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体外 划痕实验用于演示砷对皮肤细胞迁移的影响

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DOI：

10.3791/58838

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2019年2月23日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Northern Arizona University, 2Department of Mechanical Engineering, Northern Arizona University, 3Department of Chemistry and Biochemistry, Northern Arizona University, 4Center for Bioengineering Innovation, Northern Arizona University

本文内容

摘要

本研究聚焦于一个 体外 伤口愈合模型（划痕实验）作为一种研究环境污染物（如砷）对细胞迁移影响的机制。结果表明，该 体外 检测可在细胞迁移发生改变之前提供快速且早期的指示 体内 实验。

摘要

多年来，理解伤口愈合的生理机制一直是持续研究的重点。这些研究直接转化为临床伤口治疗标准的改进，有助于降低患者的发病率和死亡率。伤口愈合是一个复杂的过程，需要细胞与组织之间有策略性的相互作用和功能协调。其中，细胞迁移（包括单个细胞和集体迁移）是伤口愈合过程中众多关键功能之一。受伤后，来自血液、周围结缔组织和上皮组织的多种细胞会通过化学和/或物理刺激迅速迁移至伤口部位。这种迁移反应在很大程度上决定了伤口愈合的结果与成败。深入理解这一特定的细胞功能，对于推动转化医学发展、改善伤口愈合效果具有重要意义。本文介绍了一种用于深入研究与伤口愈合相关的细胞迁移过程的实验方案，并探讨细胞微环境的变化如何显著影响这一过程。在本示例研究中，将真皮成纤维细胞在添加胎牛血清（FBS）的培养基中，以单层形式培养于组织培养瓶中。细胞经无菌操作转移至组织培养处理的12孔板中，并培养至100%融合。达到融合状态后，使用p200移液枪头垂直划痕破坏单层细胞。随后，在含FBS的培养基中加入不同环境相关浓度（0.1–10 μM）的砷，分别加入各孔中。在24小时期间内，每隔4小时（h）使用倒置光学显微镜拍摄图像，以观察细胞迁移（即伤口闭合）情况。每张图像均使用图像分析软件进行单独分析，并计算伤口闭合百分比。结果表明，砷会减缓伤口愈合过程。该技术为评估污染物对伤口愈合影响提供了一种快速且经济的初步筛选方法。

引言

伤口愈合是一个复杂的过程，包含一系列相互重叠的步骤，涉及多种细胞类型、信号分子以及细胞外基质成分1。这些成分协同作用，实现伤口的消退或修复，最终根据创伤程度形成具有保护作用的纤维化瘢痕1。在单个实验中同时捕捉伤口愈合的所有独立过程和功能十分困难，因此需要分别识别并检测愈合过程中的各个独立步骤。在伤口愈合的诸多步骤中，细胞迁移过程在评估愈合速率时被认为至关重要2。细胞迁移存在于伤口愈合的各个阶段，因此有必要进一步了解细胞迁移的改变如何影响伤口闭合。例如，在炎症的早期和晚期阶段均可观察到细胞迁移，表现为伤口部位的血液凝固和血小板聚集3。这些事件通过形成暂时性阻塞，填充无组织区域，从而防止过度失血3。循环中的血小板会合成并分泌血管活性介质以及趋化因子，共同诱导炎性白细胞（白细胞）向受损组织迁移，以促进修复4。组织损伤后数小时内即发生再上皮化，此过程涉及上皮角质形成细胞的活动与迁移，覆盖伤口部位，防止外来颗粒进一步污染或侵入伤口2。上述例子仅涵盖了与伤口愈合相关的众多细胞迁移功能中的一部分。

划痕实验已被描述并用于深入理解细胞迁移及其在伤口愈合中的多种作用5,6该实验方法被认为较为简单，具有高通量特点，可使研究者获得具有代表性的细胞迁移数据。迁移实验已成功证明，某些化合物可能加速或减缓细胞迁移速率。6此外，这些检测结果可提供具有转化意义的生理学信息，可用于在制定靶向治疗方案、给药浓度以及筛选目标基因之前 体内 实验需要基本的细胞培养技术与耗材、一种选定的细胞系，以及成像技术以随时间记录细胞运动或对处理刺激的运动反应。

