方法文章

同时测量新鲜分离且完整的小鼠脑血管内皮细胞内的钙离子浓度和膜电位

DOI：

10.3791/58832

⸱

2019年1月20日

 , 
1Department of Basic Sciences, Loma Linda University

本文内容

摘要

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本文演示了以下实验方案：（1）新鲜分离完整的大脑微血管内皮“管状结构”；（2）在内皮依赖性超极化过程中，同步测量内皮细胞的钙离子浓度和膜电位。此外，这些方法允许将内皮细胞的钙信号和电学信号作为独立或交互的实验变量进行药理学调控。

摘要

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脑动脉及其相应的微循环通过调节血流将氧气和营养物质输送至大脑。内皮细胞衬于血管管腔内，可根据神经元的代谢需求调控血管直径的变化。介导血管舒张并从而增加血流的内皮依赖性主要信号通路通常平行发挥作用，包括膜电位（Vm）超极化和一氧化氮通路。尽管内皮源性超极化（EDH）的组分在协调数毫米长度血管的舒张过程中至关重要，但其组分历来难以测量。EDH的这些组分包括细胞内Ca2+浓度[Ca2+]i的升高以及随后小电导和中等电导的Ca2+激活K+通道（SKCa/IKCa）的激活。

本文介绍了一种简化的小鼠脑动脉新鲜内皮细胞分离方法；分别采用Fura-2光度法和细胞内锐电极技术同步测量内皮细胞内钙离子浓度 [Ca2+]i 和膜电位 Vm；并在生理条件（pH 7.4，37 °C）下持续灌流盐溶液和药理学试剂。从Willis环获取的后脑动脉需完全剔除后交通动脉和基底动脉。对清洗后的后脑动脉节段进行酶消化，随后进行吹打处理，以去除外膜、血管周围神经和平滑肌细胞。所得的后脑动脉内皮"管状结构"在显微镜下固定，并在持续灌流条件下，利用摄像系统、光电倍增管以及一个或两个电位计进行观察和检测。该方法可同时在特定细胞区域测量内皮细胞 [Ca2+]i 和 Vm 的动态变化，并可检测内皮源性超极化（EDH）通过缝隙连接在完整内皮层中沿血管长达毫米距离的传播过程。该方法有望实现对正常与病变脑组织中脑内皮细胞功能及其在脑血流调节机制中作用的高通量分析。

引言

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脑内血流通过血管网络中脑动脉和小动脉的血管舒张协调作用进行调节1。脑阻力动脉内壁的内皮细胞可根据神经元的代谢需求，调控血管直径的变化1,2,3。特别是，在内皮依赖性超极化（通常称为EDH）过程中，内皮细胞内的细胞内Ca2+（[Ca2+]i）和电信号通过缝隙连接与周围平滑肌细胞协调，共同介导内皮细胞间的血管舒张，从而实现动脉松弛4。EDH的生理启动依次包括：Gq偶联受体（GPCRs）被激活、[Ca2+]i升高，以及内皮小电导和中电导Ca2+激活的K+通道（SKCa/IKCa）的开放，导致脑内皮细胞膜电位（Vm）超极化5,6,7。因此，内皮细胞中[Ca2+]i与Vm之间....

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方案

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在开展以下实验之前，须确保所有动物护理、使用及操作规程均已获得机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并符合美国国家研究委员会（National Research Council）的相关规定。 "实验动物护理和使用指南" (8th 版本，2011）及ARRIVE指南。洛马林达大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）已批准本手稿所用所有实验方案，适用于雄性和雌性C57BL/6小鼠（年龄范围：3至30月龄）。

1. 仪器与材料

注意：本实验方案所需材料的详细信息可参见材料表、试剂部分，以及相关供应商提供的说明书或网站信息。

  1. 灌流室
    1. 将底部带有玻璃盖玻片的灌流室固定在阳极氧化铝平台上，并将该平台连同灌流室一起固定到紧凑型铝制载物台上。
    2. 在铝制载物台平台的两端各安装一个显微操作器，用于固定固定毛细管。
      注意： 作为一种实用选择，可使用此可移动载物台装置，并将灌流室单元固定其上，以方便从内皮管的分离过渡到实验操作。
    2. ....

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结果

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上述方案的示意图如附图所示。图中显示了一只年轻成年雄性C57BL/6N小鼠（5个月大）分离出的脑组织（图1A）。从大脑Willis环上小心分离出大脑后动脉，去除结缔组织后切成若干片段（图1B-D）。将部分消化后的动脉片段中获得完整的内皮管状结构，并使用固定移液管将其固定在玻璃盖玻片上。通过两个固定移液管施加轻柔的机械牵拉，使血管长度接近体内线性长度，同时避免血管扭曲。此过程在论文中已有进一步说明（图2A-D）。从大脑后动脉分离出的内皮管宽度约为90–100 µm，长度≥300 µm。将内皮管负载Fura-2 AM，随后用PSS洗脱。通过Ca2+光度测定法和锐电极电生理记录技术，同时测量内皮管中的[Ca2+]i和Vm （实验装置见

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讨论

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鉴于近期的研究进展6,15,16,17，我们现在展示一种用于分离小鼠脑动脉内皮细胞的方法，以便在37 °C条件下持续约2小时稳定地同时测量内皮依赖性超极化（EDH）相关的细胞内钙浓度[Ca2+]i和膜电位Vm。尽管该技术操作难度较高，我们仍可同时检测细胞间的电耦联（参见文献6，图1）。通过这种方法，我们能够同时记录局部和传导性的信号事件。有关分离小鼠动脉内皮过程中所面临的一般性挑战，请参阅文献11,12。本文将重点强调分离小鼠脑动脉的关键步骤、内皮细胞[Ca2+]i与Vm测量的具体方法、常见.......

