使用鲎变形细胞裂解物（LAL）检测法检测纳米制剂中的内毒素

摘要

在工程纳米材料中检测内毒素是纳米医学领域面临的主要挑战之一。本文介绍了一项案例研究，描述了由三种不同鲎试剂（LAL）方法组成的框架，用于评估纳米颗粒中潜在的内毒素污染。

摘要

在药品中，革兰氏阴性菌细胞壁组分内毒素（常被称为脂多糖）的存在可引发炎症、发热、低血压或高血压，极端情况下可能导致组织和器官损伤，甚至致命。因此，药品中内毒素的含量受到严格监管。在现有的内毒素检测与定量方法中，鲎变形细胞溶解物（LAL）检测法在全球范围内被广泛使用。尽管任何药品均可能对LAL检测产生干扰，但由于其复杂性，纳米制剂尤其具有挑战性。本文旨在为缺乏在工程化纳米材料及纳米颗粒制剂药物中测定内毒素经验的研究人员提供实用指南。本文讨论了实施三种LAL检测方法（包括浊度法、显色法和凝胶法）的实用建议。这些检测方法可用于测定基于纳米技术的药品、疫苗及佐剂中的内毒素污染情况。

引言

内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分^1,2它可在极低（皮克）浓度下激活免疫细胞^1,2促炎介质（细胞因子、白三烯、二十碳烷酸类） 等等。) 细胞在内毒素刺激下产生的这些物质可引起发热、低血压、高血压以及包括多器官衰竭在内的更严重健康问题^1,2,3内毒素引发的免疫介导副作用的严重程度取决于其效价，该效价由内毒素的组成和结构决定，并以国际内毒素单位（IUs 或 EUs）进行衡量。³每公斤体重所含的这些单位数用于设定内毒素的致热剂量阈值。对于给药产品，该剂量为5 EU/kg。 通过 除鞘内给药途径外的所有途径。按体表面积每平方米给药的药物、眼内液体、放射性药物以及给药产品 通过 鞘内给药途径具有不同的致热剂量阈值，为100 EU/m²，0.2 EU/mL，175 EU/V（其中V为拟给药产品的体积），以及0.2 EU/kg⁴有关不同药品和器械的阈值致热剂量的更多详细信息在其他地方已提供并讨论。^4,5,6.

动物对内毒素介导反应的敏感性存在广泛差异。人类、非人灵长类动物和兔子是对内毒素最为敏感的物种之一³。为了避免患者出现由内毒素引起的副作用，并防止在临床前毒性和有效性研究中得出不准确的结论，准确检测和定量临床及临床前级别制剂中的内毒素至关重要。目前已有多种方法可实现这一目标。其中一种是鲎试剂（Limulus Amoebocyte Lysate, LAL）检测法，该方法在全球范围内被广泛用于筛查生物医学产品中潜在的内毒素污染，以及检测细菌感染^7,8,9。该裂解物来源于美洲东海岸栖居的美洲鲎（Limulus polyphemus）血液中的变形细胞⁷。有趣的是，在亚洲也存在几种不同的鲎物种，例如东方鲎（Tachypleus gigas）和中华鲎（Tachypleus tridentatus）¹⁰。在一些亚洲国家，使用东方鲎变形细胞裂解物（Tachypleus Amoebocyte Lysate, TAL）来检测内毒素，其用途与LAL在其他国家的应用类似¹⁰。这些裂解物（LAL和TAL）含有一组蛋白质，激活后可表现出蛋白酶活性。其中一种蛋白称为因子C，在接触内毒素时被激活。活化的因子C切割因子B，后者随之也转变为蛋白酶，并进一步切割前凝固酶以生成凝固酶。这一系列反应的最终结果是形成凝胶、样品浊度升高，以及在存在显色底物的情况下产生有色产物，这些现象分别构成了凝胶法、浊度法和显色法检测的基础。尽管目前并无强制规定必须采用某种特定形式的LAL检测方法，但美国食品药品监督管理局（US Food and Drug Administration, FDA）在其行业指南文件中指出，当不同LAL检测方法的结果出现不一致时，应以凝胶法的结果为准⁵。

