首先，检查是否已准备好所有必要部件（图1a）。组装好的眼镜部件示例见下图 图1b除镜架主体和螺母外，其余部件均为每只小鼠一次性使用。一副完整的“眼镜”如图所示。 图1c调整两个框架之间的角度，以适应不同年龄的小鼠。

折射率测量的一个示例如图2a所示。该样本为一只从出生后21天（p21）开始佩戴-30 D镜片、持续3周后诱导形成的近视小鼠眼球。需要注意的是，应将小鼠的注视方向控制在x轴和y轴均接近0度的位置，这意味着小鼠正直视相机前方⁹。图2b展示了一个使用针对小鼠优化的谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）系统获.......

讨论

为确保眼镜稳定地固定在小鼠头部，本方案中有多个步骤需要特别注意。使用牙科粘合剂系统前，必须彻底去除颅骨表面的骨膜。颅骨上的血液也需仔细清理干净。粘合剂涂抹后，允许进行轻微调整，但在粘合剂完全干燥前，切勿频繁移动固定棒。请严格遵循粘合剂系统的使用说明，尤其是最终混合物中各组分的比例。在维护眼镜或术后随访测量过程中抓取小鼠时，切勿将固定棒与小鼠身体一同抓握。颅骨与固定棒之间的相对移动是导致固定棒脱落的最常见原因。若手术操作得当且抓取手法正确，在包含20只小鼠、为期3周的实验中，固定棒脱落的个体数通常少于1只。

毛发和食物残渣可能滑入眼睛与镜片之间的间隙。这不仅会影响镜片的透明度，还可能对角膜表面造成物理性损伤。为了保持镜片的透明性，每周至少需要清洁两次。这也能让小鼠有机会梳理面部，从而降低角膜并发症的发生率。镜架与皮肤之间应留出约1 mm的空隙，以允许小鼠正常眨眼。镜架可能会妨碍小鼠通过笼顶的网格取食外部的食物，因此建议直接将食物放置在笼底。每周更换笼子约两次，也有助于保持镜片清洁。脏污的镜片会变成散射体，通过形觉剥夺机制诱发近视。这可能使数据产生偏差，导致结果难以解释，因为已有证据表.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
螺丝	NBK	SNZS-M1.4-10
洗板机	MonotaRO	42166397
坚果	MonotaRO	42214243
棒状物	DMM 制作	无	由作者设计，并通过从 DMM Make 租用的 3D 打印机输出。
帧	DMM 制作	无	由作者设计，并通过从 DMM Make 租用的 3D 打印机输出。
透镜	彩虹色隐形眼镜	无	由该公司针对小鼠使用进行定制
氰基丙烯酸酯胶水	OK 模型	MP 20g
牙科粘接树脂水门汀	SUN MEDICAL	超级键合	含有用于去除小鼠颅骨骨膜的蚀刻液
红外光折射计	斯泰因拜斯转移中心	无	由来自图宾根大学的 Frank Schaeffel 博士设计并提供übingen
光谱域光学相干断层扫描	Leica	R4310
托吡卡胺，盐酸去氧肾上腺素溶液	Santen	美多丽-P
咪达唑仑	Sandoz K.K.	SANDOZ	麻醉成分
美托咪定	Orion Corporation	多米托	麻醉成分
酒石酸布托啡诺	明治制果制药	Vetorphale	麻醉成分
0.1 % 纯化透明质酸钠	Santen	透明质酸酶
盐酸阿替米唑	Zenoaq	抗sedan