本方案描述了一种从尿路感染的小鼠模型中分离单个受感染膀胱上皮细胞的简单方法。
本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种从实验性尿路感染的小鼠体内分离单个胞内细菌群落的方法。该方案大致可分为三个部分：感染、膀胱上皮细胞采集以及口控微吸管技术分离单个被感染的上皮细胞。所分离的上皮细胞含有存活的细菌，且几乎不含污染性的胞外细菌，因此非常适合后续的单细胞分析。从开始感染到获得单个胞内细菌群落所需时间约为8小时。该方案成本低廉，使用材料广泛易得，我们预计该方法也可应用于其他感染模型，用于从细胞混合物中分离单个被感染细胞，即使这些被感染细胞非常稀少。然而，由于口控微吸管操作可能存在潜在风险，该方法不适用于高致病性病原体。
引言
尿路感染（UTI）是最常见的细菌感染之一。据估计，40%至50%的女性在一生中至少会经历一次尿路感染1。尿路感染的主要致病菌之一是尿路致病性E. coli（UPEC），其在非复杂性尿路感染中占比超过70%2。此外，约四分之一的尿路感染患者在经过适当的抗生素治疗后仍会出现复发性感染，且常由相同菌株引起3。尿路感染的高发病率给医疗系统带来了巨大负担，仅在美国每年花费就超过20亿美元4。此外，使用抗生素治疗尿路感染还导致抗生素耐药率不断上升，已成为重要的公共卫生问题5。
因此，人们已投入大量努力来研究尿路致病性大肠杆菌（UPEC）感染尿路的机制，以及其引发反复感染的能力6,7,8。特别是，已采用小鼠感染模型来研究细菌和宿主中促进尿路感染（UTI）的特征8。该小鼠模型的优势在于可直接应用于未经修饰的、从人类患者中分离的临床菌株。该模型还帮助发现了若干对尿路感染建立至关重要的、可能成为药物靶点的细菌通路，例如I型菌毛9和铁获取系统10。
与在研究尿路感染（UTI）早期事件方面取得的这些进展相比，目前对复发性尿路感染潜在机制的认识仍然不足11。一种假说是，尿路致病性大肠杆菌（UPEC）通过在膀胱上皮细胞内形成胞内细菌群落（IBCs），从而逃避免疫和抗生素治疗，导致膀胱内反复感染。IBCs已在小鼠感染模型和人类尿路感染患者中被发现12,13。在儿童尿路感染患者的尿液样本中检测到IBCs，与较高的复发率相关14,15。然而，由于IBCs数量稀少，分离IBCs并研究其中的细菌在技术上具有挑战性；据估计，一只感染小鼠的膀胱中通常仅有10–100个IBCs16。此外，膀胱上皮细胞相对较大（50–120 µm）17，而常规荧光辅助细胞分选（FACS）喷嘴的直径通常设计为70 µm或100 µm，因此这类大细胞在FACS前通常需通过过滤去除，以避免堵塞流路系统，这也进一步增加了对IBCs研究的难度。
我们实验室近期描述了一种通用且经济的方法，用于从混合细胞（如膀胱刮取的上皮细胞）中分离出稀有感染细胞18。为了有效分离胞内细菌群落（IBC），我们采用了传统的口吸移液技术。口吸微量移液是一种长期用于单细胞和胚胎显微操作的技术，以便进行后续分析19,20,21,22,23,24,25。传统口吸移液在处理较大液体体积（以毫升计）时，常导致实验室相关事故，因此该技术在传统胚胎学和单细胞操作以外的研究领域已被广泛弃用。我们的实验方案借鉴了该技术的单细胞版本19,20，通过在研究人员与样品之间设置较大的空气缓冲层（>2 mL），而转移的液体体积极小（<1 µL），从而显著降低风险。该方法还利用了口吸微量移液所提供的精细操控能力，使得转移的周围溶液最终体积极低，从而获得高纯度的分离细胞。该技术所用材料成本低廉（<$50），因此在所有实验室中均具备实施可行性。
本可视化方案介绍了我们的胞内细菌群落（IBC）分离技术，可为其他希望重复该技术的研究人员提供参考。研究人员需要使用荧光解剖显微镜（或类似设备），以便在活体成像过程中观察单个上皮细胞及荧光标记的细菌，显微镜需具备开放且易于操作的成像平台，以进行微量移液操作（显微镜的具体型号详见材料表，但其他等效型号亦可使用）。尽管本方案主要聚焦于尿路感染（UTI）的小鼠模型中的IBC，但类似方法也应适用于从其他感染模型的细胞悬液中分离感染细胞。
