我们提供了基于直接和间接共培养方法评估牙髓来源间充质干细胞与前列腺癌细胞相互作用的实验方案。使用条件培养基和Transwell小室膜适用于分析间接的旁分泌作用。将不同染色的细胞共同接种是研究直接细胞间相互作用的合适模型。
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摘要
摘要
癌症作为一种多步骤、复杂的疾病，不仅受到单个细胞增殖和生长的调控，还受到肿瘤微环境及细胞间相互作用的控制。识别癌症细胞与干细胞之间的相互作用，包括细胞外环境的变化、物理性接触以及分泌因子等，可能有助于发现新的治疗策略。我们结合已知的共培养技术，建立了一种用于研究间充质干细胞（MSCs）与癌细胞相互作用的模型系统。在本研究中，采用直接和间接共培养技术，考察了牙髓干细胞（DPSCs）与PC-3前列腺癌细胞之间的相互作用。利用来自DPSCs的条件培养基（CM）以及孔径为0.4 µm的trans-well小室膜，研究其旁分泌效应。通过将不同类型细胞共同培养，以研究直接的细胞-细胞相互作用。结果表明，条件培养基可促进前列腺癌细胞的增殖，并减少其凋亡。无论是条件培养基还是trans-well系统，均可增强PC-3细胞的迁移能力。使用不同膜染料标记的细胞被接种至同一培养容器中，在直接共培养条件下，DPSCs与PC-3细胞共同形成了自组织结构。总体而言，研究结果表明，共培养技术可作为研究癌症细胞与间充质干细胞相互作用的有效模型系统。
引言
间充质干细胞（MSCs），具有 具有分化潜能并可参与骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱和脂肪等间充质组织再生的细胞，已从成人机体几乎所有的组织中分离获得1,2除了在慢性炎症或损伤情况下通过产生常驻细胞以维持组织稳态外，它们还分泌关键的细胞因子和生长因子，以协调血管生成、免疫系统功能及组织重塑。3间充质干细胞与肿瘤组织的相互作用尚不明确，但越来越多的证据表明，间充质干细胞可能促进肿瘤的发生、发展及转移4.
间充质干细胞向损伤或慢性炎症区域的归巢能力使其成为基于干细胞治疗的宝贵候选者。然而，癌组织， "永不愈合的伤口"，也会释放炎症性细胞因子、促血管生成分子以及重要的生长因子，从而将间充质干细胞（MSCs）募集至肿瘤发生区域5尽管有关间充质干细胞抑制肿瘤生长的报道较为有限6,7，其促进癌症进展和转移的作用已有大量报道8MSCs 通过多种方式直接或间接影响肿瘤发生，包括抑制免疫细胞、分泌支持癌细胞增殖和迁移的生长因子/细胞因子、增强血管生成活性....
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方案
在获得机构伦理委员会批准后，已取得患者的书面知情同意。
1. 牙髓干细胞的分离与培养
- 在拔除后8小时内，将从17至20岁青少年中获取的智齿转移至含有完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）[低糖DMEM培养基，添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素/两性霉素（PSA）溶液]的15 mL离心管中。转移过程中保持组织材料低温（4 °C），以避免潜在的细胞死亡。
- 使用无菌镊子小心地从牙齿中心取出牙髓组织，将牙髓组织置于盛有冷的完全DMEM培养基的10 cm组织培养皿中，并用手术刀将其切成小块（2–3 mm）。
注意：所有实验操作均应在超净工作台内的无菌条件下进行。该非酶解技术此前已有应用21,22,23。 - 将小块牙髓组织放入经组织培养处理的6孔板中，并加入200 µL完全DMEM培养基，以覆盖每一块小组织。
- 将组织培养孔板置于37 °C、加湿空气环境（80%湿度）及5% CO2条件下孵育2小时，以促进组织贴壁。
注意：通过控制培养基蒸发，此步骤可延长至3–4小时。 - 向各孔中加入适量（2–2.5 mL）的完全DMEM培养基，并在37 °C、加湿空....
