利用密度梯度离心法收集不同质量的精子

摘要

本文旨在描述密度梯度离心技术的操作方法及其在精子生理学研究中的应用。

摘要

在有性生殖过程中，雄性配子或精子细胞与雌性配子融合，从而实现受精。然而，需要大量具有受精能力的精子细胞与雌性配子相互作用，才能确保受精成功。因此，单个精子细胞的受精能力对于成功繁殖至关重要。多年来，密度梯度离心法一直被用作一种可重复、快速、高效、有效且高度可调的方法，用于在辅助生殖技术中仅收集高质量的精子。本文所述方案重点介绍利用不连续 Percoll 密度梯度离心法（PDGC）按质量分离公鸡精子的三种不同群体。我们能够收集到低、中和高质量的精子。我们还描述了可重复的实验方案，通过评估精子的存活率、运动能力和穿透能力来确定其受精潜力。利用 PDGC 技术按质量分离精子，将有助于准确而全面地表征具有不同受精潜力的精子。

引言

在脊椎动物中，雄性配子会经历强烈的选择压力；因此，雄性的生殖适应性对于成功受精至关重要。任何特定脊椎动物物种的雄性都必须能够大量产生足够质量的精子细胞，以满足受精需求。精子细胞具有头部和鞭毛，是体内极性最强的细胞。它们在精子质量上也表现出高度异质性（包括活精子与死精子、形态正常与异常精子，以及不动、低速运动和高速运动的精子），这种异质性体现在不同雄性个体间生殖效率的巨大差异上。高质量精子所占比例越大，成功使卵子受精所需的交配次数就越少。然而，为了实现受精，形态正常的精子细胞依赖其鞭毛产生的推进力，以到达受精部位，并在自然交配或人工授精（AI）后穿透卵子的透明带¹（ZP；哺乳动物的情况）或卵周内层²（IPVL；鸟类和爬行动物的情况）。确定精子质量对于辅助生殖技术³（ART）的应用以及人工授精项目中种用雄性的选择至关重要⁴。另一方面，辅助生殖技术的成功完全依赖于对精子质量的准确评估。目前已开发出多种实验室检测方法，用于测定精子的功能特性。其中最重要的参数包括精子形态、活力、运动能力、获能（禽类精子无需获能⁵）、顶体反应（AR；精子头部顶体发生外排并释放蛋白水解酶）、精子对透明带或卵周内层的穿透能力，以及受精能力^{6,7,8,9,10,11}。仅通过生育力的测量无法准确评估一群精子的受精能力¹¹。对受精前多个关键事件的检测，能够更恰当地反映单个精细胞的功能表现⁷。

用于评估精子功能的方法主要是物种特异性的。例如，在禽类精子中，活力、运动能力以及对卵黄膜内层（IPVL）的穿透能力是最常用于评估精子质量的参数^8,11,12。射精液中活精子的数量对精子的存活至关重要，因为精液中存在大量死精子会影响精子质量，从而增强精液中活性氧（ROS）的产生，导致活精子发生氧化损伤¹³。精子运动能力是指禽类精子在体温条件下克服阻力进行鞭毛运动的能力，已知其在实现受精过程中起直接作用⁸。已有充分证据表明，精子运动能力与受精力呈正相关，因此是决定受精力的主要因素之一⁸。然而，具有运动能力的精子还必须具备发生顶体反应（AR）并穿透卵黄膜内层（IPVL）的能力¹¹。IPVL 穿透实验能够全面评估每一个参与受精过程的精子¹¹。

在辅助生殖技术（ART）的应用中，通常需要对精液进行处理，以最大化高质量精子的浓度，同时最小化低质量精子的浓度。在精液采集后，可通过工业和科研实践中常用的精子分离方法，提高高质量精子所占的比例。目前已开发出多种此类方法，各有其优势与局限性，但均利用了精子群体的异质性，以筛选出受精能力较强的精子。这些方法包括精子迁移法、黏附柱过滤法以及密度梯度离心法（DGC）^{14,15,16,17,18,19,20}。在现有技术中，DGC被证明是一种非常简单、可重复、成本效益高且高效的方法，能够分离出最大数量的高质量精子，用于辅助生殖技术，以期最大化受精成功率^14,15。此外，DGC对精子细胞膜无损伤作用。相比之下，精子迁移法仅能收集具有前向运动能力的精子^18,19，但所获精子数量极少，导致在需要大量精子时效率较低^18,20。黏附柱过滤法在从精液中筛选高活动力精子方面效率较高¹⁷；然而，该方法往往会对精子膜造成损伤^20,21。