方案
本文所述所有涉及动物操作的方法均已获得新加坡科技研究局基因组研究所和生物资源中心机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 小鼠感染
- 玻璃毛细管的制备
- 点燃一个明火源（本生灯或酒精灯）。
- 用双手分别牢固地夹住玻璃毛细管的两端，均匀加热管体中部，直至玻璃变软。沿毛细管轴线轻轻前后旋转，以确保玻璃受热均匀。
- 将玻璃毛细管从热源移开，并立即双手向相反方向拉伸，同时保持对管体两端的握持。拉制后的毛细管理想长度应比未拉制前长3–5 cm，以确保其内径适合分离单个膀胱上皮细胞。
注意：毛细管在一段时间内仍处于极高温状态，因此需将其放置在耐热表面上静置数分钟冷却，再进行下一步操作。 - 检查玻璃毛细管中部是否已变细（图1A），且管内仍保持中空状态（图1B）。用于分离IBC时，内径为200–400 µm的毛细管可用。
- 用一只手握住拉制后毛细管的一端，另一只手持镊子，夹住毛细管最细处。确保镊子施加的力度足以牢固夹持毛细管而不致压碎。
- 用持镊子的手迅速扭转，使毛细管在最细处断裂，从而制成口吸式微移液毛细管。
注意：使用手指代替镊子也可接受，但必须采取充分措施防止玻璃碎片伤害。 - 重复步骤1.1.2–1.1.6至少4次以上，以制备足够数量的备用微移液毛细管，并提供多种直径以适应IBC的分离。若预计有多个感染组，每增加一个感染组需额外准备5根微移液毛细管。
注意：切勿忘记关闭明火。 - 将拉制好的毛细管放入100 mm培养皿中，并将培养皿暴露于紫外线下30分钟，以对毛细管进行灭菌。
- 紫外灭菌后盖上培养皿盖子，并将装有毛细管的培养皿于室温下保存。
- 感染前导管的准备
- 按照Hung等8和Conover等26所述方法，在感染前至少一天准备尿道导管。
- 荧光性尿路致病性E. coli菌液的制备
- 根据既定实验方案培养表达荧光蛋白的尿路致病性细菌菌株。
注意：菌株和荧光蛋白的选择主要取决于各实验室所拥有的显微镜设备和可用菌株。本示例中使用源自UTI89的菌株SLC-638，UTI89为一例复发性膀胱炎患者的临床分离株。该菌株携带质粒pSLC-77，可同时表达vsfGFP-9和卡那霉素抗性18。SLC-638在添加50 µg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37 °C静置培养。 - 用接种环将SLC-638菌株划线接种于含50 µg/mL卡那霉素的Luria Bertani（LB）琼脂平板上，于37 °C过夜培养。
- （可选）在解剖显微镜下观察平板，确认荧光标记表达后再挑选单菌落。
- 使用细菌接种环将选定的单菌落转移至含10 mL LB液体培养基（添加50 µg/mL卡那霉素）的125 mL锥形瓶中。于37 °C静置培养24小时。
- 从此锥形瓶中取10 µL菌液，接种至另一新锥形瓶（125 mL）中含10 mL LB液体培养基（添加50 µg/mL卡那霉素）中进行传代培养（1:1000稀释）。于37 °C静置培养24小时。
- 在5,000 × g、4 °C条件下离心5分钟，沉淀菌体。
- 弃去上清液，用预冷的PBS重悬菌体沉淀，调节OD600至0.5。
注意：尽管不同培养物之间存在差异，通常1 mL静置培养物可获得约4–5 mL OD600 = 0.5的菌液。每种菌株所需接种菌液的总体积可按如下方式计算：每只小鼠需50 µL，针头填充需50 µL，建议额外准备10–20%（至少50 µL）的菌液以补偿注射器内的死体积。 - 使用剩余的菌液混合物，按照Hung等8所述方法测定感染滴度。
注意：可通过将菌液混合物在4 °C保存数小时，延迟本步骤的执行。
