本文演示了以下实验方案：（1）新鲜分离完整的大脑微血管内皮“管状结构”；（2）在内皮依赖性超极化过程中，同步测量内皮细胞的钙离子浓度和膜电位。此外，这些方法允许将内皮细胞的钙信号和电学信号作为独立或交互的实验变量进行药理学调控。
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摘要
摘要
脑动脉及其相应的微循环通过调节血流将氧气和营养物质输送至大脑。内皮细胞衬于血管管腔内，可根据神经元的代谢需求调控血管直径的变化。介导血管舒张并从而增加血流的内皮依赖性主要信号通路通常平行发挥作用，包括膜电位（Vm）超极化和一氧化氮通路。尽管内皮源性超极化（EDH）的组分在协调数毫米长度血管的舒张过程中至关重要，但其组分历来难以测量。EDH的这些组分包括细胞内Ca2+浓度[Ca2+]i的升高以及随后小电导和中等电导的Ca2+激活K+通道（SKCa/IKCa）的激活。
本文介绍了一种简化的小鼠脑动脉新鲜内皮细胞分离方法；分别采用Fura-2光度法和细胞内锐电极技术同步测量内皮细胞内钙离子浓度 [Ca2+]i 和膜电位 Vm；并在生理条件（pH 7.4，37 °C）下持续灌流盐溶液和药理学试剂。从Willis环获取的后脑动脉需完全剔除后交通动脉和基底动脉。对清洗后的后脑动脉节段进行酶消化，随后进行吹打处理，以去除外膜、血管周围神经和平滑肌细胞。所得的后脑动脉内皮"管状结构"在显微镜下固定，并在持续灌流条件下，利用摄像系统、光电倍增管以及一个或两个电位计进行观察和检测。该方法可同时在特定细胞区域测量内皮细胞 [Ca2+]i 和 Vm 的动态变化，并可检测内皮源性超极化（EDH）通过缝隙连接在完整内皮层中沿血管长达毫米距离的传播过程。该方法有望实现对正常与病变脑组织中脑内皮细胞功能及其在脑血流调节机制中作用的高通量分析。
引言
脑内血流通过血管网络中脑动脉和小动脉的血管舒张协调作用进行调节1。脑阻力动脉内壁的内皮细胞可根据神经元的代谢需求，调控血管直径的变化1,2,3。特别是，在内皮依赖性超极化（通常称为EDH）过程中，内皮细胞内的细胞内Ca2+（[Ca2+]i）和电信号通过缝隙连接与周围平滑肌细胞协调，共同介导内皮细胞间的血管舒张，从而实现动脉松弛4。EDH的生理启动依次包括：Gq偶联受体（GPCRs）被激活、[Ca2+]i升高，以及内皮小电导和中电导Ca2+激活的K+通道（SKCa/IKCa）的开放，导致脑内皮细胞膜电位（Vm）超极化5,6,7。因此，内皮细胞中[Ca2+]i与Vm之间....
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方案
在开展以下实验之前，须确保所有动物护理、使用及操作规程均已获得机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并符合美国国家研究委员会（National Research Council）的相关规定。 "实验动物护理和使用指南" (8th 版本，2011）及ARRIVE指南。洛马林达大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）已批准本手稿所用所有实验方案，适用于雄性和雌性C57BL/6小鼠（年龄范围：3至30月龄）。
1. 仪器与材料
注意：本实验方案所需材料的详细信息可参见材料表、试剂部分，以及相关供应商提供的说明书或网站信息。
- 灌流室
- 将底部带有玻璃盖玻片的灌流室固定在阳极氧化铝平台上，并将该平台连同灌流室一起固定到紧凑型铝制载物台上。
- 在铝制载物台平台的两端各安装一个显微操作器，用于固定固定毛细管。
注意： 作为一种实用选择，可使用此可移动载物台装置，并将灌流室单元固定其上，以方便从内皮管的分离过渡到实验操作。
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结果
上述方案的示意图如附图所示。图中显示一只年轻成年雄性C57BL/6N小鼠（5个月大）分离出的脑组织 图1A. 仔细从威尔氏环分离出大脑后动脉，去除结缔组织后剪成若干段（图1B- D）。从部分消化的动脉节段中获取完整的内皮管，并使用固定移液管将其固定在玻璃盖玻片上。利用两个固定移液管施加轻柔的机械拉伸，以接近体内线性长度，同时避免血管扭曲。这一点已在稿件中进一步阐明。图2A- D）。从大脑后动脉分离的内皮管约为90–100 µm 宽度和≥300 µm 长度。将Fura-2 AM加入管中，随后用PSS洗脱。同时测量[Ca2+]i 和 Vm 内皮管中的钙离子活动由Ca2+ 光度法以及尖锐电极电生理学（实验装置如图所示）
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讨论
鉴于近期的研究进展6,15,16,17，我们现在展示一种用于分离小鼠脑动脉内皮细胞的方法，以便在37 °C条件下持续约2小时稳定地同时测量内皮依赖性超极化（EDH）相关的细胞内钙浓度[Ca2+]i和膜电位Vm。尽管该技术操作难度较高，我们仍可同时检测细胞间的电耦联（参见文献6，图1）。通过这种方法，我们能够同时记录局部和传导性的信号事件。有关分离小鼠动脉内皮过程中所面临的一般性挑战，请参阅文献11,12。本文将重点强调分离小鼠脑动脉的关键步骤、内皮细胞[Ca2+]i与Vm测量的具体方法、常见.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢查尔斯·休伊特（Charles Hewitt）在建立本实验方案所需的设备和耗材过程中提供的出色技术支持。我们感谢来自LLU围产期生物学中心的肖恩·M·威尔逊博士（Drs. Sean M. Wilson）和克里斯托弗·G·威尔逊博士（Christopher G. Wilson），他们分别为我们提供了额外的倒置显微镜和电位计。本研究得到了美国国立卫生研究院基金R00-AG047198（EJB）以及洛马林达大学医学院新进教师启动资金的支持。本内容由作者全权负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯） | G7021 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| CaCl2 | Sigma | 223506 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| HCl | 赛默飞世尔科技公司（美国宾夕法尼亚州匹兹堡） | A466250 | |
