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方法文章

从牙髓组织中分离间充质干细胞并与癌细胞共培养以研究其相互作用

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DOI：

10.3791/58825

⸱

2019年1月7日

 ,  ,  ,  , 
1Genetics and Bioengineering, Yeditepe University, 2National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), Sickle Cell Branch, National Institutes of Health (NIH)

本文内容

摘要

我们提供了基于直接和间接共培养方法评估牙髓来源间充质干细胞与前列腺癌细胞相互作用的实验方案。使用条件培养基和Transwell小室膜适用于分析间接的旁分泌作用。将不同染色的细胞共同接种是研究直接细胞间相互作用的合适模型。

摘要

癌症作为一种多步骤、复杂的疾病，不仅受到单个细胞增殖和生长的调控，还受到肿瘤微环境及细胞间相互作用的控制。识别癌症细胞与干细胞之间的相互作用，包括细胞外环境的变化、物理性接触以及分泌因子等，可能有助于发现新的治疗策略。我们结合已知的共培养技术，建立了一种用于研究间充质干细胞（MSCs）与癌细胞相互作用的模型系统。在本研究中，采用直接和间接共培养技术，考察了牙髓干细胞（DPSCs）与PC-3前列腺癌细胞之间的相互作用。利用来自DPSCs的条件培养基（CM）以及孔径为0.4 µm的trans-well小室膜，研究其旁分泌效应。通过将不同类型细胞共同培养，以研究直接的细胞-细胞相互作用。结果表明，条件培养基可促进前列腺癌细胞的增殖，并减少其凋亡。无论是条件培养基还是trans-well系统，均可增强PC-3细胞的迁移能力。使用不同膜染料标记的细胞被接种至同一培养容器中，在直接共培养条件下，DPSCs与PC-3细胞共同形成了自组织结构。总体而言，研究结果表明，共培养技术可作为研究癌症细胞与间充质干细胞相互作用的有效模型系统。

引言

间充质干细胞（MSCs），具有 具有分化潜能并可参与骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱和脂肪等间充质组织再生的细胞，已从成人机体几乎所有的组织中分离获得1,2除了在慢性炎症或损伤情况下通过产生常驻细胞以维持组织稳态外，它们还分泌关键的细胞因子和生长因子，以协调血管生成、免疫系统功能及组织重塑。3间充质干细胞与肿瘤组织的相互作用尚不明确，但越来越多的证据表明，间充质干细胞可能促进肿瘤的发生、发展及转移4.

间充质干细胞向损伤或慢性炎症区域的归巢能力使其成为基于干细胞治疗的宝贵候选者。然而，癌组织， "永不愈合的伤口"，也会释放炎症性细胞因子、促血管生成分子以及重要的生长因子，从而将间充质干细胞（MSCs）募集至肿瘤发生区域5尽管有关间充质干细胞抑制肿瘤生长的报道较为有限6,7，其促进癌症进展和转移的作用已有大量报道8MSCs 通过多种方式直接或间接影响肿瘤发生，包括抑制免疫细胞、分泌支持癌细胞增殖和迁移的生长因子/细胞因子、增强血管生成活性以及调控上皮-间质转化（EMT）9,10肿瘤微环境包含多种细胞类型，如癌症相关成纤维细胞（CAFs）和/或肌成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞以及免疫细胞。11在这些细胞中，CAFs 是肿瘤区域中数量最多的细胞类型，可分泌多种促进癌症生长和转移的趋化因子。8已证明骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）可在肿瘤间质中分化为癌相关成纤维细胞（CAFs）12.

牙髓干细胞（DPSCs）由Gronthos et al.13于2000年首次鉴定为来源于牙组织的间充质干细胞（MSCs），随后被其他研究者广泛研究14,15，其表达多能性标志物如Oct4、Sox2和Nanog16，并可分化为多种细胞谱系17。基因和蛋白表达分析证实，DPSCs产生的生长因子/细胞因子水平与其他MSCs相当，包括血管内皮生长因子（VEGF）、血管生成素、成纤维细胞生长因子2（FGF2）、白细胞介素-4（IL-4）、IL-6、IL-10和干细胞因子（SCF），以及fms样酪氨酸激酶-3配体（Flt-3L），这些因子可能促进血管生成、调节免疫细胞，并支持癌细胞的增殖和迁移18,19,20。尽管MSCs与肿瘤微环境之间的相互作用已在文献中得到充分记载，但DPSCs与癌细胞之间的关系尚未被评估。在本研究中，我们建立了高转移性前列腺癌细胞系PC-3与DPSCs的共培养及条件培养基处理策略，以探讨牙源性MSCs在肿瘤进展和转移中的潜在作用机制。