- 根据既定实验方案培养表达荧光蛋白的尿路致病性细菌菌株。
- 小鼠尿路感染模型
- 按照Hung等8所述方法对小鼠进行感染，每种在1.3节中培养的荧光性大肠杆菌菌株设一个实验组。
注意：可参考Conover等26提供的图示辅助操作。 - 记录每只小鼠或每笼小鼠的细菌接种时间。
- 对整个实验组重复感染操作。
注意：同一实验组内可重复使用同一根感染导管。 - 对每个计划的实验组重复步骤1.4.1–1.4.3，确保为每个实验组准备新的导管和新的润滑凝胶。
注意：对于动物数量较多的实验，建议将动物分为每组五只，并错开感染时间，使各组感染间隔约30分钟至1小时。这将为后续步骤（第2和第3节）留出充足时间。
- 按照Hung等8所述方法对小鼠进行感染，每种在1.3节中培养的荧光性大肠杆菌菌株设一个实验组。
2. 获得细胞悬液的膀胱上皮细胞收获
- 小鼠膀胱的收获与翻转
- 准备三个50 mL锥形管，每管加入45 mL 70%乙醇，用于手术器械的消毒。
- 在步骤2.1.1准备的两个锥形管中，各放入一把剪刀和一把镊子；在第三个锥形管中放入两把镊子（其中一把最好较窄且尖端圆钝，用于膀胱翻转）。
注意： 第一个管中的器械将用于体表操作，第二个管中的器械用于膀胱收获，第三个管中的两把镊子则用于膀胱翻转。 - 感染后6小时，根据机构既定的IACUC规程对感染小鼠实施安乐死。
注意： 我们的IACUC规程要求在小鼠处于麻醉（异氟烷）状态下进行颈椎脱位处死。 - 将动物仰卧平放，并使用装有70%乙醇的喷雾瓶对其腹部区域进行消毒。
- 使用第一个锥形管中的镊子和手术剪（步骤2.1.2准备），在尿道口上方约1 cm处的皮肤上做一个小的横向切口。然后沿对角线方向向小鼠上肢延伸切口，形成一个贯穿小鼠腹前部的V形切口，以暴露腹膜内容物。在此过程中，确保剪刀不切破小鼠的肠管（图2A,B）。
- 更换为第二组器械（步骤2.1.2准备）。使用剪刀的刀刃或镊子的杆部，轻轻下压小鼠骨盆区域附近的脂肪垫。
注意： 此步骤可使膀胱向外突出，便于观察和收获。 - 用一把镊子夹住暴露的膀胱顶端（图2C）。
- 用镊子牢固夹住膀胱顶端的同时，使用手术剪将膀胱从动物体内剪下（切断尿道和输尿管）。暂不松开夹持膀胱的镊子。
- 将器械更换为第三个锥形管中的较窄圆头镊子（来自步骤2.1.2），将圆头镊子的一侧尖端插入膀胱开口处（即上一步骤中刚剪开的位置）（图2D）。待圆头镊子的尖端安全插入膀胱开口后，松开夹持膀胱顶端的镊子，并将其放回第二个锥形管中。
- 使用第三个锥形管中的第二把镊子，轻轻地将膀胱"翻转至内面朝外"，首先将膀胱口的外侧端从圆头镊子的一侧尖端拉开（图2D，箭头1），然后引导其绕过并翻过圆头镊子的另一侧尖端（图2D，箭头2）。
注意： 该操作类似于将一只袜子从一只脚脱下后翻过另一只脚。- 在翻转过程中，保持第一把圆头镊子几乎完全闭合。这样既能提供足够的活动空间以便将膀胱从圆头镊子的第一侧尖端拉出，又能使第二侧尖端靠近第一侧，便于膀胱顺利转移。此步骤的最终结果是膀胱被完全翻转，并位于第一把镊子第二侧尖端的顶端（图2E）。
- 使用第二把镊子，轻轻将翻转后的膀胱从镊子尖端剥离，放入1 mL冷PBS中。
注意： （可选）此时可对整个翻转后的感染膀胱进行成像，以观察胞内细菌团簇（IBCs）的存在频率和分布情况（如存在）。
- 对实验组中的每只小鼠膀胱重复步骤2.1.1–2.1.10（最多五只动物）。
- 膀胱上皮细胞刮取
- 使用两把干净的镊子，轻轻刮取翻转后膀胱的外表面（即其内部上皮细胞层）。随着刮取过程的进行，周围的PBS应逐渐变得浑浊，表明上皮细胞已释放到PBS溶液中。
- （可选）使用解剖显微镜目视确认膀胱刮取已将细胞释放至溶液中（图3A,B）。肉眼可见PBS变浑浊，在10倍放大下可观察到单个被刮下的膀胱上皮细胞。
- 对步骤2.1中收获的每只膀胱重复步骤2.2.1–2.2.2。