该检测方法可轻松进行调整或定制，以满足研究者的需求。然而，在开展实验之前，需考虑四个基本问题。研究者试图回答哪些一般性或特定性问题？这一点适用于大多数以假设为导向的研究；但对该检测尤为重要，因为这将决定准确且完整回答问题所需的诸多参数。应选用何种细胞系（若涉及多个，则为哪些细胞系）来代表所研究的生理系统？例如，在皮肤伤口愈合研究中，可使用真皮成纤维细胞5,6,7干细胞8，或表皮角质形成细胞9 可能代表在皮肤组织中通常大量存在的细胞群体10或者，可在此系统中评估中性粒细胞、巨噬细胞或其他炎症细胞，以代表皮肤组织中伤口愈合其他组分的细胞迁移。10此外，明确待评估的特定细胞系将有助于确定使用何种试剂最有利于促进细胞代谢活性。细胞迁移将如何追踪或成像？目前有多种技术可用于观察培养板或培养瓶中的细胞迁移。例如，对细胞进行染色或荧光标记，并利用荧光显微成像或共聚焦成像来追踪细胞，可提供较强的对比度，使研究者能够清晰界定细胞 与 非细胞定位与细胞运动11另一种在本研究中描述的常用技术是使用带有相差功能的倒置光学显微镜6,7这种方法替代了细胞染料和荧光标记，使用户能够在不进行终末固定的情况下对活细胞进行实时追踪，并可连续采集同一孔中随时间变化的受损单层细胞的图像。将采用哪些结果指标进行分析？利用研究过程中采集的图像，可生成用于评估细胞迁移速率变化的数据。在本实验室中，将在倒置光学显微镜下获取的显微图像上传至图像分析软件，计算伤口闭合百分比及曲线下面积总和（AUC）。

我们将重点介绍该检测方法在阐明已知环境污染物砷对真皮成纤维细胞迁移影响方面的特定应用。砷是一种天然存在的类金属元素，存在于地壳中。已在多个地区发现砷含量升高，这对居住在这些地区附近的人群构成健康风险。因此，食物和水源中已显示出砷污染水平上升，增加了人群接触砷的可能性。研究表明，环境中的砷暴露会对人群产生长期健康影响，即使暴露浓度等于或低于美国环境保护署（USEPA）现行规定的最大污染物浓度限值（MCL）——10 ppb（10 µg/L）12,13。尽管美国环保署已设定该限值并认为其在饮用水安全范围内，但全球许多水源中砷浓度超过此限值的情况并不少见。在美国西南部，已有大量地下水、井水和泉水被证实含有令人担忧的砷浓度14。例如，在亚利桑那州的弗尔德河谷（Verde Valley），蒙特祖玛井（Montezuma Well）的砷浓度达到210 µg/L 15。亚利桑那州弗尔德河周边的地下水砷浓度平均为16 µg/L ，峰值可达1.3 mg/L15,16。值得注意的是，弗尔德河流域许多水井中的砷浓度超过50 µg/L15,16。基于上述信息，本研究选择了具有环境相关性的砷浓度，范围从低于MCL的0.1 µM（7.5 ppb）到高于MCL的10 µM（750 ppb）14,15,16,17,18,19,20.

这些实验所获得的信息将用作体内砷污染伤口中细胞迁移速率潜在变化的早期指标。in vivo 污染伤口中细胞迁移速率的早期指标。随后可根据信号分子在促进伤口愈合和细胞迁移中的作用选择特定分子，并可在当前研究完成后开展基于定量聚合酶链式反应（qPCR）的基因表达定量分析实验。若本实验中砷的存在导致迁移速率发生变化，则参与细胞迁移的特定基因靶点可能受到砷的有害影响，从而成为其干扰机制的关键环节。

方案

1. 生物安全二级柜（BSC）的准备

注意：本方案中描述的方法应在佩戴个人防护装备并采用良好实验室规范以实现无菌技术的情况下进行。

  1. 将生物安全柜的防护玻璃升至工作高度，并开启层流风扇。
    1. 使用70%异丙醇水溶液对工作区域进行消毒擦拭。从生物安全柜的后壁和侧壁开始擦拭，逐步向下至底板。
    2. 用70%酒精（异丙醇或乙醇）擦拭所有将在检测中使用的材料，并将其放入生物安全柜内。