在密度梯度离心（DGC）技术中，最常用的生成密度梯度的基质是Percoll，其由涂覆有聚乙烯吡咯烷酮的胶体二氧化硅颗粒组成。Percoll密度梯度离心（PDGC）可以是连续的或不连续的，但不连续梯度最常用于高得率地分离高活动力精子^13,16,20。在不连续梯度中，低密度介质浮于高密度介质之上，形成从锥形管顶部到底部密度逐渐增加的梯度，从而在两种不同密度介质的界面处形成分界区域。PDGC的分离效率来源于两个因素：1）单个精子细胞的推进能力；2）结构完整性良好的精子细胞往往具有更高的密度。活动力较高的精子更能够穿过低密度介质并进入高密度介质中，而活动力较低的精子则更可能被困在不同密度介质界面所形成的边界处。结构完整性高且活动力强的精子通常比死亡、形态异常或活动力低的精子具有更高的密度。当在PDGC中施加离心力时，可促使不同密度的精子迁移至其在梯度中的相应位置。

在常规操作中，完成PDGC后，收集锥形管底部具有高生育潜能的柔软精子沉淀，其余部分则弃去。然而，该技术一个尚未充分利用的优势在于能够根据精子质量的差异将其分离为多个群体。出于研究目的，利用PDGC技术按质量程度分离精子，可便于研究精子质量与其生理学、代谢组学及蛋白质组学差异之间的关系。本文旨在详细说明如何利用该技术按质量分离精子，并通过已建立的伊红-尼格罗辛活体染色法评估精子活力、Accudenz分析法检测精子运动能力，以及精子-IPVL相互作用分析法评估精子穿透能力，来展示这些质量上的差异。

方案

本文所述所有方法均已获得佐治亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 使用传统离心法进行洗涤

1. 配制磷酸盐缓冲液（PBS）。在800 mL去离子水（dH₂O）中加入8.0 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄ 和0.24 g KH₂PO₄。用0.1 N HCl将pH值调节至7.4，并用dH₂O定容至1 L。
2. 配制运动缓冲液。在800 mL去离子水（dH₂O）中加入6.5 g NaCl、4.5 g葡萄糖、0.444 g CaCl₂ 和11.5 g N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸（TES）。用1 M NaOH将pH值调节至7.4，并用dH₂O定容至1 L。
3. 用移液器将0.5 mL精液转移至聚丙烯微量离心管中。加入1.0 mL PBS，轻轻混匀。
4. 在室温（RT）下以1,500 × g离心10分钟，弃去上清液。用PBS将精子沉淀重悬至1.5 mL。
5. 在室温（RT）下以1,500 × g离心10分钟。用运动缓冲液将精子沉淀重悬至0.5 mL。

2. 执行 PDGC 技术

注意：PDGC 的整个过程均在室温下进行。

1. 在两个独立的离心管中分别配制3.0 mL密度为1.08 g/mL和1.07 g/mL的Percoll溶液。
   1. 在一支洁净的试管中，加入1.712 mL的1.13 g/mL原始Percoll溶液和0.3 mL的1.5 M NaCl溶液，再加入0.988 mL的dH₂O，通过轻柔倒置混匀，得到3.0 mL密度为1.08 g/mL的溶液。
   2. 在另一支洁净的试管中，加入1.482 mL的1.13 g/mL原始Percoll溶液和0.3 mL的1.5 M NaCl溶液，再加入1.218 mL的dH₂O，通过轻柔倒置混匀，得到3.0 mL密度为1.07 g/mL的溶液。
2. 在一支洁净的试管中，将1.0 mL精液样本用2.0 mL PBS按1:2比例稀释，通过移液操作轻柔混匀。
3. 将3.0 mL密度为1.07 g/mL的溶液移入一支无菌的15 mL锥形离心管中。小心地将3.0 mL密度为1.08 g/mL的溶液沿管壁缓慢加入至1.07 g/mL溶液下方，确保两层溶液不混合。使用长型（9英寸）巴斯德移液管可使此步骤更易操作。
4. 将3.0 mL稀释后的精液样本小心地叠加在PDG（Percoll密度梯度）上方。为防止精液样本与PDG混合，将含有PDG的锥形管轻轻倾斜至45°角，沿管壁缓慢加入样本，使其自然流下并覆盖在PDG上层。
5. 准备一支空白管，使其质量与叠加样本后的PDG管相匹配。将两支管在1500 × g条件下离心20分钟。在将离心管从实验台转移至天平，再转移至离心机的过程中，需小心保持不连续梯度的完整性。
   注意：离心结束时切勿使用刹车功能。
6. 观察结果，确认离心管中已形成三个清晰的精液层，如图1所示。
7. 用移液器吸取分离后的精液各层。首先收集最上层，其次为中间层，最后收集管底的致密沉淀。将每层分别转移至洁净无菌的聚丙烯微量离心管中。
8. 每份样本用PBS稀释至1.5 mL，于1500 × g条件下离心10分钟。
9. 弃去上清液，通过轻柔移液操作用运动缓冲液重悬精子沉淀。
   注意：可根据研究者需求调整密度梯度。可通过以下公式计算所需试剂用量，其中v₀为所用储备密度溶液的体积，v为所需终体积，p为所需终密度溶液的密度，p₀为储备密度溶液的密度：
   