| 胶原酶（H型混合物） | Sigma | C8051 | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma | D8255 | |
| 木瓜蛋白酶 | Sigma | P4762 | |
| 弹性蛋白酶 | Sigma | E7885 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| 碘化丙啶 | Sigma | P4170 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fura-2 AM 染料 | 美国加利福尼亚州卡尔斯巴德，Invitrogen | F14185 | |
| 循环冷却器（Isotemp 500LCU） | 赛默飞世尔科技 | 13874647 | |
| Plexiglas 灌流室 | Warner Instruments，康涅狄格州剑桥，美国 | RC-27 | |
| 玻璃盖玻片底部（2.4 × 5.0 cm | 赛默飞世尔科技 | 12-548-5M | |
| 阳极氧化铝平台（直径：7.8 cm | Warner Instruments | PM6 或 PH6 | |
| 紧凑型铝制载物台 | 美国俄勒冈州格兰茨帕斯，西斯基尤 | 8090P | |
| 显微操作仪 | 锡斯基尤 | MX10 | |
| 体视显微镜 | 蔡司，纽约，美国 | Stemi 2000 & 2000-C | |
| 光纤光源 | 德国美因茨，肖特公司 & KL200，蔡司 | Fostec 8375 | |
| 尼康倒置显微镜 | 美国纽约州梅尔维尔，尼康仪器公司 | Ts2 | |
| 相差物镜 | 尼康仪器公司 | (Ph1 DL；10X && 20X) | |
| 荧光物镜 | 尼康仪器公司 | 20X（S-Fluor）和40X（Plan Fluor） | |
| 尼康倒置显微镜 | 尼康仪器公司 | Eclipse TS100 | |
| 显微注射泵控制器（Micro4） | 美国佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司（WPI） | SYS-MICRO4 | |
| 减振台 | 美国马萨诸塞州皮博迪，技术制造公司 | 微重力 | |
| 放大器 | Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔 | Axoclamp 2B &和 Axoclamp 900A | |
| 前置放大器 | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| 函数发生器 | EZ Digital，韩国首尔 | FG-8002 | |
| 数据采集系统 | Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔 | Digidata 1550A | |
| 可听基线监测器 | Ampol US LLC，佛罗里达州萨拉索塔，美国 | BM-A-TM | |
| 数字存储示波器 | Tektronix，美国俄勒冈州比弗顿 | TDS 2024B | |
| 荧光系统接口，ARC 灯 + 电源，Hyperswitch，PMT | Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔 | IonOptix 系统 | |
| 温度控制器 | 华纳仪器 | TC-344B 或 C | |
| 内联加热器 | Warner Instruments | SH-27B | |
| 阀门控制器 | Warner Instruments | VC-6 | |
| 内联流量控制阀 | Warner Instruments | FR-50 | |
| 电子拉制仪 | Sutter Instruments，诺瓦托，加利福尼亚州，美国 | P-97 或 P-1000 | |
| 显微操作仪 | Narishige，美国纽约州东草地公园 | MF-900 | |
| 硼硅酸盐玻璃管（匀浆用） | 美国佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司（World Precision Instruments, WPI） | 1B100-4 | |
| 硼硅酸盐玻璃管（固定用） | Warner Instruments | G150T-6 | |
| 硼硅酸盐玻璃管（尖端电极） | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| 注射器滤器（0.22 µm) | 赛默飞世尔科技 | 722-2520 | |
| 玻璃培养皿 + 活性炭硅胶 | 美国佛蒙特州圣奥尔本斯市 Living Systems Instrumentation 公司 | DD-90-S-BLK | |
| Vannas 型剪刀（3 mm） &和 9.5 mm | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| 剪刀 3 & 7 mm 刀片 | Fine Science Tools（或 FST），美国加利福尼亚州福斯特市 | Moria MC52 & 15000-00 | |
| 尖头精细镊子 | FST | Dumont #5 & Dumont #55 |
参考文献
- Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).
- Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M.
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