2. 在T75培养瓶中接种人真皮成纤维细胞

  1. 获取含有目标冻存细胞系的冻存管（新生儿人皮肤成纤维细胞 [hDFn]，每管细胞浓度为 500,000 个细胞，代次为 p3–p5）。
    1. 将装有细胞的离心管置于1.0 cm深的水浴中 37 °C 让其解冻。将冻存管解冻至约70%的细胞悬液呈液态。用70%酒精擦拭冻存管表面，并将其放入生物安全柜内的冻存管架中。
      注意：确保水不接触小瓶的螺纹或瓶盖，以防止细胞接种过程中可能的污染。避免细胞在水浴中完全解冻，否则可能导致非预期的细胞死亡。
  2. 吸取10 mL添加了10%胎牛血清（FBS）的培养基。使用自动移液器和10 mL移液器吸头，将培养基加入T75细胞培养瓶中。轻轻前后摇动培养瓶，使培养基充分浸润瓶底。
    1. 打开细胞冻存管，吸取管内液体时需注意移液速度，因为细胞膜在冻存后较为脆弱。
    2. 将细胞转移至含有培养基的T75培养瓶中。将冻存细胞悬液加入培养瓶时，需注意移液速度。
      注意：组织培养瓶中的细胞接种密度约为 6,600 个细胞/cm²2接种密度可根据用户需求及实验所需时间进行调整。
    3. 从T75培养瓶中量取1 mL培养基，转移回原瓶中。再将该体积从原瓶转移回T75培养瓶中。
      注意：执行此步骤有助于最大限度地提高从冻存管中获得的细胞产量。
    4. 拧紧细胞培养瓶的瓶盖，轻轻摇晃，使悬浮细胞均匀分散至整个表面。使用倒置显微镜检查细胞分布是否均匀。
  3. 用细胞类型、日期、姓名首字母缩写、细胞系及实验目的标记培养瓶例如，人包皮成纤维细胞（hDFn），2018年7月11日，NDC，第4代，砷刮痕实验）。将组织培养瓶置于潮湿培养箱中 37 °C 和 5.0% CO₂2 72 小时。
    注意：初次接种后 12–24 小时应更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜（DMSO）冷冻保护剂，之后每 48 小时更换一次培养基，以确保细胞获得充分营养。培养和生长时间取决于划痕实验所需细胞数量的计算结果。在正常条件下，hDFn 细胞的倍增时间通常为 16–24 小时。然而，倍增速率可能因海拔、pH、温度、湿度、培养基类型等因素而发生变化。 等等。在规划实验时必须考虑这些因素。

