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利用重组融合蛋白进行荧光蛋白酶检测平台及其凝胶内复性

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DOI：

10.3791/58824

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2019年1月16日

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Biotechnology Research Department, Gedeon Richter Plc

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了近期开发的一种蛋白酶检测平台的详细操作流程，该平台利用固定在镍-氮川三乙酸磁性琼脂糖珠表面的N端六组氨酸/麦芽糖结合蛋白与荧光蛋白融合的重组底物进行检测。同时，还介绍了对十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的检测样品进行凝胶内分析的方法。

摘要

由于蛋白酶在生物体的多种生物途径及致病过程中具有关键作用，因此被广泛研究；也正因如此，它们成为重要的药物靶点。我们开发了一种基于磁性琼脂糖珠的检测平台，用于研究蛋白水解活性，该平台利用重组融合蛋白作为底物。为展示该检测系统的应用，本文以人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）蛋白酶为例提供了一个实验方案。该检测平台可高效用于蛋白酶的生化表征，包括在突变、动力学、抑制或特异性研究中进行酶活性测定，也可适用于高通量底物筛选，或可适配于其他蛋白水解酶。

在此检测系统中，所使用的底物包含N端六组氨酸（His6）和麦芽糖结合蛋白（MBP）标签、烟草蚀刻病毒（TEV）和HIV-1蛋白酶的切割位点，以及C端荧光蛋白。这些底物可在大肠杆菌（Escherichia coli）细胞中高效表达，并利用镍（Ni）螯合包被的磁珠轻松纯化。在检测过程中，磁珠结合底物的蛋白水解切割会释放出荧光切割片段，可通过荧光测定法进行定量检测。此外，切割反应还可通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析。本文还描述了一种凝胶内复性实验组分的方案，因为荧光蛋白的部分复性可使其基于分子量和荧光实现检测。

引言

由于蛋白水解酶在代谢通路及工业应用中具有重要意义，它们成为被广泛研究的酶类之一。蛋白酶在病毒感染、血液凝固调控、癌症以及心血管和神经退行性疾病中发挥关键作用，使其成为药物研发领域的重要靶点。因此，对目标蛋白酶（PR）的底物特异性和抑制剂谱进行详细表征至关重要，通常需通过快速、经济且可靠的生化检测方法来完成1,2,3。

目前，药物发现领域中用于化合物谱型分析的体外蛋白酶检测方法绝大多数为均相、基于荧光标记肽段且兼容高通量筛选（HTS）的平台4。此外，标记肽段不仅适用于文库筛选，还可作为有力工具用于测定所选底物上的酶动力学参数。在其他无法对底物进行标记的情况下，基于分离的检测方法可能为评估蛋白水解反应的动力学特性提供可行方案3。

通常，体外蛋白酶检测基于两类底物：短肽或完整蛋白质。在短肽序列的切割能够充分反映切割特性的条件下，可采用以下标准方法：(i) 检测标准蛋白底物，如氧化胰岛素B链；(ii) 测试其他蛋白酶的商业化底物；(iii) 筛选通过组合化学合成的、带荧光标记的肽库；或 (iv) 使用基因方法，例如生物展示技术5,6。除传统分类外，目前还存在其他新型底物生成平台（例如，由蛋白质组衍生的肽库构建7，或基于重组融合蛋白底物等特殊类型的基因方法8,9,10,11,12）。

上述所有底物类型和检测方法均有各自的优点和局限性，因此仍需开发能够结合和/或改进现有平台优势的检测方法。本文介绍了一种基于分离的荧光蛋白酶检测方案，该方法利用重组底物。这些融合蛋白由 His6 标签和 MBP 标签组成，二者与烟草蚀刻病毒蛋白酶（TEV PR）的对照切割位点融合，其后为感兴趣的底物序列，该序列直接连接至C端的荧光蛋白（FP）（图1A）。将编码感兴趣切割位点的DNA序列克隆到“克隆盒”中时，可通过单次连接反应完成，即将其插入先前由限制性内切酶线性化的表达质粒中。

蛋白酶切割实验示意图；过程包括底物表达、切割及聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
图1：荧光蛋白酶检测法的原理。（A）图示为荧光底物及其被人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）蛋白酶切割的示意图。箭头指示HIV-1蛋白酶在基质/衣壳切割位点序列（VSQNY*PIVQ）内的切割位置。（B）荧光底物可用于通过基于镍-NTA磁珠的检测法以及聚丙烯酰胺凝胶电泳分析酶促反应，工作流程图中展示了该过程。请点击此处查看此图的放大版本。

尽管已有文献报道过使用类似重组蛋白底物的蛋白水解检测方法——该底物包含亲和标签、蛋白酶切位点和荧光蛋白8,9,10，但本文所介绍的系统旨在整合并改进这些方法的优势。一个重要区别在于，本检测平台中的融合蛋白底物配备了麦芽糖结合蛋白（MBP），以增强蛋白可溶性13，并包含烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶的对照酶切位点。此外，这些底物采用了新一代荧光蛋白，具有高度稳定性且为单体形式，可防止底物发生聚集。除此前已发表的mTurquoise2和mApple融合形式的应用外14，本文还展示了使用含单体增强型黄色荧光蛋白（mEYFP）荧光标签的重组底物所获得的结果。由此，我们证实了该系统与其他荧光蛋白的兼容性，并展示了通过该蛋白酶检测所能获得的一些典型结果类型。

重组融合蛋白在 E. coli BL21(DE3) 细胞中表达，并作为底物用于镍-氮川三乙酸（Ni-NTA）包被的磁性琼脂糖珠固定形式的检测。当目标蛋白酶切割后，C端切割产物从磁珠表面释放至上清液中。在将上清液（含有酶和切割产物）与磁珠分离后，可通过测定荧光来确定酶的切割特性。与先前描述的方法不同，本系统中底物及C端切割产物的量是基于详细的底物校准程序进行准确定量的。该检测系统可辅以对检测样品进行SDS-PAGE分析；电泳后可立即对凝胶中的荧光成分进行原位可视化检测，或分别对未变性和已变性的荧光组分进行凝胶内复性后再进行荧光成像14。

“克隆盒”的灵活性和结构设计使得多种序列能够以省时、经济的方式插入到载体中，从而促进底物文库的构建。由于所有检测步骤均可实现自动化并兼容高通量筛选（HTS），该系统尤其适用于蛋白酶特异性分析和突变研究，也可有效用于工业级蛋白酶抑制剂筛选和/或抗病毒药物开发。

可通过所开发的基于分离的检测方法测定酶动力学参数（kcat、Km）；因此，该方法适用于开展各项酶动力学测量，如时间进程、底物依赖性及抑制研究。这证明，重组融合蛋白底物可作为常用合成寡肽底物的良好替代方案，且由于其与多聚蛋白底物高度相似，能更准确地反映天然存在的酶-底物相互作用。

