Summary

密度梯度离心法测定微分品质的精子

Published: November 29, 2018
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Summary

本文介绍了密度梯度离心技术的性能及其在精子生理研究中的应用。

Abstract

在性繁殖中, 男性配子或精子细胞与雌性配子融合, 导致受精。然而, 大量具有受精能力的精子细胞需要与雌性配子相互作用, 以确保受精。因此, 单个精子细胞的受精能力对于成功的繁殖至关重要。密度梯度离心已被用作一种可重复、快速、高效、有效和适应性极强的方法, 只收集高质量精子用于辅助生殖技术。我们在这里描述的协议集中在利用不连续的渗透密度梯度离心 (pdgc) 技术, 以分离三个不同的种群的公鸡精子的质量。我们能够收集低、中、高质量的精子。我们还描述了可重复的协议, 这些协议需要通过评估精子的生存能力、流动性和渗透性来确定精子的生育潜力。利用 pdgc 技术收集精子的质量将有助于准确和彻底地表征具有差异生育潜力的精子。

Introduction

在脊椎动物中, 雄性配子承受巨大的选择性压力;因此, 男性的生殖健康是成功受精的关键。任何特定脊椎动物的雄性都必须能够大量和具有足够的质量来产生精子细胞, 以满足受精的需要。精子细胞, 同时有精子头和鞭毛, 是体内最极化的细胞。它们在精子质量上也非常异质 (活的和死的, 形态上正常和不正常的, 不动, 低移动和高流动性), 这表现在男性生殖效率的巨大差异。高质量精子的比例越大, 成功受精所需的交配次数就越少。然而, 为了实现生育能力, 形态正常的精子细胞依靠鞭毛产生的推进力到达受精部位, 并穿透透明带 1 (zp; 哺乳动物的情况下) 或内玻璃体周围在自然交配或人工授精 (ai) 之后, 卵子的第2层 (ipvl; 在鸟类和爬行动物的情况下)。确定精子质量是必要的, 用于辅助生殖技术3 (art) 和选择繁殖的雄性用于 ai 方案4。另一方面, 抗逆转录病毒疗法的成功完全取决于对精子质量的准确评估。已经开发了一些实验室测试来确定精子的功能特征。最重要的参数是精子形态、活力、流动性、容量 (鸟类精子不需要电容5)、顶体反应 (ar; 分泌物和从精子头部的顶部释放蛋白水解酶)、精子zp 或 ipvl 的渗透, 以及施肥67891011。仅衡量生育能力的指标并不能准确评估精子群体的受精能力11。导致卵子受精的几个事件的措施允许各自精母细胞性能的适当的表示法7。

为测量精子功能而开发的方法主要是特定物种。例如, 在鸟类精子中, ipvl 的生存能力、流动性和渗透率是用于评估精子质量81112 的最常见参数。射精中活精子的数量对精子的生存起着至关重要的作用, 因为精液中大量死亡精子的存在会影响精子的质量。这增强了精液中活性氧的产生, 并对活精子造成氧化损伤13。精子的流动性, 鸟类精子在体温下抵抗抵抗的鞭毛运动能力, 已知在导致受精方面起着直接的作用.众所周知, 流动与生育率呈正相关, 因此是生育率的主要决定因素8。然而, 移动精子还必须有能力接受 ar 和穿透 ipvl11。ipvl 渗透检测考虑到参与受精过程中的每一个精子 11.