3. 细胞计数及传代至12孔组织培养板

  1. 从培养箱中取出T75细胞培养瓶。使用倒置显微镜在10倍物镜放大倍数（总放大倍数100倍）下观察贴壁细胞，并估算细胞汇合度。
    1. 观察汇合度时应扫描细胞培养瓶的大部分区域，以确保估算出最具代表性的百分比。评估单个细胞形态是否存在异常，或是否存在细菌和/或真菌污染。
  2. 将自动移液器装配10 mL移液枪头。使用移液器吸取T75瓶中的全部培养基体积，并将溶液转移至废液容器中。避免移液枪头接触贴壁细胞表面。将移液枪头丢弃至生物危害垃圾桶中。
    1. 将自动移液器装配5 mL移液枪头。吸取5 mL平衡盐溶液，加入培养瓶中，并轻轻摇动培养瓶以冲洗残留培养基、死细胞及代谢废物。
    2. 将液体从T75瓶中吸出并排入废液容器中。将移液枪头丢弃至生物危害垃圾桶中。
    3. 将自动移液器装配5 mL移液枪头。从储备液中吸取2 mL胰蛋白酶，加入培养瓶中，并轻轻摇动培养瓶，使酶均匀覆盖贴壁细胞表面。确保贴壁表面完全浸润。将细胞培养瓶放入培养箱中孵育2-3分钟（min）。
      注：酶与底物反应时间最长不得超过10分钟。
    4. 在倒置显微镜下以10倍物镜放大倍数（总放大倍数100倍）观察组织培养瓶。轻柔振动以促进细胞脱落。
    5. 用70%酒精擦拭T75培养瓶，并将其放入生物安全柜（BSC）中。
    6. 将自动移液器装配5 mL移液枪头。从储备液中吸取5 mL培养基，加入T75细胞培养瓶中以终止酶与底物反应。培养基与胰蛋白酶的体积比应为3:1。上下吹打培养瓶底部2-3次，以冲洗并确保反应已完全终止。将培养瓶中的全部液体吸出，并转移至无菌15 mL锥形管中。
    7. 用相同体积的培养基填充第二个15 mL锥形管。
    8. 将两个15 mL锥形管对称放置于离心机中。设定设备运行参数，在25°C条件下施加200 g离心力，离心5分钟。
    9. 用70%酒精擦拭含有细胞沉淀的15 mL锥形管，并将其放入生物安全柜（BSC）中。
    10. 使用装配5 mL枪头的自动移液器吸除上清液，保留约250 µL液体及细胞沉淀。注意移液枪头的位置，避免扰动细胞沉淀。将吸出的液体排入废液容器中，并将枪头丢弃至生物危害垃圾桶中。
    11. 使用微量离心管架，将锥形管底部在管槽间快速刮动，产生轻微振动，以打散并重悬细胞沉淀（此操作有时称为“rack raking”）。
      注：避免使用涡旋振荡器进行此步骤。涡旋振荡器产生的离心力超过细胞耐受阈值，可能导致细胞裂解。正确操作后，新的细胞悬液应呈现均匀浑浊状态，无可见沉淀。仔细执行此步骤通常可获得单细胞悬液，从而提高细胞计数的准确性。
    12. 向细胞储备液或重悬液中加入2 mL培养基。沿管壁轻柔吹打20次，以打散任何细胞团块。记录总细胞悬液体积，并暂时放置备用。
  3. 使用无菌移液器将20 µL台盼蓝储备液（0.4%）加入96孔板的空孔中。
    1. 在转移前充分混匀细胞储备液，以形成均匀的细胞悬液。使用无菌移液枪头吸取20 µL细胞悬液（避免接触管壁），加入96孔板中已含20 µL台盼蓝溶液的孔中。
    2. 轻柔吹打以混匀内容物。取10 µL混合液，将其加入血细胞计数板盖玻片与计数室之间。
    3. 在10倍物镜下观察细胞及网格。观察视野内的九个大方格。仅对中心及四个角的方格（共5个方格）中的细胞进行计数。
      注：应观察整个网格中细胞分布是否均匀，以确保计数准确。
    4. 统计网格中5个指定方格内的所有细胞（透明与蓝色细胞）。同时，单独统计相同5个方格内非活细胞（蓝色细胞）的数量。
    5. 使用以下公式计算活细胞数量：方程：x = a - b；减法数学公式。
      其中 x = 活细胞数，a = 总细胞数，b = 非活细胞数
    6. 使用以下公式计算活细胞密度：稀释过程中计算x的方程；涉及y和换算因子（示意图）。
      其中 x = 活细胞密度，y = 活细胞总数。
    7. 计算总活细胞数：x等于y乘以f的方程，用于教育研究的数学公式图像
      其中 x = 总活细胞数，y = 活细胞密度，f = 细胞悬液体积（mL）。
    8. 计算细胞活力百分比：计算百分比的方程，x = (y/f) × 100，数学公式表示。
      其中 x = 细胞活力百分比，y = 网格上计得的活细胞数，f = 网格上计得的总细胞数。
  4. 在12孔板底部标记一条水平线，作为成像时的参考标记。
    1. 利用活细胞密度（在3.3.7中计算得出）计算用于接种12孔细胞培养板时所需稀释细胞储备液的培养基体积。
      注：hDFn细胞的最佳接种密度为5,000个细胞/cm2。
    2. 用培养基将细胞储备液稀释至19,000个细胞/mL，并向每孔接种1 mL细胞悬液。定期混匀细胞悬液，以确保12个孔中的细胞接种均匀。
    3. 在每块培养板上标记细胞类型、细胞系、使用者姓名缩写及实验目的。将培养板放入设定为37 °C和5.0% CO2的培养箱中。培养细胞直至达到100%汇合度，用于划痕实验。

4. 砷（As）储备溶液的配制与计算

  1. 将亚砷酸钠（NaAsO2）直接稀释至含10%胎牛血清（FBS）的细胞培养基中，工作浓度分别为10、1.0、0.1和0.01 µM As。
  2. 为此，先通过将3.9 mg亚砷酸钠溶解于30 mL培养基中配制1 mM的As储备液，再对该1 mM储备液进行系列稀释，以获得其余浓度的As溶液。
1000 µM As 储备液配制计算砷工作储备液浓度M1V1=M2V2前一步砷溶液的体积培养基体积砷工作储备液总体积
NaAsO2 分子量：129.9 g/mol10 µM As(x mL)(1,000 µM) = (30 mL)(10 µM) x = 0.3 mL0.3 mL = 300 µL 的 1 mM As 溶液29.7 mL 培养基30
0.03 L × 0.001 mol/L × 130 g/mol = 3.9 mg 砷1.0 µM As(x mL)(10 µM) = (30 mL)(1 µM)    x = 3 mL3 mL 的 10 µM As 溶液27 mL 培养基30
将 3.9 mg 亚砷酸钠溶于 30 mL 培养基中0.1 µM As(x mL)(1 µM) = (30 mL)(0.1 µM)  x = 3 mL3 mL 的 1 µM As 溶液27 mL 培养基30
0.01 µM As(x mL)(0.1 µM) = (30 mL)(0.01 µM) x = 3 mL3 mL 的 0.1 µM As 溶液27 mL 培养基30