许多常用的实验室化学品（例如，EDTA）和已知的药品（例如，青霉素）会干扰鲎试剂（LAL）检测¹¹。通常通过检测在含有待测物质的溶液中加入已知浓度内毒素标准品后的回收率来识别是否存在干扰。如果加标回收率低于50%或高于200%，则分别由于抑制或增强效应，该待测物质的LAL检测结果无效⁴。基于纳米技术的制剂通常较为复杂，可通过多种机制干扰LAL检测^12,13,14。已有多种方法被报道用于克服此类干扰：使用特定缓冲液和表面活性剂重新配制样品、通过加热使蛋白质失活、通过加热破坏基于脂质的中空材料，并在样品中添加过量的二价阳离子^{5,12,13,14,15}。当无法消除LAL干扰时，也有其他替代方法被描述：酶联免疫吸附试验（ELISA）、HEK-TLR4报告细胞系检测以及质谱法^16,17,18,19。

本文描述了凝胶法、浊度法和显色法LAL实验的操作步骤。这些实验方法也可在纳米技术表征实验室（NCL）网站上获取。²⁰ 在 STE1.2（浊度法 LAL）、STE1.3（凝胶法 LAL）和 STE1.4（显色法 LAL）方案中。建议采用至少两种不同方法对同一种纳米制剂进行表征。当浊度法 LAL 与显色法 LAL 的结果不一致时，以凝胶法 LAL 的结果为准⁵当两种LAL方法的结果不一致时，需进行额外研究，采用单核细胞激活试验（MAT）或兔体发热试验（RPT）以验证LAL结果²¹需要注意的是，每种用于内毒素检测和致热性评估的方法都有其优势和局限性。^21,22,23,24认识到用于表征特定纳米技术制剂的方法的局限性，对于为该纳米制剂选择最优表征方法提供科学依据至关重要。

在本研究中，聚乙二醇化脂质体阿霉素被用作模型纳米颗粒制剂。该制剂已于1995年获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于全球癌症患者的治疗²⁵。

方案

1. 纳米颗粒样品的制备

1. 使用鲎试剂级水制备研究样品。
2. 如果样品的 pH 值超出 6–8 范围，使用无热原的氢氧化钠或盐酸调节 pH 值。
3. 使用鲎试剂级水对研究样品进行多个梯度稀释。确保最高稀释倍数不超过最大有效稀释倍数（MVD）。有关 MVD 的估算详情，请参见讨论部分。

2. 不同LAL方法通用试剂的制备

1. 使用无热原LAL试剂水稀释浓氢氧化钠储备液，配制浓度为0.1 N的工作液。
2. 使用无热原LAL试剂水稀释浓盐酸储备液，配制终浓度为0.1 N的工作液。
3. 对照标准内毒素（CSE）的配制
   1. 根据生产商提供的分析证书对CSE进行重悬。
      注意：有关分析证书中所提供信息的重要说明，请参见讨论部分。有关特定CSE制剂在不同LAL方法中的货号及应用详情，请参见材料表。
4. LAL试剂的配制
   1. 根据生产商提供的分析证书对LAL试剂进行重悬。
      注意：有关LAL试剂配制的重要细节，请参见讨论部分。有关特定LAL试剂制剂在不同LAL方法中的货号及应用详情，请参见材料表。