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方案

在获得机构伦理委员会批准后，已取得患者的书面知情同意。

1. 牙髓干细胞的分离与培养

  1. 在拔除后8小时内，将从17至20岁青少年中获取的智齿转移至含有完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）[低糖DMEM培养基，添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素/两性霉素（PSA）溶液]的15 mL离心管中。转移过程中保持组织材料低温（4 °C），以避免潜在的细胞死亡。
  2. 使用无菌镊子小心地从牙齿中心取出牙髓组织，将牙髓组织置于盛有冷的完全DMEM培养基的10 cm组织培养皿中，并用手术刀将其切成小块（2–3 mm）。
    注意：所有实验操作均应在超净工作台内的无菌条件下进行。该非酶解技术此前已有应用21,22,23。
  3. 将小块牙髓组织放入经组织培养处理的6孔板中，并加入200 µL完全DMEM培养基，以覆盖每一块小组织。
  4. 将组织培养孔板置于37 °C、加湿空气环境（80%湿度）及5% CO2条件下孵育2小时，以促进组织贴壁。
    注意：通过控制培养基蒸发，此步骤可延长至3–4小时。
  5. 向各孔中加入适量（2–2.5 mL）的完全DMEM培养基，并在37 °C、加湿空气环境及5% CO2条件下继续孵育，以使细胞从组织块中迁移并展开。
    注意：细胞约在4天后可见，8–9天后达到汇合状态。
  6. 当细胞达到80%汇合度时，从6孔板中移除培养基，用2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后加入2 mL胰蛋白酶。在37 °C、加湿空气环境及5% CO2的培养箱中孵育2分钟。随后加入2 mL完全DMEM培养基，再孵育2分钟以抑制胰蛋白酶活性。以300 x g离心5分钟，收集细胞沉淀。
  7. 将细胞传代至含有完全DMEM培养基的培养瓶中，用于后续实验。向T-75培养瓶中加入15 mL完全DMEM培养基，将两个6孔板孔中的细胞转移至一个T-75培养瓶中，并在37 °C、加湿空气环境及5% CO2条件下孵育。