3. 胞内细菌群落（IBC）的分离：口吸移液法分离 IBC
注意：本节所述所有方法均已通过机构风险评估。口吸移液具有吸入所转移溶液的固有风险。由于本方案采用纳升级别的体积，该风险已大幅降低。我们建议所有使用者均应严格遵守本文及讨论部分列出的各项预防措施和操作提示。
- 将细胞刮入 PBS 后，设置口控微量移液装置（图 3C）。
- 将拉制好的玻璃毛细管较粗的一端（未拉细的一端）插入吸管管橡胶塞（白色端）中。
- 将 1 mL 移液枪头的细端插入吸管管另一端开口（红色端），确保紧密贴合。
- 将 2 mL 吸液移液管的细端插入 1 mL 移液枪头的开口宽端，再次确保紧密贴合。
注意： 此组装装置可使研究人员通过吸液移液管的宽口端进行口吸，从而在装置另一端毛细管的细端产生轻柔的负压吸力。 - 使用一个盛有新鲜去离子水的 100 mm 培养皿测试最终的口控微量移液装置。轻轻在吸液移液管的开口端施加吸力（类似于用吸管啜饮饮料），应能使毛细管内的液面上升，但不会导致去离子水溢入吸管管内。用一只手控制毛细管，另一只手调节培养皿的位置。
注意： 不同研究人员在口吸单个 IBC 时所需的吸力强度可能不同。建议初次尝试该技术的研究人员从弱吸力开始，若无液体进入毛细管，再缓慢增加吸力。吸力无需超过饮用时用吸管吸饮料的力度。如果在步骤 3.1.4 的测试中毛细管未能吸入液体，可能是毛细管或吸液管发生堵塞，需更换。进一步建议所有新研究人员先使用灭菌水练习控制口控移液装置中的吸力。此外，请注意通过研究人员的舌头来控制口控移液装置吸取液体的体积。舌头可精细调节施加的吸力强度，并可作为紧急停止机制。 - 成功吸入液体后，通过轻轻向吸液移液管的开口端吹气，测试从毛细管中排出液体的能力。确保在排液过程中不产生气泡，以防止在步骤 3.5 中污染 IBC。
注意： 与吸力类似，研究人员施加正压将 IBC 排入离心管的力度因人而异。建议初次使用本方案的研究人员在实际感染前数天练习步骤 3.1。练习口控微量移液的一种建议方法是使用口控微量移液装置，练习转移少量灭菌水（加入几滴食用染料以增强可见性）。
- 将刮取的细胞悬液置于解剖显微镜下，识别 IBC 为较大的荧光聚集体（图 3A,B）。理想的放大倍数范围为 20–40 倍。将玻璃毛细管的细端浸入新鲜 PBS 管中 1 秒，以减少毛细作用导致的非预期液体吸入。
- 通过显微镜观察，识别目标 IBC，并缓慢将毛细管开口端移向 IBC。使用玻璃毛细管的细端扫开每个 IBC 附近的多余细胞，防止吸入两个或更多细胞，或打散较大的细胞聚集体。
- 在显微镜下观察的同时，在口控微量移液装置的远端（吸液移液管）施加极小的吸力，引导 IBC 进入玻璃毛细管。
- 吸取 IBC 后，将毛细管移至一个空的 1.5 mL 离心管中，并施加轻微正压，将液滴和 IBC 排入离心管（图 3D）。
- 在处理下一个膀胱前，根据需要对当前膀胱中的多个 IBC 重复步骤 3.3–3.6。频繁更换吸液移液管和毛细管，以防止唾液积聚。
注意： 当操作具有感染性（或临床）菌株时，需持续监控毛细管内液体水平。切勿让被移取的液体从毛细管边缘溢出进入吸管管内。一旦发生溢出，应立即更换吸管管，并丢弃之前的装置。 - 对所有收获的膀胱重复步骤 3.2–3.6，或直至实验组获得足够数量的生物样本。
- （可选）重复步骤 3.6 和 3.7，直至所有实验组（或小鼠）均被处死，并从每组中收获足够数量的生物样本。
结果