方案

1. 底物编码表达质粒的构建

  1. 使用 PacI 和 NheI 限制性内切酶将 pDest-His6-MBP-FP 表达质粒线性化。pDest-His6-MBP-FP 的构建方法见 Bozóki 等人14。
    1. 在微量离心管中加入 1,500–2,000 µg pDest-His6-MBP-FP 表达质粒、PacI 和 NheI 限制性内切酶各 2 µL、10 µL 10× 缓冲液（参见材料表）以及无核酸酶水（NFW），总体积调至 100 µL。
    2. 将反应混合物在 37 °C 下孵育 1 小时。
  2. 向反应混合物中加入 20 µL 6× DNA 紫色上样染料，使用 1% 琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物。以 1 kB DNA ladder 作为分子量标准。
  3. 用含 20 µL SYBR Green 溶液的 20 mL TAE 缓冲液（40 mM Tris，20 mM 乙酸，1 mM EDTA，pH 8.5）冲洗凝胶 15 分钟，并使用锋利工具切下线性化质粒对应的条带。
    注意：在暗读式蓝色透射仪（DRBT）照射下，线性化的 pDest-His6-MBP-FP 质粒在约 7–8 kB 处呈现为一条清晰且明亮的条带。
  4. 按照试剂盒说明书，使用凝胶回收试剂盒从凝胶切片中纯化线性质粒。
  5. 将底物序列插入线性化的 pDest-His6-MBP-FP 表达质粒中。
    1. 退火编码目标底物序列的、经E. coli密码子优化的正向（FWD）和反向（REV）寡核苷酸引物。
      注意：退火后的引物两端将带有与 PacI 和 NheI 限制性内切酶识别位点相对应的黏性末端（图 2）。
      1. 在 0.2 mL 聚合酶链式反应（PCR）管中混合 150 ng 线性质粒、200 ng FWD 引物和 200 ng REV 引物，并加入无核酸酶水（NFW）调节体积至 17 µL。
      2. 将混合物在 65 °C 孵育 2 分钟，然后在 4 °C 孵育至少 2 分钟。
    2. 通过连接反应将退火后的引物插入线性质粒。
      1. 向含有线性质粒和退火引物的混合物中加入 2 µL T4 连接酶缓冲液（10×）和 1 µL T4 连接酶。
      2. 将连接反应混合物在 16 °C 下孵育 16 小时。

DNA测序引物设计；PacI、NheI酶切位点；正向、反向引物序列表格。
图2：编码蛋白酶切割位点序列的寡核苷酸引物。 正向与反向引物编码HIV-1 PR的VSQNY*PIVQ切割位点序列。将互补的寡核苷酸引物退火后，形成的短双链DNA具有PacI和NheI限制性内切酶相对应的黏性末端。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将5 µL连接混合物转化至100 µL BL21(DE3)感受态细胞中，并将细胞涂布于含氨苄青霉素的溶菌肉汤（LB）琼脂平板上。
    ​注意：只有成功连接后，荧光蛋白才会与N端融合标签处于同一开放阅读框中。转化后数天，菌落（含有编码目标切割位点的表达质粒）将表现出可见荧光，无论是否使用DRBT均可观察到。
  2. 从所示菌落制备甘油菌种。
    1. 将单个菌落洗入含有5 µL含氨苄青霉素（终浓度100 µg/mL）的LB培养基的50 mL离心管中。
    2. 在37 °C、220 rpm持续振荡条件下孵育8 h；然后在室温下以1,000 × g离心5 min收集细胞。
    3. 将细胞轻轻重悬于1 mL 80%甘油溶液（用蒸馏水稀释）中，并向悬浮液中加入500 µL 10 mM MgCl2溶液。
    4. 将悬浮液转移至冻存管中，并将菌种在-70 °C保存。
  3. 通过DNA测序验证所构建质粒的序列。
    1. 将10 µL甘油菌种（步骤1.7中制备）加入含100 µg/mL氨苄青霉素的5 mL LB培养基中，置于50 mL离心管内。
    2. 在37 °C、220 rpm持续振荡条件下孵育16 h；然后在4 °C下以2,000 × g离心10 min收集细胞。
    3. 根据生产商说明书，使用质粒小量提取试剂盒（见材料表）从细胞沉淀中提取表达质粒，并将纯化后的质粒用于DNA测序。
      注意：测序可使用以下寡核苷酸引物：5'-GATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAG-3'（正向）和5'-GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGC-3'（反向）。

2. 荧光底物的表达

  1. 准备起始培养物。
    1. 将10 µL甘油菌种（步骤1.7中制备）加入含有100 µg/mL氨苄青霉素的5 mL LB培养基中，置于50 mL离心管内。
    2. 将悬浮液在37 °C下培养15小时，同时以220 rpm持续振荡。
  2. 将5 mL细菌培养物转移至装有50 mL新鲜LB培养基（含100 µg/mL氨苄青霉素）的500 mL无菌锥形瓶中。
  3. 在37 °C下培养细胞，使其在600 nm波长处的吸光度达到0.6–0.8，同时以220 rpm持续振荡。
    注意：若在步骤2.5中需进行四环素处理，则不建议将细胞培养至600 nm处吸光度超过0.6。
  4. 加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使其终浓度为1 mM，以诱导蛋白表达。
  5. 若不进行四环素处理，则在37 °C下继续培养3小时，同时以220 rpm持续振荡，并继续执行步骤2.6；若进行四环素处理，则继续执行步骤2.5.1–2.5.3。
    注意：E. coli细胞产生的某些荧光蛋白可能具有较长的成熟时间（参见前期研究）16,17；在此类情况下，可选择使用四环素处理以阻断蛋白翻译，从而提高底物溶液的荧光产量。
    1. 将细胞悬浮液在37 °C下以220 rpm持续振荡培养2小时，然后加入四环素溶液（终浓度为200 µg/mL）。
    2. 根据所选荧光蛋白的成熟时间，在37 °C下继续培养细胞，同时以220 rpm持续振荡。
  6. 将2 × 25 mL培养物转移至洁净的50 mL离心管中，并在4 °C下以4,000 × g离心15分钟收集细胞。
  7. 弃去上清液，并将细菌细胞沉淀在-70 °C下保存至少1小时。
    注意：表达荧光底物的细胞在使用或不使用DRBT的情况下均表现出可见荧光。

3. 细胞裂解

  1. 将冷冻的细胞沉淀置于冰上，静置15分钟使其解冻。
  2. 向沉淀中加入2 mL裂解缓冲液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM 咪唑，0.05% Tween 20，pH 8），重悬细胞。
  3. 向悬液中加入10 µL新配制的苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制剂溶液（8.7 mg/mL，溶于乙醇）。
  4. 向悬液中加入2 mg溶菌酶和20单位DNase，并充分混匀。
  5. 将悬液置于冰上孵育15分钟，期间偶尔涡旋振荡。
  6. 将2 × 1 mL悬液转移至1.5 mL微量离心管中，进行超声处理，总时长3分钟，每次超声10秒，间隔5秒休息，循环进行。
  7. 在室温下以10,000 × g 离心20分钟，然后小心吸取各管中的荧光上清液（澄清的细菌裂解液），转移至新的微量离心管中。
    注意：含有荧光底物的澄清裂解液在使用或不使用DRBT的情况下均可见明显荧光，可在4 °C保存最多2周，切勿冷冻。澄清裂解液可直接用于蛋白酶活性检测的样品制备（见第4.1节），也可用于底物纯化（见步骤4.5.1）。