3. 浊度法LAL检测

1. 标准品的制备
   1. 使用 900 µL 鲎试剂级水和 100 µL CSE，根据需要配制足够数量的中间稀释液，以制备浓度范围为 0.001 至 1 EU/mL 的校准标准品。
   2. 首先标记试管，并向每支试管中加入 900 μL 鲎试剂级水。然后向其中加入 100 μL 10 EU/mL 溶液，以制备浓度为 1 EU/mL 的校准标准品。
   3. 按照上述方法重复进行10倍系列稀释，以制备三个较低浓度的校准标准品。确认已制备出浓度范围为 0.001 至 1 EU/mL 的四个校准标准品。
2. 质控品的制备
   1. 将 50 µL 浓度为 1 EU/mL 的 CSE 溶液与 950 µL 鲎试剂级水混合，制备浓度为 0.05 EU/mL 的质控品。
      注：有关质控品制备的详细信息，请参见讨论部分。
3. 抑制/增强（IEC）对照品的制备
   1. 将 25 µL 浓度为 1 EU/mL 的 CSE 溶液与 475 µL 特定稀释度的待测纳米材料混合，制备浓度为 0.05 EU/mL 的 IEC。
      注：更多详细信息请参见讨论部分。
4. 实验步骤
   1. 提前约 30 分钟开启仪器，使其预热。将检测波长设置为 660 nm，此波长适用于浊度法鲎试剂检测。
   2. 输入用户名和密码进行登录。
   3. 点击计算机屏幕上的对应图标，打开软件（材料表）。
   4. 在软件主界面选择 采集数据。在主界面的 常规 选项卡中相应位置输入测试编号和数据组信息。
   5. 点击 硬件 选项卡。从下拉菜单中选择仪器类型。
   6. 通过选择鲎试剂浊度法，将检测波长设置为 660 nm，此设置适用于浊度法鲎试剂检测。
   7. 确认屏幕上显示序列号、系统 ID 和串口信息。点击 确定。再次点击 确定 以确认设置。
   8. 按照样品实际测试顺序输入样品编号。使用默认按钮输入阴性对照、标准曲线和待测样品。 
   9. 为每个样品准备两份平行管，并向预先标记的玻璃试管中分别加入 200 µL（测试比例 4:1）或 100 µL（测试比例 1:1）的阴性对照（水）、校准标准品、质控品、IEC 和待测纳米颗粒。
   10. 向第一个测试小瓶中加入 50 µL（测试比例 4:1）或 100 µL（测试比例 1:1）的鲎试剂，短暂涡旋混匀后，插入仪器转盘的测试孔中。若使用 1:1 比例，则鲎试剂体积为 100 µL。
   11. 对其他样品重复上述操作。每次处理一个样品。
       注：更多细节请参见讨论部分。

4. 显色基质鲎试剂法

1. 标准品的制备
   1. 使用 900 µL 鲎试剂级水和 100 µL CSE，根据需要配制足够数量的中间稀释液，以制备浓度为 1 EU/mL 的校准标准品。
   2. 使用 900 µL 鲎试剂级水和 100 µL 浓度为 1 EU/mL 的校准标准品，配制第二个浓度为 0.1 EU/mL 的校准标准品。
   3. 按照上述方法进行连续10倍稀释，以制备两个更低浓度的校准标准品。确认已配制出浓度范围为 0.001 至 1 EU/mL 的四个校准标准品。
2. 质控品的制备
   1. 将 50 µL 浓度为 1 EU/mL 的 CSE 溶液与 950 µL 鲎试剂级水混合，配制浓度为 0.05 EU/mL 的质控品。
      注：有关质控品制备的详细信息，请参见讨论部分。
3. 抑制/增强（IEC）对照品的制备
   1. 将 25 μL 浓度为 1 EU/mL 的 CSE 溶液与 475 μL 待测纳米材料混合，配制浓度为 0.05 EU/mL 的样品。
      注：更多细节请参见讨论部分。
4. 实验步骤
   1. 提前约 30 分钟开启仪器进行预热。将检测波长设置为 405 nm，此波长适用于浊度法鲎试剂检测。
   2. 通过点击计算机屏幕上的相应图标打开软件，输入用户名和密码登录。
   3. 在软件主界面选择 采集数据，并在主界面的 常规 选项卡中相应位置输入测试编号和数据组信息。
   4. 点击 硬件 选项卡，从下拉菜单中选择仪器类型，然后选择具体仪器。
   5. 确认屏幕上显示序列号、系统 ID 和串口信息，点击 OK，再次点击 OK 以确认。
   6. 按照样品实际测试顺序输入样品编号。使用默认按钮输入阴性对照、标准曲线和测试样品信息。
   7. 为每个样品准备两份平行管，并向预先标记的玻璃试管中分别加入 200 µL（测试比例 4:1）或 100 µL（测试比例 1:1）的阴性对照（水）、校准标准品、质控品、IEC 样品及待测纳米颗粒。
   8. 向第一个测试小瓶中加入 50 µL（测试比例 4:1）或 100 µL（测试比例 1:1）的鲎试剂，短暂涡旋混匀后，插入仪器转盘的测试孔中。若使用 1:1 比例，则鲎试剂体积为 100 µL。
   9. 对其他样品重复上述操作，每次处理一个样品。

5. 凝胶法鲎试剂（LAL）

注意：本实验通过肉眼观察和检测反应管中是否形成凝块来判断样品中是否存在内毒素。实验步骤如下所述。请使用实验记录表记录结果。该实验记录表并非强制使用，其他记录实验结果的方式也可接受。为方便读者，补充材料中提供了一份实验记录表示例。λ（l）为凝胶法检测的灵敏度，其值为 0.03 EU/mL。