除了通过解剖显微镜观察确认收集管中存在单个分离的胞内细菌群落（IBC）（图3D）外，还可通过共聚焦显微镜进一步验证所分离IBC的纯度。如图4A所示，分离的细胞应同时呈现E. coli和uroplakin的染色信号，且其大小符合IBC的预期范围（50–120 µm）17。此外，周围液体中未见E. coli染色信号。根据我们的数据，采用该技术分离的细胞中超过90%为IBC18。分离后，可通过菌落形成单位（CFU）计数（图4B）或基因组当量的定量聚合酶链式反应（qPCR）（图4C）来确认单个IBC内细菌的存在及其活性。图4C还表明，采用相同方案分离的未感染上皮细胞中未检测到可量化的细菌。基于这些数据，我们估计在小鼠尿路感染模型中，单个IBC内的CFU数量范围为102–103。单个IBC分离的主要目标之一是进行后续分析，例如RNA测序。为验证本分离方法能够从IBC中的细菌获取可用于分析的RNA，我们对多个单独分离及混合的IBC进行了三个基因（16S、cyoB和frdA）的定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）定量分析（图4D）。图4中展示的所有数据均已获Duraiswamy等18许可转载。IBC分离方案的总体示意图见图5，该图引自Duraiswamy等18。
图 1：手工拉制的毛细管保持狭窄开口。（A）在黑色背景上展示手工拉制的毛细管样本以增强对比度。从下至上依次为：未拉制的毛细管、未充分拉制的毛细管、可用于单个膀胱上皮细胞采集的毛细管，以及因过度拉制而过细并断裂为两段的毛细管。图像底部放置了一把15 cm的标尺作为比例参考。图中红箭头指示了折断并获取可用毛细管部分的估计位置。（B）使用解剖显微镜拍摄的图像，证实了拉制后毛细管的中空内径（下方）。上方放置了一根未拉制的毛细管，用于展示两种毛细管的相对尺寸差异。比例尺 = 4.0 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：解剖小鼠以获取膀胱上皮细胞。（A）一只小鼠的图像，添加了白色线条以指示切口的预估位置和角度，用于暴露小鼠腹膜腔和膀胱。（B）切开后暴露的小鼠腹膜腔图像。（C）暴露的膀胱（红色箭头）从脂肪垫之间突出的图像。（D）小鼠膀胱图像，镊子尖端插入膀胱腔内，箭头指示使膀胱翻转所需的动作方向。首先将膀胱轻微向外拉出，然后绕至镊子第一根杆上并脱离。这两个动作的方向如白色箭头编号 1 和 2 所示。（E）翻转后的膀胱完全套在镊子第二根杆上的最终位置图像。在 D 和 E 两幅图中，镊子的杆均以红色箭头和文字标注。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：从膀胱细胞中收获IBC。（A）感染后倒置的膀胱置于冷PBS溶液中，准备刮取细胞。（B）显微镜下观察到的刮取后的膀胱细胞图像。在两幅图像中，IBC均可识别为较大的绿色荧光聚集体（见红色箭头所示）。（C）完成的口控微量移液装置图像。右侧编号箭头分别标示了吸液移液器、移液器尖端、吸管管路和拉制的毛细管。（D）1.5 mL收集管中单个分离的IBC图像（红色轮廓线标出）。比例尺（如标注所示）在A、B和D图中以白色线条表示。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：分离的胞内细菌群落（IBC）纯度高，可用于后续分析。 本图经 Duraiswamy 等人18 许可修改。(A) 两个分离的GFP阳性细胞的图像，经抗尿斑蛋白和抗E. coli 抗体染色。第一个细胞（IBC 1）左侧显示各通道的低倍镜图像，右侧为高倍镜下的合并图像。第二个细胞（IBC 2）以高倍镜显示合并图像及各单独通道图像。比例尺如图中标注。DNA用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，并在蓝色通道中显示。抗E. coli 使用与异硫氰酸荧光素（FITC）偶联的二抗染色，并在绿色通道中显示。抗尿斑蛋白使用与四甲基罗丹明异硫氰酸（TRITC）偶联的二抗染色，并在红色通道中显示。(B) 从分离的IBC中获得的细菌菌落形成单位（CFU）。IBC样本立即处理，或在0.1% Triton-X中孵育10分钟或30分钟。图中显示来自n = 3次独立实验的单个IBC的合并CFU计数。检测下限 = 0.7 log10 CFU/IBC。