4. 基于 Ni-NTA 磁珠的蛋白酶检测

注意：由于该检测平台具有灵活性，可针对多种不同类型的研究进行优化。因此，加之所选酶的活性速率存在差异，某些检测参数（如特别注明）无法明确描述，需根据具体的研究目标和实验设计进行优化。作为指导，部分研究类型的参数已在相应步骤中注明。

  1. 样品制备
    1. 生成连接底物的磁珠
      1. 将一个封闭的 2 mL 低蛋白结合（参见 材料表) 含有新或回收（见第4.7节）Ni-NTA磁性琼脂糖珠的微量离心管置于磁性粒子浓缩器（MPC）中。
        注意：所用珠悬浮液的体积应根据实验设计确定。本实验中每次使用 1 mL 磁珠溶液（5%，v/v）。
      2. 磁珠可能粘附在微量离心管的管壁和/或管盖上；因此，需将MPC倒置并朝各个方向转动，以确保所有磁珠均被收集。
      3. 移除上清液并弃去。
      4. 用裂解缓冲液洗涤磁珠。
        1. 向磁珠中加入 1.8 mL 裂解缓冲液，并将封闭的试管从磁力架（MPC）上取下。
        2. 通过振荡和/或倒置试管，使管中的珠子悬浮，直至样品完全均匀。
        3. 将试管放回磁力架中，并倒置以收集磁珠。
        4. 打开离心管并弃去上清液。
      5. 将1.0–1.8 mL澄清裂解液（按步骤3.7制备）加入珠子中，并将离心管从磁性分离架（MPC）上取下。
      6. 将封闭的试管倒置，直至磁珠完全均匀分散，然后在室温下用旋转器缓慢旋转30分钟。
      7. 将其放入磁性板架（MPC）中，从磁珠和管盖上移除澄清的细胞裂解液。
        注意：澄清的细胞裂解液可弃去或保存以备后续使用（参见步骤 3.7 后的说明）。
      8. 向连接底物的磁珠（SAMBs）中加入 1% Tween 20（pH 7）。
        注意：SAMBs 在使用或不使用 DRBT 的情况下均表现出可见荧光。
    2. SAMBs 的洗涤
      1. 将装有 SAMB 悬液的试管放入磁力架中，弃去上清液。
      2. 用以下缓冲液各洗涤 SAMBs 3 次：i) 1.8 mL 1% Tween 20（pH 7）；ii) 1.8 mL 洗涤缓冲液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，5 mM 咪唑，0.05% Tween 20，pH 7）；iii）1.8 mL 裂解缓冲液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，0.05% Tween 20，pH 7
        注意：洗涤步骤参见4.1.1.4。可根据实验需求更换切割缓冲液，但建议查阅Ni-NTA磁珠的使用手册以确认兼容性。
    3. SAMB 储备液的制备
      1. 向洗涤后的SAMBs中加入裂解缓冲液，制备SAMB储存溶液。
        注意：加入缓冲液后，切勿振荡或倒置离心管。裂解缓冲液的体积取决于具体的实验设计，需根据磁珠数量（见步骤 4.1.1.1）以及步骤 4.1.4.2 中将使用的体积进行计算。对于 2 mL 离心管，所用体积最多可达 1,900 µL （参见 表1推荐的SAMB储存液中磁珠密度为2%-10%（v/v）。
        研究类型裂解缓冲液体积（µL)
        S依赖性测量（图4）1600
        时间过程测量（图 5A）1600
        抑制研究（图 5B）1900
        pH 依赖性研究（图 6）1400

        表1：在不同类型的测量中用于制备SAMB储存溶液的裂解缓冲液体积。
      2. 从磁力架上取下封闭的试管。立即使用 SAMB 原液，或将其储存于 4 °C 长达 24 小时。
    4. 使用 SAMB 储存液制备检测样品
      注意：该部分实验的细节在很大程度上取决于具体的实验设计（所示样品类型为示例） 表2).
      样本类型注意事项
      反应样品（R）  - 用于评估切割特性
      - 含有裂解缓冲液中的酶和底物
      底物空白样品（B） - 用于评估底物的自发解离（见步骤 4.6.2）
       - 仅含裂解缓冲液中的底物
      底物对照样品（C） - 用于确定底物浓度（见步骤 4.6.3）
       - 仅含洗脱缓冲液中的底物

      表2：基于Ni-NTA磁珠的蛋白酶检测的样本类型
      1. 为测定样品准备 2 mL 低蛋白吸附微离心管。
        注意：也可使用其他低蛋白吸附的塑料器皿。使用圆底或平底管以确保磁性琼脂糖微球（SAMBs）的自由移动。参见推荐的管数 表3.
        研究类型RBC
        S依赖性测量（图4）552
        时间进程测量（图 5A）662
        抑制研究（图5B）771
        pH 依赖性研究（图 6）551

        表3：在所展示的研究中，每种样品类型所需的2 mL微量离心管数量。
      2. 将 SAMB 储存液充分混匀至均匀状态，并立即将反应中待分析的底物转移至样品管中。推荐体积为 25-300 µL，但应根据具体的实验设计进行设定（表4).
        注意：检查所有 SAMB 是否均已沉降至管底。SAMB 可能黏附在管壁上，从而影响实验结果。若需依次测量不同体积，应先移取最大体积，并尽量减少更换移液器和/或移液器吸头的次数。
        研究类型RBC
        S依赖性测量（图4）25 – 50 – 100 – 150 – 250 25 – 50 – 100 – 150 – 25025
        时间进程测量（图 5A）252525
        抑制研究（图5B）120120120
        pH 依赖性研究（图 6）100100100

        表4：在示范研究中每种样品类型的样品瓶内测得的SAMB溶液的体积。
      3. 将装有分装 SAMB 悬液的样品管放入磁力架中，并轻轻前后移动磁力架。
      4. 小心移除 SAMBs 上清液并弃去。
      5. 从磁力架上取下离心管，小心加入计算好的反应缓冲液体积（切割或洗脱缓冲液 [100 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 7]）至 SAMBs 中。
        注意：根据具体的实验设计计算缓冲液体积（表 5）。对于2 mL离心管，建议反应混合液的终体积为50–150 µL确保所有 SAMB 在所添加的缓冲液中充分洗涤。在底物对照（C）样品中，使用洗脱缓冲液代替切割缓冲液。对于抑制研究，建议在此步骤中加入所选的抑制剂。
        研究类型反应缓冲液体积（µL)
        S依赖性测量（图4）68 µL 裂解缓冲液
        时间进程测量（图 5A）68 µL 裂解缓冲液
        抑制研究（图5B）67.3 µL 裂解缓冲液 + 0.7 µL 抑制剂储备液*
        pH 依赖性研究（图 6）69.5 µL 裂解缓冲液**