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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我们感谢查尔斯·休伊特（Charles Hewitt）在建立本实验方案所需的设备和耗材过程中提供的出色技术支持。我们感谢来自LLU围产期生物学中心的肖恩·M·威尔逊博士（Drs. Sean M. Wilson）和克里斯托弗·G·威尔逊博士（Christopher G. Wilson），他们分别为我们提供了额外的倒置显微镜和电位计。本研究得到了美国国立卫生研究院基金R00-AG047198（EJB）以及洛马林达大学医学院新进教师启动资金的支持。本内容由作者全权负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
葡萄糖Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）G7021
NaClSigmaS7653
MgCl2SigmaM2670
CaCl2Sigma223506
HEPESSigmaH4034
KClSigmaP9541
NaOHSigmaS8045
ATPSigmaA2383
HCl赛默飞世尔科技公司（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）A466250
胶原酶（H型混合物）SigmaC8051
二硫苏糖醇SigmaD8255
木瓜蛋白酶SigmaP4762
弹性蛋白酶SigmaE7885
BSASigmaA7906
碘化丙啶SigmaP4170
DMSOSigmaD8418
Fura-2 AM 染料美国加利福尼亚州卡尔斯巴德，InvitrogenF14185
循环冷却器（Isotemp 500LCU）赛默飞世尔科技13874647
Plexiglas 灌流室 Warner Instruments，康涅狄格州剑桥，美国RC-27
玻璃盖玻片底部（2.4 × 5.0 cm赛默飞世尔科技12-548-5M
阳极氧化铝平台（直径：7.8 cm Warner InstrumentsPM6 或 PH6
紧凑型铝制载物台 美国俄勒冈州格兰茨帕斯，西斯基尤8090P
显微操作仪锡斯基尤 MX10
体视显微镜 蔡司，纽约，美国Stemi 2000 & 2000-C
光纤光源 德国美因茨，肖特公司 & KL200，蔡司Fostec 8375
尼康倒置显微镜美国纽约州梅尔维尔，尼康仪器公司Ts2
相差物镜 尼康仪器公司 (Ph1 DL；10X && 20X)
荧光物镜 尼康仪器公司20X（S-Fluor）和40X（Plan Fluor）
尼康倒置显微镜尼康仪器公司Eclipse TS100
显微注射泵控制器（Micro4） 美国佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司（WPI）SYS-MICRO4
减振台美国马萨诸塞州皮博迪，技术制造公司 微重力
放大器Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔Axoclamp 2B &和 Axoclamp 900A
前置放大器 Molecular DevicesHS-2A & HS-9A
函数发生器 EZ Digital，韩国首尔FG-8002
数据采集系统Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔Digidata 1550A
可听基线监测器Ampol US LLC，佛罗里达州萨拉索塔，美国 BM-A-TM
数字存储示波器Tektronix，美国俄勒冈州比弗顿 TDS 2024B
荧光系统接口，ARC 灯 + 电源，Hyperswitch，PMTMolecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔IonOptix 系统
温度控制器  华纳仪器TC-344B 或 C
内联加热器 Warner InstrumentsSH-27B
阀门控制器 Warner InstrumentsVC-6
内联流量控制阀Warner Instruments FR-50
电子拉制仪 Sutter Instruments，诺瓦托，加利福尼亚州，美国P-97 或 P-1000 
显微操作仪Narishige，美国纽约州东草地公园 MF-900
硼硅酸盐玻璃管（匀浆用）美国佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司（World Precision Instruments, WPI）1B100-4
硼硅酸盐玻璃管（固定用）Warner InstrumentsG150T-6
硼硅酸盐玻璃管（尖端电极）Warner InstrumentsGC100F-10
注射器滤器（0.22 µm)  赛默飞世尔科技722-2520
玻璃培养皿 + 活性炭硅胶美国佛蒙特州圣奥尔本斯市 Living Systems Instrumentation 公司DD-90-S-BLK
Vannas 型剪刀（3 mm） &和 9.5 mmWorld Precision Instruments555640S, 14364
剪刀 3 & 7 mm 刀片Fine Science Tools（或 FST），美国加利福尼亚州福斯特市Moria MC52 & 15000-00
尖头精细镊子 FSTDumont #5 & Dumont #55

参考文献

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  1. Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).
  2. Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M.

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Fura 2

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