表1. 砷标准溶液及系列稀释液。 本表说明了用于配制砷储备液及处理组工作储备液的计算方法。

5. 划痕实验技术与砷污染

  1. 从培养箱中取出含有细胞的12孔板。在10倍物镜放大倍数下（总放大倍数100倍）观察细胞。确定每个孔中的细胞汇合度。
    注意：每个单独的孔必须在划痕前达到100%汇合度。此关键步骤可确保实验的一致性，并有助于在不同实验之间标准化实验方案。如果任何孔尚未达到100%汇合度，请继续孵育细胞，直到所有孔均达到100%汇合度。已经达到100%汇合度的孔额外延长培养时间不会受到影响。汇合的细胞通常会进入生长停滞状态，并保持为单层培养，同时允许未完全汇合的孔达到100%汇合度。
  2. 将自动移液器装配10 mL移液器吸头。吸出所有孔中的培养基。将废液倒入液体废弃物容器中，移液器吸头丢弃至生物危害垃圾桶。
    1. 将P200移液器装配1–200 µL无菌吸头。在每个孔中，通过将吸头从12点钟位置滑动至6点钟位置，在细胞表面制造一条划痕“模拟伤口”。
      注意：三个显著影响一致性的因素是速度、压力和吸头角度。划痕操作应迅速进行，保持恒定压力，同时注意吸头角度始终垂直于培养板底部。划痕过慢会导致划线弯曲，压力过大可能永久划伤细胞附着表面，而吸头角度小于90°会使划痕变窄。这些常见错误中的任何一种都可能导致细胞迁移速率和模式发生改变。
    2. 用每孔1 mL平衡盐溶液冲洗，以清除多余的碎片和细胞团块。轻轻左右摇动培养板以促进清洗。移除孔中的平衡盐溶液并倒入废液容器中。将5 mL移液器吸头丢弃至生物危害垃圾桶。

细胞培养流程图，包含培养箱、培养基、移液器和伤口愈合分析。
图1：划痕实验的示意图。 所有操作均在无菌环境下进行，以降低污染风险。将细胞以所需密度接种于组织培养瓶中，并在模拟人体生理条件（5% CO₂）的培养箱中培养。2, 37 °C）。当细胞达到所需汇合度时，以无菌操作将细胞以特定接种密度传代至12孔细胞培养板中。将细胞培养至12孔板每孔均达到100%汇合度，随后使用无菌移液器吸头划线。该“划痕”形成一条 体外 模拟伤口（以双向箭头表示），细胞会自然迁移以闭合空白区域。每个孔可设置独特的处理条件，并可观察和量化不同处理条件下细胞的迁移速率。 请点击此处以查看此图的放大版本。

  1. 使用带1,000 µL吸头的p1000移液器，从砷储备液中吸取1,000 µL加入已随机分配至处理组的孔中。每个孔使用新的移液器吸头，以防止交叉污染。记录添加处理试剂的时间。将12孔板置于37 °C、5.0% CO2的培养箱中。

6. 成像

  1. 在24小时期间内，每隔4小时（0、4、8、12、16、20和24小时）以10倍物镜放大倍数拍摄每个孔的图像。参考先前在培养板底部划出的标记线，在后续各时间点对每个孔中划痕的相同位置进行成像。
    注意：每次成像时必须确保拍摄相同位置，以保证图像分析的准确性并获得具有代表性的数据。