        表5：示范研究中反应缓冲液的体积。 阿普瑞那韦溶于二甲基亚砜；阿普瑞那韦储备液（浓度范围为 1 nM 至 1 µM 浓度）用于抑制研究（参见 图5B所用的裂解缓冲液的pH范围为6.0–8.5。
      6. 盖上试管盖。此时样品已准备好用于检测。
        注意：样品可在 4 °C 最多可保存24小时，但仅在SAMB储备液配制后立即使用的情况下才适用（见步骤4.1.3.2）。
  2. 启动蛋白水解反应
    1. 根据实验需求配制蛋白酶溶液。
      注意：建议使用切割缓冲液来溶解和/或稀释酶。HIV-1蛋白酶纯化的相关方案14 和 TEV 蛋白酶18 此前已发表。
    2. 设定恒温振荡器的振荡速率（600 rpm）和孵育温度（表6).
      研究类型孵育温度（°C)
      S依赖性测量（图 4）37
      时间过程测量（图 5A）37
      抑制研究（图 5B）37
      pH 依赖性研究（图 6）30

      表6：不同研究类型中采用的孵育温度。 对于 HIV-1 PR， 37 °C 建议使用，而 30 °C 建议用于TEV蛋白酶。
    3. 向反应样品中加入酶溶液，以启动蛋白水解反应。
      注意：对于底物空白（B）和 C 样品，分别加入裂解缓冲液（酶缓冲液）和洗脱缓冲液。体积应根据具体实验需求进行计算。表7）。对于2 mL离心管，建议反应体系的最终体积（即4.1.4.5步骤中加入的反应缓冲液体积与此步骤中将要加入溶液的体积之和）为50–150 µL.
      研究类型酶溶液/酶缓冲液/洗脱缓冲液体积（µL)
      S依赖性测量（图4）2
      时间进程测量（图 5A）2
      抑制研究（图 5B）2
      pH 依赖性研究（图 6）0.5

      表7：在示范研究中初始化检测样品时所加入的酶溶液/酶缓冲液/洗脱缓冲液的体积
    4. 轻轻移动试管，小心搅动磁珠，并立即将试管放入已开启振荡的恒温混匀仪中。
      注意：手动终止样品（见第4.3节）所需时间长于反应启动，因此建议各反应启动之间至少间隔2分钟。
    5. 根据实验设计孵育样品（表8).
      研究类型孵育时间（min）
      S依赖性测量（图 4A）7
      S依赖性测量（图 4B）120
      时间过程测量（图 5A） 0 – 2.5 – 5 – 10 – 15 – 20 
      抑制研究（图 5B）10
      pH 依赖性研究（图 6）60

      表8：不同测定中实验样品的孵育时间。
  3. 终止蛋白水解反应的检测
    1. 在孵育结束前30秒，将样品从摇床中取出，并立即离心。
    2. 将试管置于磁力板架（MPC）上，静置15秒，并轻微前后移动磁力板架。
    3. 打开盖子，小心地将上清液转移至一个新培养板或新离心管中。
      注意：切勿用移液器枪头接触浓缩的珠子。C 样品和具有高度裂解的 R 样品的上清液在使用或不使用 DRBT 的情况下均可能显现出可见的荧光。
  4. 荧光检测
    1. 转移 2 x 30 µL 将分离后的样品上清液加入黑色半面积微孔板中。
    2. 使用适当的激发和发射滤光片测量荧光。
      注意：还需测量裂解缓冲液和洗脱缓冲液的基础荧光值。应根据所测荧光蛋白选择合适的滤光片组合。表9).
      荧光蛋白激发滤光片（nm）发射滤光片（nm）
      mTurqiouse2355/40 460/25 
      mEYFP544/15590/10 
      mApple544/15590/10 

      表9：用于检测不同荧光蛋白的激发和发射滤光片。
  5. 校准
    注意：为了在步骤 4.6.1 中生成标准曲线，需要测定在不同浓度下用裂解缓冲液或洗脱缓冲液溶解的纯化底物的荧光强度值。
    1. 纯化荧光底物。
      注意：可用于蛋白酶检测后收集底物空白（B）样品的SAMB，或可另配制新的SAMB悬液（见4.1.1和4.1.2节）。
      1. 将含有 SAMBs 悬浮于 1 mL 裂解缓冲液（2%-10%；v/v）中的离心管置于磁力架（MPC）上，通过多方向倒置 MPC 收集磁珠。
      2. 打开管子，从管体和管盖中移除裂解缓冲液。
      3. 从磁力架上取下离心管，加入400-600 µL 向 SAMBs 中加入洗脱缓冲液。
      4. 将封闭的试管在室温下用旋转仪缓慢旋转5分钟。
      5. 将试管置于磁力架上，通过将磁力架倒置来收集磁珠。
      6. 移除含有纯化完整荧光底物（洗脱液）的上清液，并将其转移至新的低蛋白吸附微量离心管中。
        注意：洗脱液表现出明显可见的荧光，无论是否使用 DRBT。
    2. 使用两个0.5 mL 10K超滤装置并行进行缓冲液置换。
      1. 量取所制备洗脱液的一半体积（200-300 µL) 至每个超滤装置中。
      2. 每次离心步骤后，分别用洗脱缓冲液和切割缓冲液稀释第一和第二超滤装置中的浓缩洗脱液。
      3. 回收后，将溶于不同缓冲液中的浓缩样品调节至相同体积，介于120-200 µL.
        注意：此时裂解缓冲液溶解的底物与洗脱缓冲液溶解的底物的蛋白含量相同；因此，若所用蛋白浓度测定方法受EDTA干扰，则无需在步骤4.5.3中测定后者的蛋白含量。
    3. 通过测定在洗脱缓冲液或裂解缓冲液中溶解的底物在280 nm处的吸光度，确定其蛋白含量。
      注意：也可使用其他方法（如 Bradford 法或二辛可宁酸（BCA）法）测定蛋白浓度，但需考虑洗脱缓冲液中 EDTA 的潜在干扰，或荧光底物自身吸光度可能带来的影响。建议在步骤 4.5.4 中所用底物溶液的初始蛋白浓度为 0.4–2.0 mg/mL，以便在合适范围内建立标准曲线。参见 表10 用于消光系数。
      底物分子量
       （Da）      		消光系数
      （M-1 厘米-1在水中于280 nm处测得）
      His6-MBP-VSQNY*PIVQ-mTurquoise272101.796845
      His6-MBP-KARVL*AEAM-mTurquoise272042.795355
      His6-MBP-VSQNY*PIVQ-mEYFP72367.194325
      His6-MBP-VSQNY*PIVQ-mApple72145.9105200