2. DPSCs 的表征

  1. 进行形态学分析。
    1. 在完全DMEM培养基中，将种子细胞（步骤1.6）接种于组织培养包被的培养瓶（或6孔板）中，传代培养至少8代，以观察细胞形态。
    2. 在光学显微镜下观察细胞，确定成纤维细胞样形态。细胞应贴附于培养皿表面，并呈现梭形细胞形态。
      注意：或者，可将细胞以单细胞形式在培养板中培养长达14天，以观察成纤维细胞和间充质干细胞（MSCs）特有的集落形成能力。
  2. 进行表面标志物分析。
    1. 从步骤1.7中用胰蛋白酶消化细胞。移除T-75组织培养瓶中的培养基，用2 mL PBS洗涤，加入2 mL胰蛋白酶。在37°C培养箱中孵育2分钟 37 °C 在加湿空气环境及5% CO₂条件下2然后加入2 mL完全DMEM培养基，孵育2分钟以抑制胰蛋白酶活性。以300 × g离心5分钟，使细胞沉淀。
    2. 用4%多聚甲醛在室温下于1.5 mL离心管中固定细胞20分钟，随后用 500 µL 用 PBS 洗涤 3 次以去除多聚甲醛。
    3. 将固定后的细胞与抗 CD29、CD34、CD14、CD45、CD90、CD105、CD166 和 CD73 抗体在室温下孵育 1 小时 4 °C 在 100 µL PBS溶液。
      注意：所用抗体的浓度为 0.5 µg/mLCD34、CD14 和 CD45 用作阴性标志物，而 CD29、CD90、CD105、CD166 和 CD73 用作间充质干细胞（MSCs）的阳性细胞表面标志物。
    4. 用 PBS 洗涤细胞 3 次，并使用相应的二抗，如异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE） 等等。 用于标记。将细胞与1:500稀释的二抗孵育 100 µL PBS 中孵育 30 分钟 4 °C 用 PBS 洗涤 3 次。
    5. 将样品避光保存用于流式细胞术分析，并通过流式细胞术检测阳性与阴性染色。
      注意：使用未染色的对照细胞设置前向散射和侧向散射。通过排除死细胞、碎片和未染色细胞群体来设定阳性染色群体的门控。使用 100 µm 使用45 psi鞘压的喷嘴，收集10,000个事件，通过设置通道确定阳性DPSCs。
  3. 进行DPSCs的分化。
    1. 接种 1 × 104 将细胞接种至24孔板中，加入完全DMEM培养基，在37°C、5% CO₂条件下培养24 h 37 °C 在含5% CO₂的湿润空气环境中2.
    2. 使用完全DMEM培养基作为基础培养基配制分化培养基。通过添加100 nM地塞米松、10 mM β-甘油磷酸钠和0.2 mM抗坏血酸配制成骨诱导培养基。通过添加1×胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS-G）、100 nM地塞米松和100 ng/mL转化生长因子β（TGF-β）配制软骨诱导培养基。 14 μg/mL 抗坏血酸，以及1 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）。通过混合100 nM 地塞米松制备成脂诱导培养基， 5 μg/mL 胰岛素，0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX），以及 60 μM indomethacin
      注意：分化培养基可保存于 4 °C 至少一周。
    3. 更换为成骨、成软骨或成脂诱导分化培养基，每周换液两次，持续两周。
    4. 通过von Kossa染色和阿利新蓝染色、酶活性检测（碱性磷酸酶活性）、免疫细胞化学以及定量聚合酶链式反应（qPCR）分析，按照先前所述方案确认分化情况21.
      1. 在室温下用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，然后对细胞进行冯克萨（von Kossa）染色和阿尔新蓝（Alcian blue）染色。用PBS洗涤固定后的细胞，并根据试剂盒制造商的说明使用冯克萨染色试剂盒染色，以观察钙盐沉积。
      2. 将1.00 g 阿利新蓝染料溶于100 mL 3%（v/v）乙酸溶液中，配制阿利新蓝染色液，用于后续染色。用PBS洗涤固定后的细胞，加入阿利新蓝染色液染色30 min。使用光学显微镜观察染色样本。

3. 条件培养基（CM）的制备

  1. 在收集条件培养基（CM）前24小时，将步骤1.7中细胞的培养基更换为新鲜的完全DMEM。
    注意：建议使用第2至第4代细胞。
  2. 当培养的DPSCs细胞达到80%融合度时，收集条件培养基（CM）。将收集的培养基在300 × g下离心5分钟，以去除废弃的组织材料和细胞碎片。
    注意：也可使用0.2 µm注射器滤器去除条件培养基中的碎片。
  3. 收集上清液，并于-20 °C保存以用于后续实验。
    注意：长期保存应将上清液置于-80 °C。