位于检测下限的红点表示在平板培养中未回收到菌落的样本。所有含IBC的样本之间无显著差异（p > 0.05，Mann-Whitney检验）；未感染的上皮细胞与IBC（10分钟）数据之间差异显著（p < 0.001，Mann-Whitney检验）。(C) 经0.1% Triton-X孵育10分钟后，单个IBC及未感染上皮细胞中细菌的qPCR定量（*，p < 0.0001，Mann-Whitney检验，n = 4）。检测下限 = 1.18 log10 细菌基因组当量/IBC。红点表示在B图中滴定未回收到菌落的样本。(D) 对不同数量的单个分离及合并IBC中16S rRNA、cyoB 和 frdA 基因的定量（n = 1次实验；每个数据点表示3个技术重复的平均值）。NC = 无DNA阴性对照。 请点击此处查看本图的放大版本。
图 5：通过口控微移液管从感染小鼠膀胱中分离 IBC 的示意图及其相关照片。该图引自 Duraiswamy 等人18。(A) 采集的完整膀胱；(B) 翻转后的完整膀胱，暴露出表达 GFP 的 IBC；(C) 刮取膀胱边缘的局部放大图，显示悬浮在邻近缓冲液中的单个 IBC；(D) 通过移液将单个分离的 IBC 转移至离心管中。图 B 中的红色箭头指示膀胱腔面 GFP 阳性的 IBC 实例；图 C 中的红色虚线表示翻转膀胱的右边界（标记为“BL”）；图 C 中的红色箭头指示从膀胱表面刮下的明显单个 GFP 阳性上皮细胞。图 D 中的白色虚线表示含有单个分离 IBC 的口控微移液管吸取的亚微升级液滴，该 IBC 由白色箭头指示。比例尺 = 2 mm。 请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
我们所描述的方案可用于从尿路感染（UTI）的小鼠模型中分离单个细胞内细菌群落（IBC）。该方案能够分离出含有存活胞内细菌的IBC，并可通过菌落形成单位（CFU）培养验证其活性。该方法获得的胞内细菌几乎不受胞外细菌污染，从而可进一步对IBC中的细菌和宿主细胞进行表征（图4C）。我们还证明，单个IBC中的细菌可用于后续实验分析，例如定量PCR（qPCR）（图4C），表明本技术可用于处理IBC以进行其他体外分析。通过汇集仅来自5个IBC的细菌，我们进一步实现了对三个细菌基因的定量逆转录PCR（qRT-PCR）分析，表明可以从分离得到的IBC中的细菌提取高质量的RNA（图4D）。综上所述，我们的数据表明，利用该分离技术对单个IBC进行全基因组RNA分析（如RNA测序）是可行的。
在本方案中，我们重点关注感染 UTI89 的 C57BL/6 小鼠膀胱中 IBC 数量达到峰值的 6 h 时间点。27此外，我们还采用静态细菌培养系统以增强UTI89中Ⅰ型菌毛的表达水平。Ⅰ型菌毛的表达对于 E. coli 附着并感染膀胱上皮细胞28然而，这种表达受到严格调控29 已知环境线索会改变它30为了保持一致的感染表型并获得足够数量的包涵体（IBCs），我们建议采用2 × 24小时静态细菌培养（略作修改自Hung等）。8以及在使用先前已测试的样本时的6小时感染时间点 E. coli 菌株如 NU14 和 UTI8928,29然而，这些变量可能需要根据其他尿路感染菌株或其他小鼠品系进行调整，以从每次感染中获得理想的 IBC 数量。
尽管Hung等人的方案8仅使用雌性小鼠，但已有其他建立雄性小鼠尿路感染的成熟方案被报道31。在此模型中，雄性小鼠的膀胱炎同样遵循IBC途径。由于雄性和雌性小鼠的膀胱大小相似，我们预计本研究的IBC分离方案也可用于感染的雄性小鼠。