      表10：不同重组荧光融合蛋白底物的分子量及消光系数。
    4. 分别使用洗脱缓冲液或切割缓冲液，对洗脱液和切割缓冲液溶解的底物溶液进行至少八步的两倍系列稀释。
    5. 转移 30 µL 将每个稀释点的溶液加入黑色半区微孔板中。
    6. 使用步骤 4.4.2 中设定的参数，用荧光仪测量荧光。
      注意：测量裂解缓冲液和洗脱缓冲液的基础荧光值。
  6. 评估该检测方法
    1. 绘制校准曲线。
      1. 根据步骤 4.5.3 中测定的蛋白含量，计算纯化后底物溶液（在步骤 4.5.4 中使用）的浓度（单位：mM）。
      2. 使用所用稀释缓冲液（裂解缓冲液或洗脱缓冲液）的本底相对荧光强度值（RFU）校正系列稀释点的相对荧光强度值（RFU）。
      3. 将校正后的相对荧光单位（RFU）值对裂解缓冲液或洗脱缓冲液中溶解的纯化底物的摩尔浓度作图，并进行线性回归（强制截距为零）。
        注意：较高的 R2 0.97 以上的相关系数表明荧光强度与荧光蛋白浓度之间具有良好的线性关系。在此情况下，可利用回归直线的斜率在步骤 4.6.2 和 4.6.3 中评估实验组分在检测范围内的浓度。实验误差和数据点分布可能影响校准的可靠性；因此，可通过放大图进行图形化评估（如图所示） 图3），以检查 R 是否2 且斜率值受数据影响。
    2. 计算反应样品中C端荧光切割产物的含量。
      1. 使用相应B样本的RFU值校正每个R样本的RFU值。
      2. 通过将校正后的相对荧光单位（RFU）值除以基于裂解缓冲液的标准曲线斜率（见步骤 4.6.1.3），计算反应样品中裂解产物的浓度（单位：mM）。
    3. 计算反应样品中所用底物的浓度。
      1. 使用基础洗脱缓冲液的 RFU 值校正 C 样品的 RFU 值。
      2. 通过将 C 样品上清液的校正后 RFU 值除以基于洗脱缓冲液的标准曲线斜率（见步骤 4.6.1.3），计算洗脱底物在上清液中的浓度（单位：mM）。
      3. 根据以下公式，确定在步骤 4.1.4.2 中用于制备检测样品的 SAMB 储存液的底物浓度（单位：mM）：
        化学浓度公式；\( c_{SAMB} \) 浓度方程；计算，分子分析。
        此处， cSAMB 是第 4.1.3 节中制备的 SAMB 储备溶液的摩尔浓度； cC 是步骤 4.6.3.3 中计算的 C 样品中洗脱底物的摩尔浓度； 五r 是由步骤 4.1.4.5 中加入的反应缓冲液和步骤 4.2.3 中加入的酶缓冲液所形成的反应混合物体积；以及 VSAMB 是 C 样品中 SAMB 储备溶液的体积（步骤 4.1.4.2）。
      4. 根据SAMB储备液的摩尔浓度（单位：mM）及各R样品中所用体积（单位：μL），计算各R样品中底物的摩尔浓度。 µL在步骤 4.1.4.2 中测量每个反应样品管中的值。
    4. 进行数据处理。
      注意：数据分析取决于实验目的。视频展示了使用 His6-MBP-VSQNY*PIVQ-mTurquoise2 底物。初始速度值根据C端裂解片段的数量计算，并对所用底物浓度作图。通过米氏-门顿非线性回归分析确定动力学参数。
  7. 磁珠的回收利用
    注意：完成检测后，可收集磁性琼脂糖珠并进行回收利用。
    1. 使用磁力架收集用过的磁珠，并弃去上清液。
      1. 用以下缓冲液依次洗涤磁珠，每种缓冲液使用1.8 mL：再生缓冲液A（0.05% Tween 20，0.5 M NaOH）、再生缓冲液B（0.05% Tween 20）、再生缓冲液C（0.05% Tween 20，100 mM EDTA，pH 8）、再生缓冲液B、再生缓冲液D（0.05% Tween 20，100 mM NiSO₄）4，pH 8）、再生缓冲液B和再生缓冲液E（0.5% Tween 20，30%乙醇，pH 7）
        注意：洗涤步骤参见第 4.1.1.4 步。
    2. 将回收的磁珠储存于再生缓冲液 E 中 4 °C.

5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析

  1. 样品制备
    注意：在完成基于 Ni-NTA 磁珠的检测后，可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析检测上清液。在此情况下，跳过步骤 5.1.1 和 5.1.2。然而，也可以在溶液中用目标蛋白酶消化后，分析纯化的荧光底物溶液和/或其切割片段。在此情况下，继续执行步骤 5.1.1。
    1. 根据步骤 4.5.1 制备纯化的荧光底物溶液。
    2. 进行溶液内消化。
      1. 在 0.5 mL 10K 超滤装置中将洗脱缓冲液置换为切割缓冲液，并将待消化的样品分装至 1.5 mL 微离心管中。
        注意：用于 PAGE 分析时，我们每种底物分装了 68 µL，但样品管数量和分装的底物溶液体积可根据具体实验设计进行优化。
      2. 向样品中加入酶溶液。
        注意：用于 PAGE 分析时，我们加入了 2 µL HIV-1 PR，其制备方法如 Bozóki 等人14所述，但酶液体积可根据具体实验设计进行优化。建议使用切割缓冲液溶解和/或稀释酶。
      3. 根据实验设计孵育样品。
        注意：用于 PAGE 分析时，我们在 37 °C 下孵育反应混合物 45 分钟，但孵育时间和温度需根据实验设计设定。
      4. 通过执行步骤 5.1.3 终止反应。
    3. 为 PAGE 准备样品。
      注意：含荧光底物的样品可通过非变性或变性方法制备用于 PAGE。若使用非变性或变性条件，请分别执行步骤 5.1.3.1 或 5.1.3.2。
      1. 制备非变性样品：将 30 µL 样品与 6 µL 6x 非变性上样缓冲液（300 mM Tris，20% 甘油，0.05% 溴酚蓝，pH 6.8）混合。
      2. 制备变性样品：将 30 µL 样品与 6 µL 6x 变性上样缓冲液（300 mM Tris，20% 甘油，0.05% 溴酚蓝，12% SDS，100 mM β-巯基乙醇，pH 6.8）混合，并在 95 °C 加热 10 分钟。
  2. SDS-PAGE 分析
    注意：可选地，若仅需分析非变性样品（在步骤 5.1.3.1 中制备），也可进行非变性 PAGE。在此情况下，跳过第 5.3 节。
    1. 制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶（使用 14% 分离胶和 4% 浓缩胶），并向电泳槽中加入电泳缓冲液（2.5 mM Tris，19.2 mM 甘氨酸，0.01% SDS）。
    2. 将样品（在步骤 5.1.3.1 或 5.1.3.2 中制备）加入聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，并在 120 V 电压下进行电泳。
    3. 从电泳模块中取出凝胶盒，将凝胶放入洗涤槽中。
      注意：非变性样品在凝胶中已可见，甚至肉眼或使用 DRBT 即可观察。
  3. 凝胶内复性及荧光蛋白的检测
    注意：为在 DRBT 上检测变性样品（在步骤 5.1.3.2 中制备）中的荧光蛋白，需从凝胶中洗去 SDS，以实现蛋白的部分复性。
    1. 向凝胶中加入约 100 mL 蒸馏水，至少冲洗 30 分钟。
      注意：为提高 SDS 去除效率，可每 10 分钟更换一次水，或持续冲洗至 60 分钟。
    2. 使用 DRBT 或紫外成像系统对荧光蛋白进行可视化检测。
  4. 凝胶的传统考马斯亮蓝染色
    1. 用考马斯亮蓝染料对凝胶进行染色，以可视化非荧光蛋白。