7. 图像分析

  1. 将倒置光学显微镜下拍摄的图像上传至计算机，并以包含详细信息的文件名保存为 JPEG 格式图像。
  2. 打开 ImageJ 软件。
  3. 将已知距离标尺的载物台微尺图像上传至软件中，以便在通过拖放文件到软件窗口进行图像测量时，将像素转换为毫米（mm）。
    注意：微尺应具有明确标记已知 1 mm 长度的刻线，且该图像必须在与拍摄细胞图像相同的放大倍数下获取。例如，在本研究中图像以 100X 总放大倍数拍摄，因此载物台微尺图像也需在 100X 总放大倍数下拍摄。
    1. 点击 直线、分段线 或 自由手绘线 选项。
    2. 利用微尺图像上带有已知长度标记的刻度线，绘制一条已知距离的直线。绘制直线的方法：按下鼠标，按住并拖动光标至目标位置，然后松开鼠标。
    3. 选择 分析，然后选择 设置标尺。
    4. 将 已知距离 设置为上一步所绘制线段的实际长度。
    5. 将 长度单位 设置为 mm。
    6. 勾选“全局”选项框。
    7. 点击 确定 退出菜单。
    8. 关闭载物台微尺图像。
  4. 通过将划痕实验图像文件拖放到软件窗口中，将其上传至 ImageJ。
    1. 在划痕宽度方向上绘制一条直线（从左侧前沿到右侧前沿）。
    2. 按下键盘上的 M 键以记录所绘制直线的测量值。输入 M 后，将立即弹出一个小的 结果 窗口，此处将显示宽度测量值。
  5. 重复步骤 7.4 共 10 次，以获得沿划痕全长分布的 10 个宽度测量值。
    注意：必须在整个划痕长度范围内获取最具代表性的宽度数值。确保从上至下沿划痕长度方向均匀分布这 10 个宽度测量点。
  6. 创建一个划痕实验电子表格文件，用于复制和粘贴测量数据。
    1. 将 结果 窗口中显示的 10 个宽度测量值复制并粘贴到电子表格文件的相应列中（表 2）。
      注意：当从 结果 窗口复制测量值并粘贴至电子表格时，会附带多余的数值列；这些额外数值应予以删除，仅保留 10 个宽度测量值。
10 次随机宽度测量0 h4 h8 h12 h16 h20 h24 h
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
10 次测量的平均值

表2. 原始宽度测量数据表格式。 本表展示了所获取原始测量数据的组织结构。

  1. 对剩余的划痕实验图像重复上述步骤。
  2. 计算每个时间点（0-24 小时）每孔 10 次测量值的平均值。
  3. 使用步骤 7.8 中的数值计算闭合百分比。
    1. 在电子表格底部创建一个名为“宽度测量平均值”的表格表3).
    2. 复制并粘贴 10 次测量的平均值 将第7.8步中计算的行数据填入“宽度测量平均值”表格。
    3. 在旁边创建另一个表格 宽度测量平均值 表格。为该表格命名 伤口闭合百分比 (表 4).
      注意：每个孔在0 h列中的值应为0，因为在所有孔的初始0 h照片中，划痕闭合程度为0%。
    4. 移动到下一列（4 h）。
    5. 计算4、8、12、16、20和24小时时间点的闭合百分比： 
      百分比变化公式示意图：x=(i-f)/i×100，用于科研中的数据分析与比较。
      其中，x = 闭合百分比，i = 初始划痕宽度（0 h 宽度），f = 最终划痕宽度（4、8、12、16、20 或 24 h 宽度）。
孔宽度平均值0 h4 h8 h12 h16 h20 h24 h
1a
2a
3a
4a
1b
2b
3b
4b
1c
2c
3c
4c

表3. 宽度测量平均值表格格式。 本表格展示了使用表2中的原始宽度测量数据计算得到的宽度测量平均值的组织结构。

孔0 小时4 小时8 小时12 小时16 小时20 小时24 小时
1a0
2a0
3a0
4a0
1b0
2b0
3b0
4b0
1c0
2c0
3c0
4c0

表4. 伤口闭合率表格格式。 本表格展示了使用表3中宽度测量平均值计算出的伤口闭合率数值的组织结构。

  1. 在Percent Wound Closure表格旁边创建另一个表格，将此表格命名为AUC（表5）。
    1. 计算每个孔在0-4 h列中的0-4 h曲线下面积（AUC）值：
      梯形面积计算公式，x=((a+b)/2)×h，数学公式。
      其中x = 0-4 h AUC值，a = 0 h时的%闭合值，b = 4 h时的%闭合值，h = 两次测量之间的时间间隔（本研究中为4 h）。
    2. 计算每个孔在4-8 h列中的4-8 h曲线下面积（AUC）值：
      梯形面积计算公式，x=((a+b)/2)×h，数学公式。
      其中x = 4-8 h AUC值，a = 4 h时的%闭合值，b = 8 h时的%闭合值，h = 两次测量之间的时间间隔（本研究中为4 h）。
      ​注意：每个孔在24 h期间的每个4 h时间间隔均应计算一个AUC值。
    3. 将0-24 h范围内的所有AUC值（在步骤7.10.1–7.10.2中计算）相加，得到每个孔的总AUC值。确保妥善保存这些数值以用于统计分析。
孔0-4 小时4-8 小时8-12 小时12-16 小时16-20 小时20-24 小时累积 AUC
1a
2a
3a
4a
1b
2b
3b
4b
1c
2c
3c
4c