4. 用条件培养基处理癌细胞

  1. 进行细胞活力分析。
    1. 将PC-3细胞（人前列腺癌细胞）以5 × 10⁴个/孔的细胞密度接种于96孔板中3 细胞/孔，加入完全DMEM培养基，在湿润的培养箱中于37°C、5% CO₂条件下孵育 37 °C 和5% CO2 24小时。
    2. 用含10%、20%、30%、40%和50%条件培养基（CM，v/v）的完全DMEM处理细胞，处理24 h。
    3. 使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四氮唑（MTS）法检测细胞活力，方法如前所述24.
  2. 进行末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）分析。
    1. 将PC-3细胞以2 × 10⁵个/孔的密度接种于6孔细胞培养板中5 细胞/孔，在加湿培养箱中孵育 37 °C 和5% CO2 过夜。
    2. 将20% CM（v/v）与完全DMEM培养基混合，加入细胞中，处理24小时。
    3. 用胰蛋白酶处理细胞并悬浮于 50 μL TUNEL反应混合液（标记液 + 酶液，随试剂盒提供）并置于 37 °C 在加湿且含5% CO₂的环境中孵育60分钟2 大气
      注意：进行胰蛋白酶消化时，从6孔细胞培养板中移除培养基，用1 mL PBS洗涤，并加入 500 µL 胰蛋白酶。在37℃培养箱中孵育2分钟 37 °C 在加湿空气环境及5% CO₂条件下2加入1 mL完全DMEM培养基，孵育2分钟以抑制胰蛋白酶活性。以300 × g离心5分钟，沉淀细胞。
    4. 用 PBS 洗涤，并将细胞重悬于 PBS 中，通过流式细胞术进行分析。
  3. 进行qPCR分析。
    1. 将PC-3细胞以2 × 10⁵个/孔的密度接种于6孔细胞培养板中5 细胞/孔，在湿润的培养箱中孵育 37 °C 和5% CO2 过夜。
    2. 将20% CM（v/v）与完全DMEM培养基混合，加入细胞中，处理24小时。
    3. 用胰蛋白酶消化细胞，并收集细胞沉淀用于RNA提取和cDNA合成。
      注意：从6孔细胞培养板中移除培养基，用1 mL PBS洗涤，并加入 500 µL 胰蛋白酶。在37℃培养箱中孵育2分钟 37 °C 在加湿空气环境及5% CO₂条件下2加入1 mL完全DMEM培养基，孵育2分钟以抑制胰蛋白酶活性。以300 × g离心5分钟，沉淀细胞。
    4. 按照先前所述方案进行 qPCR 实验25.
  4. 进行癌细胞迁移实验。
    1. 接种 1 × 105 将PC-3细胞接种至12孔板中，于湿润培养箱内37℃过夜培养 37 °C 和5% CO2.
    2. 用无菌的划痕工具划伤细胞 200 μL 尖端处理，并立即更换为含不同浓度CM的新鲜培养基例如10%、20%、30%、40% 和 50% CM（v/v）与完全 DMEM 混合
    3. 在倒置显微镜下观察划痕，并在不同时间点（0 和 24 h）拍照。
    4. 使用 Image J 软件，通过以下公式测量划痕闭合率：
      划痕闭合率（%）公式，用于伤口愈合实验的测量；数学示意图。
      注意：使用 Image J 软件打开划痕图像。绘制一条与图像中已有的比例尺长度相同的直线。点击分析，设置比例尺，观察所绘制直线的像素距离。将比例尺的大小填写至已知距离部分，并设置单位（像素、cm） 等等。)，然后点击“确定”。再次进入“分析”部分，点击“测量”。这将首先显示比例尺在所选单位下的尺寸。点击划痕的一端，并拖动至划痕的另一端。记录每个时间点（0 h 和 24 h）的数值。将这些数值代入上述公式，计算划痕闭合率。

5. 癌细胞与牙髓干细胞通过间接接触诱导的细胞迁移

  1. 将 3 × 104 个 DPSCs 接种至具有 0.4 μm 孔径的 24 孔板小室中，在 37 °C、湿润培养箱中培养过夜。
  2. 将 PC-3 细胞以 5 × 104 的细胞密度接种至 24 孔板中，在 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养过夜。
  3. 用无菌的 200 μL 枪头划线刮伤 PC-3 细胞层，更换新鲜培养基，并将携带 DPSCs 的小室置于 PC-3 细胞上方。
  4. 在倒置显微镜下观察细胞，并在不同时间点（0 和 24 h）拍照，以分析细胞迁移情况。

6. 共培养实验与流式细胞术分析

  1. 分别使用 PKH67（绿色）和 PKH26（红色）荧光细胞连接染料对 PC-3 细胞和 DPSCs 进行标记26。
  2. 分别对 PC-3 细胞和 DPSCs 进行胰蛋白酶消化。从 T-75 组织培养瓶中移除培养基，用 2 mL PBS 洗涤，并加入 2 mL 胰蛋白酶。在 37 °C、含加湿空气和 5% CO2 的培养箱中孵育 2 分钟。随后加入 2 mL 完全 DMEM 培养基，再孵育 2 分钟以抑制胰蛋白酶活性。
  3. 以 300 × g 离心 5 分钟，弃上清液，并将细胞沉淀重悬于试剂盒提供的稀释剂 C 缓冲液中配制的染料溶液中（参见 材料表）。
  4. 将细胞在染料溶液中孵育 10 分钟，然后加入 100 µL FBS 终止染色反应。以 300 × g 离心 5 分钟，弃上清液，并用完全生长培养基洗涤细胞，随后进行共培养。
  5. 将标记后的细胞以 1:1 比例（DPSCs:PC3）接种至 6 孔板中（每孔 5 × 104 个细胞）。在完全 DMEM 培养基中维持共培养细胞的生长。
  6. 在孵育 24 小时或 48 小时后，以 300 × g 离心 5 分钟收集细胞，并用 PBS 洗涤。
  7. 将细胞重悬于 5 mL 圆底流式细胞仪管中的 300 µL 荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液中。在样品分析前涡旋振荡，以充分分散细胞聚集体。
  8. 使用 100 µm 喷嘴，鞘液压力设为 45 psi。
    注意：过高的流速可能会降低荧光检测的灵敏度。
  9. 使用未染色对照细胞和单色标记细胞，按照前述方法调整合适的前向散射和侧向散射激光电压，并进行补偿设置27。
    注意：应设置门控以选择活细胞，排除细胞碎片、死细胞或细胞聚集体。
  10. 收集 10,000 个事件（建议收集 100,000 个事件），通过设置 FL-1（绿色）和 FL-2（红色）通道，确定绿色 DPSCs 和红色 PC-3 细胞的阳性百分比。