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结果
图1 描述了在培养条件下DPSCs的间充质干细胞（MSC）的一般特征。DPSCs在接种后呈现成纤维细胞样细胞形态（图1B）。间充质干细胞表面抗原（CD29、CD73、CD90、CD105 和 CD166）高表达，而造血细胞标志物（CD34、CD45 和 CD14）为阴性（图1C). 在应用成骨、成软骨和成脂诱导剂后，观察到牙髓干细胞（DPSCs）培养物在形态学和分子水平上发生与成骨、成软骨及成脂分化相关的改变 (图1D).
为了确定牙髓干细胞（DPSCs）分泌分子对前列腺癌细胞增殖和迁移的活性，我们应用了从培养的牙源性干细胞中收集的条件培养基（CM），并分析了癌细胞的增殖和迁移行为。.......
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讨论
间充质干细胞对肿瘤微环境的贡献受多种相互作用调控，包括杂交细胞的形成 通过 细胞融合、细胞内吞作用或干细胞与癌细胞之间的细胞因子和趋化因子活性28结构组织、细胞间相互作用以及分泌因子决定了癌细胞在肿瘤促进、进展及向周围组织转移过程中的行为。恰当 离体 研究癌症进展和转移过程中细胞间通讯机制，需要利用模型系统来探究定居细胞群体间相互作用的机理。
我们利用牙髓干细胞（DPSCs）建立了前列腺癌细胞与牙髓干细胞相互作用的模型系统。这类成体干细胞的优势在于组织来源易于获取且分离步骤简便。然而，本实验方案的局限性在于仅使用了DPSCs，而未与已知的其他成体干细胞类型进行比较。目前的共培养方法可分为直接和间接两种技术，包括可溶性分泌分子介导的旁分泌信号传导，以及不同细胞群体在同一环境中的直接共培养29,30,31。我们使用经过.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由叶迪泰佩大学资助。本文中使用的所有数据和图表此前均已发表34。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 11885084 | 用于细胞培养 |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | 用于细胞培养 |
| PSA | Lonza | 17-745E | 用于细胞培养 |
| 胰蛋白酶（Trypsin） | Invitrogen | 25200056 | 用于细胞解离 |
| PBS | Invitrogen | 10010023 | 用于洗涤 |
| 地塞米松（Dexamethasone） | Sigma | D4902 | 成脂分化培养基组分 |
| β-甘油磷酸（β-Glycerophosphate） | Sigma | G9422 | 成骨分化培养基组分 |
| 抗坏血酸（Ascorbic acid） | Sigma | A4544 | 成骨和成软骨分化培养基组分 |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS −G） | Invitrogen | 41400045 | 成软骨分化培养基组分 |
| TGF-β | Sigma | SRP3171 | 成软骨分化培养基组分 |
| 胰岛素（Insulin） | Sigma | I6634 | 成脂分化培养基组分 |
| 异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX） | Sigma | I7018 | 成脂分化培养基组分 |
| 吲哚美辛（Indomethacin） | Sigma | I7378 | 成脂分化培养基组分 |
| MTS试剂 | Promega | G3582 | 细胞活力分析 |
| TUNEL检测 | Sigma | 11684795910 | 凋亡分析 |
| 24孔板小室（inserts） | Corning | 3396 | 用于跨孔迁移实验 |
| PKH67 | Sigma | PKH67GL | 用于共培养细胞染色 |
| PKH26 | Sigma | PKH26GL | 用于共培养细胞染色 |
| 多聚甲醛（Paraformaldehyde） | Sigma | P6148 | 用于细胞固定 |
| von Kossa染色试剂盒 | BioOptica | 04-170801.A | 用于细胞染色（分化检测） |
| 阿利新蓝（Alcian blue） | Sigma | A2899 | 用于细胞染色（分化检测） |
参考文献
- Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Demirci, S., Doğan, A., Şahin, F. Dental Stem Cells. , Springer. 109-12....
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重印与许可