结果

图1A展示了可被人免疫缺陷病毒1型蛋白酶（HIV-1 PR）在其特异性切割位点序列处加工的一种代表性荧光重组蛋白底物的示意图结构。图1B展示了底物的制备流程及其在蛋白酶检测中的可能应用，包括基于镍-氮川三乙酸（Ni-NTA）磁珠的检测和/或聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。

为通过荧光测定法获得可靠数据，需进行校准，以确定荧光底物及切割产物的量。为此，需测量不同缓冲条件下各底物的荧光强度值，并将其与所测定浓度范围内的浓度相关联（图3）。校准曲线的斜率可用于测定实验样品中底物和切割产物的含量。校准曲线的斜率与插入底物中的切割位点序列无关（表11），因此可能适用于与同一种荧光蛋白融合的一系列底物。所有线性回归均提供放大图，以便同时扩大显示较低浓度范围（图3）。需要注意的是，校准过程必须谨慎进行，因为可靠的校准需要数据点分布合理。为此，采用两倍系列稀释法来制备校准样品，因为只有在使用足够数量的数据点覆盖整个浓度范围时，R2 值才能准确反映荧光蛋白浓度与荧光信号之间的相关性。此外，实验误差可能显著影响校准的准确性，因此可能还需对回归线进行图形化评估。

该蛋白酶检测法可进行多种酶学测定，包括考察底物浓度对反应速度的影响（图4A）。通过非线性回归分析，可利用这些数据测定酶动力学参数（例如 vmax 和 Km）。若磁珠悬浮液混合不充分或反应终止操作不当，可能导致结果不理想（图4B），从而无法用于计算可靠的酶动力学数值。

可通过该检测方法确定产物生成随时间的变化关系（图5A）（例如，在优化切割反应参数期间）。也可在抑制剂存在下检测酶活性（图5B），以确定活性酶浓度及抑制常数。采用相同方法，该检测还可用于筛选其他抑制剂的作用效果。

在研究 pH 对酶活性的影响时，该蛋白酶检测方法同样具有实用价值。图6A 以烟草蚀纹病毒蛋白酶（TEV PR）为例，展示了酶活性对 pH 的依赖性，该酶具有较宽的最适 pH 范围（pH 6–9）。若研究酶活性的 pH 依赖性（或需测定具有酸性最适 pH 的酶），需注意重组底物与磁珠之间的亲和结合在弱酸性 pH 条件下可能受到限制。图6B 显示底物从磁珠上发生非特异性解离增加，可能导致检测结果出现偏差。为校正底物从磁珠上的自发解离，反应样品的测定值需用 B 样品的数值进行校正。

图7 显示，在凝胶中可通过蓝光透射照射根据荧光蛋白的颜色将其区分开来（图7A）。若需确定底物/切割片段的分子量，也可在样品制备中采用变性条件，因为荧光蛋白可在凝胶中部分复性，并通过紫外光照射（图7B）或考马斯亮蓝染色（图7C）进行检测。若分析 R 样品，则仅可观察到C端切割产物（图7C），而N端切割片段及未切割的底物仍结合于磁珠上。尽管使用了非变性条件，有时蛋白质仍可能出现部分变性（图7C），此时非变性蛋白占主导，但变性形式在样品中亦可被检测到。该现象不影响蛋白水解切割的检测，但在对非变性样品进行定量密度分析时需予以考虑。

尽管详细描述仅针对基于2 mL离心管的检测方法，但该检测方法也可适配于96孔板系统（图8），此系统已在我们的实验室成功测试（未展示）。适配于96孔板的格式同样完全兼容荧光检测和电泳分析，所获得的数据亦可依据本文所述方法进行评估。

蛋白切割与洗脱的线性回归分析；RFU 与底物浓度关系图。
图 3： 标准曲线。 以两种带有不同C端荧光标签的重组底物为例，展示典型底物的标准曲线：（A 和 B）His6-MBP-VSQNY*PIVQ-mTurquoise2，以及（C 和 D）His6-MBP-VSQNY*PIVQ-mEYFP。插图展示了0–0.005 mM底物浓度范围内数据点的线性回归情况。请点击此处查看该图的高清版本。

米氏曲线；酶动力学分析，His标签蛋白，反应速率与底物浓度。
图 4：酶动力学参数的测定。 使用终活性浓度为 41.2 nM 的 HIV-1 PR 进行底物依赖性动力学测定。将初始反应速率对底物浓度作图，并进行米氏-门廷非线性回归分析。误差棒表示标准偏差（n = 2）。（A）以 His6-MBP-VSQNY*PIVQ-mApple 融合蛋白底物为例，展示一个典型的最优结果。（B）同时展示一个典型的次优结果，即 His6-MBP-KARVL*AEAM-mTurquoise2 底物，该结果中由于 SAMB 储存液均质化不充分，导致无法准确设定底物浓度，同时因反应终止不当而产生相对较大的误差。请点击此处查看该图的放大版本。

His标签融合蛋白动力学图：浓度随时间变化曲线及对数浓度与反应速率关系图
图5时间进程与抑制研究。 (A)His6-MBP-VSQNY*PIVQ-mEYFP 重组融合蛋白底物（终浓度为 0.00326 mM）由 HIV-1 PR（终活性浓度为 41.2 nM）进行切割，通过检测荧光性 PIVQ-mEYFP 蛋白水解片段的释放完成时间进程分析。实验在五个不同的时间点进行测定。误差线表示标准差（SD）n = 2). (BHis6-MBP-VSQNY*PIVQ-mEYFP 用作底物（浓度为 0.0015 mM），以测定安普那韦对 HIV-1 PR 活性的抑制作用（HIV-1 PR 总浓度为 163.8 nM）。通过绘制数据可评估半数最大抑制浓度（IC50），并基于抑制曲线计算所用 HIV-1 PR 的活性酶浓度（最终活性浓度为 41.2 nM）。误差棒表示标准差（SD）n = 3). 请点击此处以查看该图的放大版本。