表5. AUC表格格式。 本表格展示了使用表4中计算的伤口闭合百分比值所得AUC值的组织结构。

8. 统计学分析

  1. 根据实验设计和实验过程中获得的总AUC值，确定最适合的统计分析方法。

结果

所有处理组的样本量（n）均为 n = 28。细胞按照无菌技术和实验室操作规程成功培养（图1）。所有处理组均观察到均一的划痕，平均划痕宽度为 0.8 mm ± 0.4 mm（图2）。对照组的曲线下面积总和平均值为 1,355.83；0.01 µM As 处理组的曲线下面积总和平均值为 1,366.21；0.1 µM As 处理组为 1,326.24；1.0 µM As 处理组为 1,295.10；最后，10 µM As 处理组的曲线下面积总和平均值为 535.12，显著低于其他各组（p < 0.05）（图3）。采用 R 程序进行统计分析，通过单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Tukey post hoc 校正，以确定各处理组之间的统计学差异（p < 0.05）。

细胞迁移实验；延时显微成像；对照组与砷处理组；0-20小时比较；细胞运动。
图2：20小时期间代表性划痕实验图像。 图像A-D代表对照组细胞的迁移情况；图像E-H代表暴露于1.0 µM As的细胞迁移情况；图像I-L代表暴露于10 µM As的细胞迁移情况。从这些图像可以看出，在砷存在条件下，细胞迁移速度减慢。对照组图像显示，在20小时后划痕已完全“愈合”，而另外两个砷处理组则未实现“愈合”。10 µM As处理组在24小时后完全抑制了划痕的闭合。请点击此处查看该图的高清版本。

总AUC砷剂量反应柱状图；从对照组至10μM浓度。
图3：砷在划痕实验中减缓细胞迁移。 在24小时的时间段内采集图像，以观察不同浓度砷存在下细胞迁移速率的变化。原始图像采用自动化软件进行分析（例如在 MATLAB 中）首先测量伤口宽度，然后计算闭合百分比，最后计算曲线下面积（AUC）。误差线表示均值的标准误。 10 µM 与使用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey检验的其他所有处理组相比，该处理组显著减缓了人新生儿真皮成纤维细胞（hDFn）的细胞迁移，表现为AUC值显著降低。 事后检验 调整（p<0.05）。统计学差异通过字母“A”和“B”表示，这些字母是通过R程序中的紧凑字母显示法（Compact Letter Display method）获得的。不共享相同字母的处理组之间具有统计学显著性差异（p<0.05). 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

该检测方法可对细胞迁移进行高通量且及时的评估，并可直接应用于复杂的生理系统5,6,7因此，所提出的台式模型经过优化和实践，可用于评估各种治疗剂和环境毒素对伤口愈合的影响6本研究中所用的砷浓度是通过广泛查阅已知暴露水平的相关文献以及对多个数据库进行回顾性分析后确定为具有环境相关性的。14,15,16,17,18,19,20,21. 本方法的使用 体外 划痕实验表明，暴露于较高但环境相关浓度的砷会延缓伤口闭合（细胞迁移）。

该台式模型还被用于分离和研究单个细胞系（成纤维细胞），以进一步了解成纤维细胞迁移如何影响伤口愈合的结果。此外，在复杂的in vivo系统中，由于存在许多其他细胞和组织，可能干扰分析，因此很难研究单个细胞系的功能。另外，该检测方法可提供半定量的伤口闭合百分比数据，可用于靶向特定的细胞机制，从而揭示化合物如何影响伤口愈合过程。例如，划痕实验中使用的细胞可被收集并储存在合适的试剂中，用于基因表达（信号mRNA）或蛋白质表达检测22。如果研究者希望了解在不同处理条件（i.e., 砷）下，哪些信号或蛋白质可能在很大程度上影响细胞迁移的变化，这些信息将非常有用22。