本方案所采用的技术相对简单，可确保其在大多数实验室中得以应用。该方案中的一个关键步骤是通过拉制玻璃毛细管来制备用于选择目标细胞类型的微毛细管。此步骤允许灵活调节所制备微毛细管的直径，因此该方法可拓展应用于多种不同的目标细胞类型。然而，由于制备这些毛细管过程中存在固有的变异性，必须谨慎操作以确保最终直径处于可用范围内。若毛细管过窄，则无法成功捕获目标细胞；若过宽，则可能在一次操作中同时获取多个细胞。此外，在拉制毛细管过程中使用明火存在烧伤和火灾的固有风险，因此操作者应采取预防措施以避免此类事件发生。为了降低制备过程中的变异性和明火风险，研究人员可采用传统的微电极拉制仪（如用于电生理实验的仪器，例如 Narishige 公司的 PC-100 型）。由于此类仪器利用重力或机器人平台进行毛细管拉制，因此可根据感染模型的具体需求进行优化调整。然而，鉴于市面上微电极拉制仪种类繁多，研究人员仍需通过一定的试错过程，以确定适用于本方案的合适最终毛细管直径。
本方案利用表达荧光标签的细菌来直观识别胞内细菌群落（IBC）。因此，该技术受限于研究人员对感染性生物体进行遗传改造的能力。针对尿路致病性大肠杆菌（UPEC），已成功将CFT073和NU14等能够形成IBC的菌株转化含GFP表达质粒32,33,34，这些菌株因而可用于相同的实验方案。根据小鼠膀胱表面积（70 mm2）35、单个上皮细胞的长度（50–120 µm）17以及单个膀胱中IBC的发生频率16，IBC发生率的保守估计约为每1,000个细胞中出现1个（即0.1%）。这一估算凸显了本细胞分离方案在靶向稀有事件方面的实用性。通过本方案实现的细胞筛选精确性，以及可拉制出多种直径的毛细管，表明该方法也可用于从其他体内和体外感染模型中分离胞内细菌。事实上，我们已成功应用该技术分离被感染的培养膀胱上皮细胞（数据未显示）。
该方案中技术上较难的步骤之一是将膀胱翻转以暴露上皮细胞，以便进行刮取。我们发现也可以在膀胱上做一切口，将其展开后进行刮取。然而，在切开膀胱的过程中必须格外小心，以尽量减少对膀胱上皮细胞的损伤；理想情况下应仅使用一次切口来将膀胱展开。此外，切口应在冷 PBS 中进行，以防止在此过程中细胞或膀胱组织意外丢失。
本方案中采用口吸移液法处理单个细菌细胞（IBC），可更精确地控制细胞筛选过程，并减少随细胞转移的溶液最终体积。由于转移的液体体积在纳升至微升级范围内，配合精细的操作以及使溶液与研究人员口腔保持较大距离，可最大程度保障操作者的安全。相比之下，我们使用现代微量移液器的经验表明，该方法容易将更多周围液体及其他细胞一并转移，可能导致胞外管腔细菌的污染。其他实验室也已报道，口吸移液法在单细胞分离效果上优于其他单细胞分离方法22,23,24。除单细胞分离外，口吸移液法甚至已被用于神经元的单细胞电穿孔实验25，进一步证明了该技术的实用性以及训练有素的研究人员所能达到的极高操作精度。然而，安全始终是首要考虑因素，我们建议根据所使用的病原体类型采取潜在的额外防护措施：（i）增加操作者与生物材料之间的空气缓冲段，例如使用更大容量的吸管（如5 mL）；或（ii）在吸液管中加入物理过滤材料（如脱脂棉），以提供额外的屏障保护。
当风险评估结果表明口吸移液仍存在过高风险时，可采用市面上可购得的机器人装置（例如用于纳米注射的装置），并结合本技术的其他部分，以提供一种更安全的方法，从混合细胞群体中分离感染细胞。需要注意的是，我们使用机器人显微操作仪的经验表明，与口吸移液相比，感染性细菌集落（IBC）的分离效率有所降低，这是因为膀胱上皮细胞在实验过程中大小差异较大，使得机器人操作者难以准确判断拾取单个IBC所需的力度。尽管如此，对于处理高致病性病原体的研究人员而言，该方法仍是一种可行但成本较高的选择。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了新加坡国家研究基金会（总理办公室）研究学者计划（NRF奖编号：NRF-RF2010-10）、新加坡卫生部国家医学研究委员会（NMRC/CIRG/1358/2013）以及新加坡基因组研究所（GIS）/科学、技术与研究局（A*STAR）的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 离心管 | 用于静态细菌培养与OD测定 | ||