酶活性与pH关系图；底物解离百分比；科学数据分析。
图6：研究酶活性和底物自发解离对pH的依赖性。（A）使用His6-MBP-VSQNY*PIVQ-mTurquoise2底物（0.033 mM）测定TEV PR（终总浓度为91.42 nM）在不同pH（6.5–8.5范围）裂解缓冲液中的酶活性。误差线表示标准偏差（n = 2）。所绘制的数据此前已发表14。（B）基于底物空白样品的相对荧光强度值，利用pH在6.0–8.5范围的裂解缓冲液，研究了His6-MBP-VSQNY*PIVQ-mTurquoise2底物（0.033 mM）从磁珠上的自发解离情况。所绘制的数据此前已发表14。 请点击此处查看该图的放大版本。

HIV-1 PR 分析：荧光成像、紫外光、考马斯亮蓝染色；蛋白切割检测。
图 7： 通过不同方法在凝胶中检测蛋白质。（A）经非变性样品制备后的未切割及 HIV-1 PR 消化融合蛋白底物，通过 SDS-PAGE 后蓝光透射成像可视化。切割反应采用溶液中消化方式进行。（B）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）结束后立即通过紫外光照射仅能检测凝胶中的非变性蛋白；而在去除 SDS 后，先前变性的荧光蛋白部分复性并可被检测。样品来源于 Ni-NTA 磁性微珠检测系统的上清液。（C）在凝胶内复性后，也可使用考马斯亮蓝染色进行蛋白质检测。凝胶中存在的 SDS 可能导致天然蛋白的部分变性，但在天然样品中，非变性形式更为丰富。样品来源于 Ni-NTA 磁性微珠检测系统的上清液。请点击此处查看该图的放大版本。

磁珠检测示意图；样品制备、洗涤、反应、检测；电泳结果。
图8： 基于96孔板的检测平台适配方法。 （A） 该检测不仅可在2 mL离心管中进行，也可在96孔板的孔中进行。此处展示了利用一系列荧光底物研究一种假想蛋白酶特异性的检测应用示意图，这些底物可能包含野生型（wt）或突变型（mut-1至mut-4）的切割位点序列。实验中使用与96孔板兼容的磁性粒子浓缩器（MPC）来处理磁珠。所有标注体积均对应单个孔。为比较不同底物的切割效率，可依据反应样品经底物空白校正后的相对荧光单位（RFU）值占相应底物对照样品经底物空白校正后RFU值的百分比来评估底物转化率。 （B） 荧光测定后，检测样品的上清液也可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分析；对于非变性或变性样品制备，荧光蛋白组分可分别直接分析或经凝胶内复性后再分析。每幅图中还展示了三种不同的检测样品类型：C = 底物对照，B = 底物空白，R = 反应样品。底物对照样品位于洗脱缓冲液中，而底物空白和反应样品则位于切割缓冲液中。 请点击此处查看该图的放大版本。

缓冲液荧光蛋白斜率的变异系数 (%)
洗脱mTurquoise26.04
切割9.11
洗脱mApple10.92
切割12.68

表11：底物校准曲线斜率的变异系数（CV%）值。 为了检测重组蛋白底物的荧光是否依赖于插入的切割位点，分别使用一系列与mApple和mTurquoise2融合的底物（每种包含六种不同的HIV-1蛋白酶切割位点序列）在洗脱缓冲液和切割缓冲液中进行了校准实验。结果发现，所有情况下的斜率CV%值均低于15%，表明对于含有相同荧光标签的不同底物变体，可使用单一底物校准曲线来评估其测量结果。

讨论

由于对蛋白水解酶的工业和学术研究日益深入，以及对快速、经济且适用于高通量筛选（HTS）的蛋白酶检测平台的持续需求，我们开发了一种基于磁珠的荧光蛋白酶检测方法。该检测方法利用重组融合蛋白作为底物，可作为广泛使用的合成肽底物的新型替代方案。

在所开发的检测体系中，融合蛋白底物被固定在镍-螯合磁性琼脂糖珠的表面。底物的结合由融合蛋白N端的六聚组氨酸（His6）亲和标签介导，该标签与麦芽糖结合蛋白（MBP）标签直接融合，以促进底物的正确折叠并增强其水溶性13。MBP之后依次为烟草蚀刻病毒蛋白酶（TEV PR）和目标蛋白酶的切割位点。前者可在检测中作为对照切割位点，后者则可被待研究的蛋白酶所切割。切割位点具有可替换性；通过连接方法，可将编码目标切割位点的短双链DNA序列插入表达质粒的灵活“克隆盒”中。重组融合蛋白在C端携带一个高度稳定且为单体形式的荧光蛋白标签，使得在蛋白酶解切割后释放出的荧光C端切割产物可通过终点法进行检测（图1A）。将不同缓冲液中纯化的完整荧光底物用于校准，以测定底物及切割产物的摩尔浓度。此外，在荧光测定之后，也可通过SDS-PAGE对检测组分进行分析。凝胶中可分别在电泳后直接或经凝胶内复性后，对天然（非变性）和变性的荧光蛋白进行可视化检测。该附加步骤结合传统的考马斯亮蓝染色，可有效用于验证检测结果（图1B）。

该检测流程由简单且易于操作的步骤组成，采用低体积格式，可完全适配高通量自动化环境。然而，无论手动操作还是使用自动化系统，以下检测环节均被视为关键步骤，在操作过程中需特别注意。i) 磁珠溶液的均一性。在整个检测过程中，包括纯化和洗涤步骤，均必须使用均一的磁珠溶液。特别是，蛋白酶检测的可靠性高度依赖于对磁珠固定底物（SAMB）储备液的准确分装。为提高悬浮和分散效果，建议将磁珠浓度控制在2%至10%（v/v）之间。在样品制备过程中，使用添加非离子型去污剂（如Triton X-100或Tween 20）至多2%的缓冲液，也可减少磁珠在塑料表面的黏附。若将磁珠悬液小心地加至样品管底部而非管壁，可避免磁珠在样品管壁上的黏附。在酶促反应过程中，磁珠的均一性同样至关重要，可通过孵育期间以600 rpm持续振荡样品来确保。磁珠在圆底或平底塑料器皿中可良好分散，不建议使用V型底管。因磁珠均一性不佳导致的次优结果见于图4B。ii) 反应样品的终止 。该方法的另一优势在于，无需使用热变性处理或任何可能产生干扰的化学试剂即可终止酶促反应15。终止操作仅需使用常规磁性颗粒浓缩器将磁珠从反应混合物中分离即可实现。移除的反应缓冲液中含有活性酶及生成的C端荧光切割产物，而未切割的底物仍固定在磁珠上。由于反应缓冲液中存在活性酶，为确保终点检测的可靠性，分离操作需谨慎进行。在将样品管放入浓缩器前，建议先进行短暂离心。将管子放入浓缩器后，应至少等待15秒，使磁珠充分聚集。轻微来回移动分离器可能有助于磁珠的收集。请注意，在手动分离过程中，终止操作通常比反应启动耗时更长。因此，若所有样品需应用相同的孵育时间，建议在各反应启动之间设置约2分钟的记录延迟。