   配制密度溶液时始终加入0.3 mL的1.5 M NaCl，以使NaCl浓度与生理盐水一致。

3. 确定精子质量

1. 按照先前所述方法计算精子浓度²²。
2. 按照先前所述方法进行伊红-尼格罗辛活体染色¹²，并作如下修改：
   1. 制备 100 µL 精子悬液，浓度为 1 × 10⁸ 个细胞/mL。
   2. 用移液器将 50 µL 精子悬液加入含等体积伊红-尼格罗辛染液的聚丙烯微量离心管中。室温孵育 5 分钟。
   3. 取 20 µL 染色后的精子样品滴于载玻片一端，均匀涂片，方法类似于血涂片制备。涂片后于室温下空气中干燥 3–5 分钟。
   4. 在显微镜下观察涂片，计数活精子（无着色）和死精子（呈粉红色着色）的数量，并计算活精子百分率。
3. 采用先前已验证适用于鸡精子的 Accudenz 检测法，以客观评估精子运动能力⁸，并作如下修改：
   1. 将 1.0 mL 6% 检测液加入聚苯乙烯比色皿中，如图 2所示。将检测液预热至 41 °C。
      注意：使用 41 °C 是为了模拟母鸡体内的生理温度。孵育温度应与所研究物种雌性生殖道的温度相匹配。
   2. 在预热的检测液上层覆盖 100 µL 精液样品，浓度为 5 × 10⁸ 个细胞/mL。
   3. 将含有分层精子样品的比色皿放入分光光度计中，在 550 nm 处记录吸光度值。
4. 按照先前所述方法进行 IPVL 穿透试验¹¹，并作如下修改：
   1. 从完整的 IPVL 非胚盘区域切取一块大小为 0.5 cm × 0.5 cm 的组织片。
   2. 将精子浓度调整至 4 × 10⁶ 个细胞/mL。
   3. 将精子与 IPVL 组织片在小型玻璃小瓶中加入运动缓冲液，于 37 °C 孵育 15 分钟，如图 3所示。
   4. 将 IPVL 组织片浸入 3% NaCl 溶液中，以终止 IPVL 与精子之间的相互作用。
   5. 将 IPVL 组织片固定于载玻片上，先用 10% 甲醛固定 20 秒，再用希夫试剂染色 10 分钟。
   6. 在显微镜下观察 IPVL 组织片，识别精子成功穿透形成的孔洞，并在 40 倍放大下计数每 0.25 mm² 区域内所有可见孔洞的数量。

结果

PDGC 技术在所有参数中均实现了按精子质量程度的三层明显分离。精子分为高质量层、中等质量层和低质量层：高质量层位于高密度溶液下方，中等质量层位于高密度与低密度溶液之间，低质量层位于低密度溶液上方。这些质量差异通过活力的显著差异得以证实（图4），迁移率（图5）和穿透性（图6经PDG法分离后，高质量层中获取的精子在全部三项参数上均较传统洗涤法处理的样本有所提升。而PDGC分离后标记为中等和低质量的层次，其各项检测参数则分别呈现中等程度和显著下降。

讨论

生育力不仅决定动物生产的盈利能力，同时也是物种通过自然选择实现存续的手段。精子细胞的最终功能是使卵子受精。雌性输卵管仅选择最适配的精子，以确保卵子成功受精^23,24。体外研究也揭示了精子质量特征与受精成功率之间存在密切关联^4,11,23,24。生育力下降与精子质量低下相关^4,11,25。因此，有必要对精液进行处理以改善精子质量。在辅助生殖技术（ART）中，已应用PDGC方法筛选高质量精子，以提高人类及重要农业动物的生育能力¹³

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accudenz	美国纽约州韦斯特伯里，精确化学与科学公司	AN7050
Percoll	Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市	P7828
希夫’试剂 s	Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市	3952016
TES	Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯	T1375
伊红Y	Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市	E4009
尼格罗辛	Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市	198285
ST 40R 离心机	Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	75004524
DU 530 生命科学紫外/可见分光光度计	Beckman Coulter，美国加利福尼亚州布雷亚		未找到目录
奥林巴斯IX71倒置荧光与相差显微镜	Olympus America Inc.，宾夕法尼亚州，美国		未找到目录