1. 根据待分析测试样本的数量，标记相应数量的反应管。有关检测步骤1、步骤2和步骤3中使用的重复次数详情，请参考实验记录表。
2. 每管加入100 μL水、对照品或测试样品。
3. 配制CSE，使其终浓度等于4λ。
4. 将上述标准品100 μL与100 μL水或测试样品混合，使CSE终浓度为2λ。再重复稀释三次，分别得到λ、½λ和¼λ浓度。
5. 确保水浴温度为37 °C。
6. 每支测试管中加入100 μL裂解液，短暂涡旋混匀，然后将装有所有试管的试管架放入水浴中孵育1小时。
7. 以平稳动作倒置试管。
8. 在实验记录表上手动记录结果：“+”表示形成坚实凝块，“-”表示无凝块或凝块松散。
9. 按照美国药典细菌内毒素检测法USP BET 85⁴进行分析；以实验记录表作为辅助材料。

结果

该制剂在鲎试剂（LAL）检测中测试后所产生的数据示例见表1。聚乙二醇化脂质体多柔比星在5倍稀释时对显色法LAL检测产生干扰。然而，通过进一步稀释可消除该干扰。当该制剂在浊度法和显色法LAL检测中以50倍和500倍稀释进行测试，以及在浊度法LAL检测中以5倍稀释进行测试时，加标回收率介于50%至200%之间。经稀释因子校正后，两种检测方法在不同稀释倍数下的结果具有一致性。此外，三种检测方法之间的结果也具有一致性。

测试样品

浊度法LAL，EU/mg（加标回收率，%）

显色法LAL，EU/mg（加标回收率，%）

凝胶法LAL...

讨论

本方案中提供的信息此前已有描述^15,26，其依据美国食品药品监督管理局（US FDA 或 FDA）和美国药典委员会（USP）发布的多项监管文件^4,5,6,27，相关内容也可在NCL网站的STE1.2（浊度法LAL）、STE1.3（凝胶法LAL）和STE1.4（显色法LAL）方案中获取²⁰。