本研究选择人新生儿真皮成纤维细胞，因其在伤口愈合过程中具有重要作用。然而，该划痕实验方案已应用于多种细胞类型及不同研究目的。例如，划痕实验已被用于肿瘤学领域，以研究化疗药物对细胞迁移的抑制作用23；用于骨骼肌细胞的迁移、增殖和扩散研究24；用于评估植物提取物对细胞迁移的影响25；以及用于理解角质形成细胞的迁移和增殖在伤口愈合中的作用9。此外，Pinto et al. 之前的一项研究利用划痕实验评估了铀（U）和富血小板血浆（PRP）对hDFn细胞迁移的影响6。本研究的目的是明确该实验在多大程度上可用于检测被认为可减缓细胞迁移的物质（U）以及被认为可加速细胞迁移的物质（PRP）的作用效果。如上述研究及其他研究者的工作所示，划痕实验在多种实验模型中具有广泛的应用潜力26。尽管方法部分提供了详细说明，但在不同研究者和实验之间仍可能出现差异。例如，细胞迁移速率可能会因所使用的细胞系以及特定细胞类型所需的微量营养素不同而有所波动。本方案中列出了多项有助于提高细胞产量和存活率的重要注意事项（NOTEs）。然而，强烈建议研究者遵循试剂制造商提供的最佳生长条件建议，并将本方法作为常规细胞培养工作的补充指导。

尽管划痕实验在研究细胞活性方面具有极高的多功能性，但在测量技术中可能产生意想不到的偏差。例如，使用 ImageJ 手动追踪细胞迁移前沿时，不同操作者之间可能存在差异，从而限制数据的准确性和代表性。还应注意，为尽量减少操作者偏倚，迁移前沿的读取应采用盲法评估。此外，由于细胞可形成伪足并伸出以建立黏着斑，手动识别迁移前沿可能导致平均迁移距离的误算，造成视觉上的误导。同理，使用荧光标记 "细胞示踪剂" 细胞表面或核蛋白的染色在检测迁移时可能意外导致细胞固定，从而在随时间测量细胞迁移时产生不准确结果。建议在实验中纳入适当的阳性对照和/或阴性对照，以全面评估处理因素对细胞系的影响。进行该检测时必须充分认识其局限性。该检测不能确保所获得的细胞迁移结果能够完全反映 体外 实验将直接转化为 体内 结果. 在复杂的生物系统中，伤口愈合与细胞迁移涉及多种细胞类型和分子信号，每一种都有可能影响愈合反应。

综上所述，划痕实验已被证实可用于在环境变化条件下对细胞迁移进行高通量筛选6,25。我们特别采用该实验方案，成功检测了在不同环境相关剂量的砷暴露下细胞迁移发生的变化。这些数据为进一步采用划痕实验研究细胞迁移的分子机制及其在砷暴露下的改变提供了依据。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院少数族裔健康与健康差异研究所根据资助编号U54MD012388资助。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
II 级 A/B3 型生物安全柜Forma Scientific15201-816
丁腈手套Kimberly-Clark55082
水浴锅PrecisionModel 182
倒置显微镜LeicaQ080318
CPR 离心机Beckman349702
分析天平OhausI093 1125062111P
称量纸VWRH351125781212A
生物危害袋Fisherbran01-830A
水套式 CO2 培养箱Thermo Scientific309739-31053
Hanks 平衡盐溶液Gibco14175-095
DMEM 高糖培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）Gibco10566-016
胎牛血清Gibco26140-079
自动移液器Drummond140685
p200 移液枪Gilson
p20 移液枪Gilson
分液器Fisher ScientificD59707
台盼蓝染液Gibco15250-061
T75 组织培养瓶Corning430725U
15 mL 圆底离心管Fisherbrand05-539-5
50 mL 圆底离心管VWR21008-178
5 mL 移液管Fisherbrand13-678-11D
10 mL 移液管Fisherbrand13-678-11E
组织标记笔Securline92167
擦拭纸Kintech34155
70% 乙醇Fisher63-67-0
非滤芯移液器吸头Fisherbrand16160210
漂白剂Great Value220-04
96 孔板Falcon353915
冻存管架Nalgene5030-0505
血细胞计数板Gizmo SupplyB00SCOGY56
TrypLE Express 消化液Gibco12605-028
离心管架n/an/a
12 孔板Corning3598
废液杯n/an/a
1 mL 移液管Fisherbrand13-678-11B
直边尺n/an/a
人新生儿真皮成纤维细胞（hDFn）批号：1734, 2902106-05n
Rstudio 统计分析软件版本：3.5.1
Image JNIH版本：1.8.0_112

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细胞迁移砷暴露伤口愈合真皮成纤维细胞细胞培养显微成像图像分析伤口闭合百分比环境毒理学
体外 划痕实验用于演示砷对皮肤细胞迁移的影响
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