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结果

图1 描述了在培养条件下DPSCs的间充质干细胞（MSC）的一般特征。DPSCs在接种后呈现成纤维细胞样细胞形态（图1B）。间充质干细胞表面抗原（CD29、CD73、CD90、CD105 和 CD166）高表达，而造血细胞标志物（CD34、CD45 和 CD14）为阴性（图1C). 在应用成骨、成软骨和成脂诱导剂后，观察到牙髓干细胞（DPSCs）培养物在形态学和分子水平上发生与成骨、成软骨及成脂分化相关的改变 (图1D).

为了确定牙髓干细胞（DPSCs）分泌分子对前列腺癌细胞增殖和迁移的活性，我们应用了从培养的牙源性干细胞中收集的条件培养基（CM），并分析了癌细胞的增殖和迁移行为。...

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讨论

间充质干细胞对肿瘤微环境的贡献受多种相互作用调控，包括杂交细胞的形成 通过 细胞融合、细胞内吞作用或干细胞与癌细胞之间的细胞因子和趋化因子活性28结构组织、细胞间相互作用以及分泌因子决定了癌细胞在肿瘤促进、进展及向周围组织转移过程中的行为。恰当 离体 研究癌症进展和转移过程中细胞间通讯机制，需要利用模型系统来探究定居细胞群体间相互作用的机理。

我们利用牙髓干细胞（DPSCs）建立了前列腺癌细胞与牙髓干细胞相互作用的模型系统。这类成体干细胞的优势在于组织来源易于获取且分离步骤简便。然而，本实验方案的局限性在于仅使用了DPSCs，而未与已知的其他成体干细胞类型进行比较。目前的共培养方法可分为直接和间接两种技术，包括可溶性分泌分子介导的旁分泌信号传导，以及不同细胞群体在同一环境中的直接共培养29,30,31。我们使用经过...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由叶迪泰佩大学资助。本文中使用的所有数据和图表此前均已发表34。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMInvitrogen11885084用于细胞培养
FBSInvitrogen16000044用于细胞培养
PSALonza17-745E用于细胞培养
胰蛋白酶（Trypsin）Invitrogen25200056用于细胞解离
PBSInvitrogen10010023用于洗涤
地塞米松（Dexamethasone）SigmaD4902成脂分化培养基组分
β-甘油磷酸（β-Glycerophosphate）SigmaG9422成骨分化培养基组分
抗坏血酸（Ascorbic acid）SigmaA4544成骨和成软骨分化培养基组分
胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS −G）Invitrogen41400045成软骨分化培养基组分
TGF-βSigmaSRP3171成软骨分化培养基组分
胰岛素（Insulin）SigmaI6634成脂分化培养基组分
异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）SigmaI7018成脂分化培养基组分
吲哚美辛（Indomethacin）SigmaI7378成脂分化培养基组分
MTS试剂PromegaG3582细胞活力分析
TUNEL检测Sigma11684795910凋亡分析
24孔板小室（inserts）Corning3396用于跨孔迁移实验
PKH67SigmaPKH67GL用于共培养细胞染色
PKH26SigmaPKH26GL用于共培养细胞染色
多聚甲醛（Paraformaldehyde）SigmaP6148用于细胞固定
von Kossa染色试剂盒BioOptica04-170801.A用于细胞染色（分化检测）
阿利新蓝（Alcian blue）SigmaA2899用于细胞染色（分化检测）

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从牙髓组织中分离间充质干细胞并与癌细胞共培养以研究其相互作用
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