试验用纳米材料应使用LAL试剂水或无菌、无热原的PBS进行制备。研究样品的pH值至关重要，因为过低（< 6）或过高（> 8）的pH值会影响裂解液的最佳性能。若试验用纳米颗粒的pH值超出6–8范围，可使用无热原的氢氧化钠或盐酸进行调节。进行此类调节时，必须避免微电极...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>浊度LAL试验
氢氧化钠	Sigma	S2770	必要时，用于调节样品 pH 至 6–8 之间
盐酸	Sigma	H9892	必要时，用于将样品 pH 调整至 6–8 之间
鲎试剂	Cape Cod 联合公司	T0051	该试剂仅可用于浊度测定
对照内毒素标准品	Associates of Cape Cod	E0005	该试剂可用于浊度法和凝胶凝块法检测
LAL级水	Cape Cod 联合公司	WP0501	该试剂可与任何LAL格式配合使用
Glucashield 缓冲液	Associates of Cape Cod	GB051-25	用于防止β-葡聚糖引起的假阳性反应
一次性无内毒素玻璃稀释管 12 x 75 mm	Cape Cod 联合公司	TB240	这些试管可用于全部三种检测方法
一次性无内毒素玻璃反应管 8 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TK100	这些试管可用于浊度测定和显色测定
无热原枪头，规格 0.25 和 1.0 mL	RAININ	PPT25，PPT10	吸头和移液器可能吸附内毒素并释放浸出物，从而干扰鲎试剂（LAL）检测。选用这些RAININ吸头是因为其在LAL检测中的优异性能已得到验证和确认
无热原微量离心管，2.0 mL	Eppendorf	22600044	可使用其他等效的替代品
无热原 Combitips，5 mL	Eppendorf	30089669	可使用其他等效的耗材
重复移液器	Eppendorf	4982000020	可使用其他等效的耗材
微型离心机	任何品牌		任何品牌均可使用
冰箱，2-8 °C	任何品牌		任何品牌均可使用
涡旋混合	任何品牌		任何品牌均可使用
冷冻机，-20 °C	任何品牌		任何品牌均可使用
Pyros Kinetix 或 Pyros Kinetix Flex 读数仪	Associates of Cape Cod	PKF96	也可使用其他仪器。但是，本实验中使用的LAL试剂和内毒素标准品可能需要进行优化。当使用其他仪器时，请参考仪器和LAL试剂盒制造商提供的说明。
<强>显色LAL检测法
Pyrochrome LAL试剂	Cape Cod公司	CG1500-5	该试剂专用于显色测定法
内毒素标准对照	Cape Cod 联合公司	EC010	该标准不同于浊度法和凝胶凝块法LAL试验所用的标准；它经过优化，可在显色法测定中实现最佳性能
氢氧化钠	Sigma	S2770	必要时，用于调节样品 pH 至 6–8 之间
盐酸	Sigma	H9892	必要时，用于调节样品 pH 至 6–8 之间
LAL级水	Associates of Cape Cod	WP0501	该试剂可与任何LAL格式配合使用
Glucashield 缓冲液	Associates of Cape Cod	GB051-25	用于防止β-葡聚糖引起的假阳性反应
一次性无内毒素玻璃稀释管 12 x 75 mm	Cape Cod 联合公司	TB240	这些试管可用于全部三种检测方法
一次性无内毒素玻璃反应管 8 x 75 mm	Cape Cod 联合公司	TK100	这些试管可用于浊度和显色测定
无热原枪头，规格 0.25 和 1.0 ml	RAININ	PPT25，PPT10	吸头和移液器可能吸附内毒素并释放浸出物，从而干扰鲎试剂（LAL）检测。选用这些RAININ吸头，是因为其在LAL检测中的优异性能已得到验证和确认
无热原微量离心管，2.0 mL	Eppendorf	22600044	可使用其他等效的耗材
无热原 Combitips，5 mL	Eppendorf	30089669	可使用其他等效的耗材
重复移液器	Eppendorf	4982000020	可使用其他等效的耗材
微型离心机	任何品牌		任何品牌均可使用
冰箱，2-8 °C	任何品牌		任何品牌均可使用
涡旋混合	任何品牌		任何品牌均可使用
冷冻机，-20 °C	任何品牌		任何品牌均可使用
Pyros Kinetix 或 Pyros Kinetix Flex 读数仪	Cape Cod 联合公司	PKF96	也可使用其他仪器。但本实验所用的鲎试剂（LAL）和内毒素标准品可能需要进行优化。若使用其他仪器，请参考仪器和鲎试剂盒制造商提供的说明。
<强>凝胶法鲎试剂检测
鲎试剂	Cape Cod 联合公司	G5003	该试剂专用于凝胶凝集法检测
内毒素标准对照	Cape Cod 联合公司	E0005	该试剂可用于浊度法和凝胶凝集法检测
氢氧化钠	Sigma	S2770	必要时，用于调节样品 pH 至 6–8 之间
盐酸	Sigma	H9892	必要时，用于调节样品 pH 至 6–8 之间
LAL级水	Cape Cod 联合公司	WP0501	该试剂可与任何LAL格式配合使用
Glucashield 缓冲液	Associates of Cape Cod	GB051-25	用于防止β-葡聚糖引起的假阳性反应
一次性无内毒素玻璃稀释管 12 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TB240	这些试管可用于全部三种检测方法
一次性无热原玻璃反应管 10 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TS050	这些试管用于凝胶法检测
无热原枪头，规格 0.25 和 1 mL	RAININ	PPT25，PPT10	移液器吸头可能吸附内毒素并释放浸出物，从而干扰鲎试剂（LAL）检测。选用这些RAININ吸头是因为其在LAL检测中的优异性能已得到验证和确认
无热原微量离心管，2.0 mL	Eppendorf	22600044	可使用其他等效的耗材
无热原 Combitip，5 mL	Eppendorf	30089669	可使用其他等效的耗材
重复移液器	Eppendorf	4982000020	可使用其他等效的耗材
微型离心机	任何品牌		任何品牌均可使用
冰箱，2-8 °C	任何品牌		任何品牌均可使用
涡旋混合	任何品牌		任何品牌均可使用
-20 °C 冰箱	任何品牌		任何品牌均可使用
水浴，37 °C	任何品牌		可使用任何品牌的设备，但重要的是必须关闭水循环或使用非循环水浴，因为水流会影响凝块形成，导致假阴性结果