在 art 的应用中, 射精通常是为了最大限度地提高高品质精子的浓度, 最大限度地减少低质量精子的浓度而进行的。采集精液后, 通过工业和研究实践中常用的精子分离程序, 可以丰富高质量精子的比例。许多这些程序已经开发, 都有各自的好处和限制, 但所有利用不同的性质, 精子收集只有具有高受精能力的精子。这些程序包括精子迁移方法、粘附柱过滤和密度梯度离心 (dgc) 1415161718 19,20. 在现有技术中, dgc 被认为是非常简单、可重复、具有成本效益和效率的, 可以分离出用于 art 的最大数量的高质量精子, 目的是最大限度地增加受精的机会14,15. 此外, dgc 对精子细胞膜无害。相反, 精子迁移方法只收集逐渐移动的精子18,19, 但收集精子的数量很低, 使其效率低下, 收集大量的精子 18,20. 粘附柱过滤在从精液中过滤高度流动的精子方面非常有效, 17然而, 它倾向于对精子膜20,21有害。

在 dgc 技术中, 产生密度梯度最常用的基板是 percoll, 它由涂覆在聚乙醛中的胶体二氧化硅颗粒组成。percoll 密度梯度离心 (pdgc) 可以是连续的, 也可以是不连续的, 但不连续梯度最常用于高流动性精子131620的高产隔离。在不连续的渐变中, 较低密度的介质漂浮在高密度介质之上, 从而产生一个从锥形管的顶部到底部密度增加的梯度。这将在密度不同的两个介质之间的接口上创建边界。pdgc 的效率来自两个因素: 1) 单个精子细胞的推进能力; 2) 结构完整性高的精子细胞密度增加的趋势。流动性较高的精子能够更好地从低密度介质中交叉, 渗透到高密度介质中。较低的流动性精子更有可能被困在不同密度介质之间的界面所产生的边界上。具有较高结构完整性和流动性的精子细胞往往比死亡、异常或低移动精子细胞具有更高的密度。当离心力应用于 pdgc 时, 这有利于不同密度的精子在梯度中各自的位置移动。

在一般情况下, pdgc 后, 在锥形管底部收集具有高生育潜力的精子的软颗粒, 并丢弃其余的。然而, 这种技术的一个未充分利用的优势是它能够根据质量差异将精子细胞分成几个小组。为了研究目的, 利用 pdgc 技术按质量分离精子可以研究精子质量, 因为它涉及生理、代谢组学和蛋白质组学的差异。在这里, 我们的目标是详细介绍如何使用这种技术来分离精子的质量, 以及证明这些差异的质量, 使用以前建立的 eosin-nigrosin 重要染色的可行性, accudenz 检测的流动性, 和精子 ipvl渗透性的相互作用测定。

Protocol

这里描述的所有方法都得到了佐治亚大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。 1. 使用传统离心机清洗 准备磷酸盐缓冲液 (pbs)。加入8.0 克氯化钠、0.2 克的 kcl、1.44 克的 na 2 hpo 4 和 0.24 g的kh2po 4 至800毫升的蒸馏水 (dh2o).使用 0.1 n hcl 将 ph 值调整到 7.4, 并使用dh2o 将溶液调整到 1 l。 准备动力缓冲器。添加6.5 ?…

Representative Results

pdgc 技术导致三层精子在所有参数中按质量程度进行了明显的分离。精子分为高密度溶液以下的高质量层、密度较高和较低密度溶液之间的中等质量层以及低密度溶液下方的低质量层。这些质量差异体现在可行性 (图 4)、移动性 (图 5) 和渗透性 (图 6) 方面的明显差异。与传统的洗涤样品相比, 从 pdg 的高质?…

Discussion

生育不仅决定了动物生产的盈利能力, 也成为自然选择物种生存的手段。精子细胞的最终功能是使卵子受精。女性的输卵管只选择那些适者生存的精子, 以确保卵子23,24的受精。体外研究还揭示了定性精子性状与受精成功 4112324 之间的密切相关关系.<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

没有。

Materials

Accudenz Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA AN7050
Percoll  Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA P7828
Schiff’s reagent Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA 3952016
TES Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA T1375
Eosin Y Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA E4009
Nigrosin Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA 198285
ST 40R Centrifuge  Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 75004524
DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter, Brea, CA, USA No catalogue is found
Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope Olympus America Inc., PA, USA No catalogue is found

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Ahammad, M. U., Jarrell, Z. R., Benson, A. P. Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (141), e58833, doi:10.3791/58833 (2018).

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