所述蛋白酶解检测方法的原理相对简单；然而，该系统的多功能性由其灵活且稳定的底物结构所保证。该检测方法的个别优化可能仅受限于亲和磁珠与所用条件、试剂和添加剂之间的相容性。根据制造商的方案，我们还发现底物与 Ni-NTA 磁珠表面的亲和结合在 pH ≤ 6.5 时显著减弱15。因此，建议在反应样品的同时平行设置底物空白样品，并在结果评估时考虑底物自发解离的速率。

在由于使用了与磁珠不兼容的组分或低pH条件而无法进行磁珠法检测的情况下，也可采用在溶液中对纯化的重组底物进行消化的方法。在这些情况下，可通过电泳分析反应混合物，并根据所述方案在凝胶中对蛋白质进行可视化检测。为了研究蛋白酶活性，在溶液中消化并结合凝胶内检测蛋白质的方法也可作为荧光测定法的替代工具。该设计底物系统的一个创新之处在于，在变性SDS-PAGE之后引入了凝胶内复性步骤。天然（未变性）的荧光蛋白在电泳过程中可保持其荧光性质，而变性处理会使其荧光丧失（图7B）。然而，通过从凝胶中去除SDS，可部分恢复变性蛋白的荧光。因此，使用变性条件分离反应组分不仅能够基于荧光进行鉴定，还能基于分子量进行鉴定。相较于考马斯亮蓝染色凝胶的分析，荧光凝胶检测的另一优势在于，可在凝胶中直接根据荧光轻松识别（天然或复性后的）荧光蛋白（见图7）。当在含有非荧光杂质或分子量相近的蛋白质样品中进行切割反应时，这一特性尤为重要。

使用类似设计底物的蛋白酶检测方法此前已有发表8,9,10，尽管这些方法中的目标切割位点同样位于亲和标签与荧光蛋白之间，但本文所介绍的检测系统不仅重现了已报道的设计理念，还整合了先前平台的各项优势，并进一步进行了改进：i) 利用麦芽糖结合蛋白（MBP）作为融合伴侣；ii) 引入烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶对照切割位点；iii) 使用新近设计的单体荧光蛋白（FPs）；以及 iv) 采用独特的底物校准程序。该检测方法本身被特别设计为一种安全、省时且经济高效的方式，适用于酶特异性与动力学研究，且无需昂贵的仪器设备。本方法旨在成为工业与学术研究中一种适用且经济的工具。由于表达质粒中“克隆盒”的灵活性，该系统可能适用于快速且低成本地构建重组底物文库。本文所述的检测方法可有效用于底物特异性、酶突变及抑制研究，同时也为酶动力学分析提供了一种替代方案。该检测平台（从细菌细胞裂解到动力学参数测定）可适配于高通量筛选（HTS）与自动化环境，未来有望应用于工业级蛋白酶抑制剂筛选和/或抗病毒药物开发。此外，本实验室还计划将该检测方法拓展至竞争性蛋白水解分析。在此类竞争性检测中，将同时使用两种不同的底物——每种底物均包含不同的切割位点，并融合不同的C端荧光标签——在同一酶切反应中共同孵育，以研究目标酶对特定靶序列的偏好性。此外，针对半胱氨酸蛋白酶，我们正在优化适用于96孔板的检测形式（图8），通过一系列切割位点序列经修饰的底物进行突变筛选。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分得到了 GINOP-2.3.2-15-2016-00044 “PHARMPROT teaming” 项目以及匈牙利人力资源部高等教育机构卓越计划（在德布勒森大学生物技术主题项目框架内）的资助。作者感谢德布勒森大学逆转录病毒生物化学实验室成员在本检测方法开发过程中提供的科学帮助，以及在拍摄检测过程视频时的耐心配合（特别是出现在视频背景中的 Norbert Kassay、Krisztina Joóné Matúz 和 Vanda Toldi）。作者还特别感谢 Gedeon Richter 公司，尤其是 Zoltán Urbányi 博士，允许 Beáta Bozóki 在生物化学与分子生物学系作为客座研究人员开展工作。作者还向德布勒森大学多媒体与电子学习技术中心的 György Zsadányi、Balázs Tőgyi、Balázs Pöstényi 和 Zoltán Király 表示衷心感谢，感谢他们在音视频制作方面提供的专业协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10K Amicon 管Merck-MilliporeUFC501096
2-巯基乙醇（β-ME）Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) M6250
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 37.5:1Bio-Rad1610148
乙酸 Merck100063
琼脂糖SERVA11404.04
Alpha Imager HP 凝胶成像系统ProteinSimple
过硫酸铵（APS）Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) A3678
氨苄青霉素钠盐Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) A9518
Beckman Coulter Allegra X-22 离心机Beckman Coulter392185
黑色半面积板Greiner bio-One675086
溴酚蓝Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) B0126
CutSmart 缓冲液（10x）New England BiolabsB7204S用于质粒线性化（步骤 1.1.1）
Dark Reader 透射仪Clare Chemical ResearchDR-45M
DNase I New England BiolabsM0303L
Dynamag-2 磁性颗粒 浓缩器Thermo Fischer Scientific12321D
大肠杆菌 BL21(DE3) 感受态细胞 Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)C600003
乙醇Merck-Millipore100983
乙二胺四乙酸 （EDTA）Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) 798681
上样染料，紫色（6X）New England BiolabsB7024S
甘油Merck356350
甘氨酸Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) G7126
高速质粒小提试剂盒GeneAidPD300
咪唑Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) 56750
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)AM9464
Jouan CR 412 离心机JouanCR412
Labinco LD-76 旋转混合器 Labinco7600
LB 培养基（Luria-Bertani 肉汤）Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) L3022
溶菌酶 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) L6876
氯化镁ScharlauMA0036
MERCK eurolab 超声波清洗器MERCKUSR54H
Millifuge Eppendorf 离心机MilliporeCT10
Mini-PROTEAN 3 电泳槽Bio-Rad
N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) T9281
NanoDrop 2000Thermo Fischer Scientific
NheI-HF 限制性内切酶New England BiolabsR3131L
硫酸镍（NiSO4）Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) 656895
Ni-NTA 磁性琼脂糖微珠 Qiagen36113
旋转摇床BiosanOS-20
PacI 限制性内切酶New England BiolabsR0547L
PageBlue 蛋白染色液 Thermo Fischer Scientific24620
苯甲基磺酰氟（PMSF）Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) P7626
Protein Lobind 微量离心管 Eppendorf22431102
QIAquick 凝胶回收试剂盒QIAGEN28704
Snijders Press-to-Mix 混合器 Gemini34524
三水合乙酸钠Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) S7670
氯化钠Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) S9888
氢氧化钠 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) S5881
SYBR Green I 核酸凝胶染色剂Thermo Fischer ScientificS7563
T4 DNA 连接酶PromegaM180A
恒温摇床BiosanTS-100配备 SC-24 附件模块
TrisSigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) T1503
Tween 20Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) P2287
WALLAC VICTOR2 1420 多标记计数仪Wallac Oy, Turku, Finland

参考文献

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