| 100% 乙醇 | 用于酒精灯 | ||
| 15 mL 一次性离心管 | 用于静态细菌培养及OD测定 | ||
| 1 mL 结核菌素注射器 | BD 生物科学 | 302100 | |
| 3% 细菌琼脂 | 用于静态细菌培养及OD测定 | ||
| 70% 乙醇 | 用于静态细菌培养及OD测定 | ||
| Aesculap 解剖镊 | Braun/Kruuse | BD222R | 用于小鼠的初步解剖（皮肤、筋膜） |
| 酒精灯 | Wheaton | 237070 | |
| 移液管 | BD 生物科学 | 357558 | |
| 吸液管 | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| 细菌环 | 用于静态细菌培养及OD测定 | ||
| 台式离心机 | Eppendorf | 5424 | 适用于1.5 ml离心管的任何离心机 |
| 锥形瓶 | 用于静态细菌培养及OD测定 | ||
| 显微镜用数码相机 | 奥林巴斯 | DP71 | 用于IBC的图像采集和收获。任何其他带有GFP通道的荧光显微镜均可满足需求 |
| 玻璃毛细管 | Kimax | 6148K07 | |
| 虹膜剪 STR SS 110毫米 | 布劳恩 | BC110R | |
| 异氟烷（Isothesia） | Henry Schein 动物健康 | 29405 | |
| 硫酸卡那霉素 | Calbiochem | 420311 | 用于静态细菌培养及OD测定 |
| LB肉汤（Miller） | Thermo/Gibco | 10855021 | 用于静态细菌培养及OD测定 |
| 显微镜光源装置 | 奥林巴斯 | LG-PS2 | 用于IBC的图像采集和收获。任何配备GFP通道的荧光显微镜均可满足需求 |
| 润滑剂 | KY | 任何类似的商用医用润滑剂均可使用 | |
| 宏观荧光显微镜 | 奥林巴斯 | MVX10 | 用于IBC的图像采集和收获。任何其他带有GFP通道的荧光显微镜均可满足需求 |
| 微量移液器 + 微量移液器吸头 | 用于静态细菌培养及OD测定 | ||
| PBS 1× | 用于静态细菌培养及OD测定 | ||
| 移液器控制器 + 移液管 | 用于静态细菌培养与OD测定 | ||
| 聚乙烯管 | BD Intramedic | 427401 | |
| Precision Glide 针头 30 G | BD 生物科学 | 305107 | 可能属于新的目录编号（305106） |
| 弯头镊子 | 布劳恩 | BD312R | |
| 喷雾瓶（用于乙醇） | 用于静态细菌培养及OD测定 | ||
| 方形比色皿 | Elkay | 127-1010-400 | 用于静态细菌培养及OD测定 |
| SterilGARD III Advance 安全柜 | 贝克 | SG403 | 配备紫外线照射器的任何生物安全柜 |
| Sterilin 90毫米标准培养皿 | 赛默飞世尔科技 | 101VR20 | 任意无菌培养皿 |
| Stevens 血管和肌腱剪，弯型，精细，110 毫米 | 布劳恩 | OK366R | 推荐用于膀胱采集 |
| 手术剪 STR S/B 105MM | 布劳恩 | BC320R | |
| 台式离心机 | Eppendorf | 5810R | 适用于15 ml离心管的任何冷藏离心机 |
| WPA C08000 细胞密度计 | Biowave（Biochrom） | 80-3000-45 | 用于静态细菌培养及OD测定 |
参考文献
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