用于膜片钳研究的接触气泡双层脂质膜实验

摘要

本文介绍了一种利用接触气泡双层法形成脂双层的实验方案。将水相气泡吹入有机溶剂中，在水-油界面处形成单层膜。通过操纵两根移液管使气泡对接，从而形成双层膜结构。

摘要

脂质双分子层为离子通道的功能研究提供了一个独特的实验平台，能够在不同膜脂组成条件下考察通道与膜之间的相互作用。其中，液滴界面双层膜技术已获得广泛应用；然而，较大的膜面积限制了低电学背景噪声的记录。我们建立了一种接触气泡双层膜（CBB）方法，结合了平面脂质双层和膜片钳技术的优势，例如可调节脂质组成以及调控双层膜力学特性。利用常规膜片钳实验的装置，可直接开展基于CBB的实验。简言之，将玻璃移液管中的电解质溶液吹入有机溶剂相（十六烷）中，并通过维持移液管内压力以获得稳定大小的气泡。气泡表面会自发形成一层脂质单层膜（纯脂质或混合脂质），该单层膜来源于气泡中的脂质体。随后，使两个玻璃移液管尖端处带有脂质单层膜的气泡（直径约50 µm）对接，从而形成双层膜。将含有通道蛋白的重组脂质体引入气泡后，通道可插入双层膜中，实现单通道电流记录，其信噪比可与膜片钳记录相媲美。可方便地构建具有不对称脂质组成的CBB。通过吹出原有气泡并形成新的气泡，可反复更新CBB。此外，可对CBB施加多种化学和物理扰动（例如，膜灌流和双层膜张力）。本文中，我们介绍了CBB形成的基本操作流程。

引言

对于离子通道而言，细胞膜不仅是起支撑作用的材料，更是产生离子流的合作伙伴。从功能上看，细胞膜是一种电绝缘体，离子通道嵌入其中，且所有细胞膜都具有静息膜电位。传统上，通过外部电路施加一个任意的膜电位，以测量通道中的电流。在不同膜电位下对离子流进行的这种定量评估揭示了这些通道的分子特性，例如其离子选择性通透性和门控功能^1,2。用于离子通道功能研究的膜平台可以是细胞膜，也可以是脂双层膜。历史上，单通道电流记录最初是在脂双层膜上实现的^3,4，随后相关技术被发展应用于细胞膜，例如膜片钳技术（图1A）^5,6。自此以后，这两种技术朝着不同的应用方向分别发展（图1）^7,8。

膜脂质和双层膜因其在支持通道蛋白结构和功能方面的作用，目前正成为研究的焦点。因此，能够便捷地改变双层膜中....

方案

1. 制备脂质体

1. 分散磷脂（例如，10 mg 粉末）溶于氯仿，配制成所需浓度（例如，10 mg/mL。
2. 蒸发氯仿。
   1. 将磷脂溶液置于圆底烧瓶中，并将其固定在旋转蒸发仪上（参见 材料表) 连接到一个 N₂ 气瓶。在N₂气氛下旋转烧瓶₂ 室温下减压旋转蒸发至形成一层薄薄的磷脂膜（约30分钟后）。
   2. 将敞口烧瓶放入连接真空泵的干燥器中。启动真空泵，抽真空数小时，以彻底除去氯仿。
3. 向烧瓶中加入适量电解质溶液，悬浮磷脂，制备成浓度为2 mg/mL的磷脂悬浮液。
4. 使用浴式超声仪对悬浮液超声处理数十秒（参见 材料表以获得多层囊泡（MLV）悬液。
5. 制备含有离子通道蛋白的蛋白脂质体时，将蛋白溶液（使用适当去垢剂溶解的蛋白；体积占比不超过2%）加入MLV悬浮液中，并使用水浴超声仪超声数秒。

2. 准备大口径玻璃移液管

1. 将玻璃毛细管安装至拉针仪上，通过两步拉制法制备具有细长锥形尖端的微电极。
2. 将微电极置于显微成型仪上，使微电极尖端接触铂丝，在锥形部位进行接触，该部位直径为 30 至 50 µm。
3. 短暂加热....

结果

典型的CBB直径为50 µm（图5、6），在十六烷中的特异性膜电容为0.65 µF/cm²。气泡大小可通过气泡内压力进行任意调控。当需要较小气泡以实现低噪声记录时，尖端直径也应相应减小。例如，当气泡直径为50 µm时，尖端直径应为30 µm。

CBB形成后，水溶液或脂质体中的通道分子在数分钟至数十分钟内自发插入双分子层。在施加膜电位的条件下，通过电流幅度的逐步增加可确认通道的插入（图7）。与传统的PLB和DIB系统相比，较小的膜面积（<1,000 µm²）显著提高了电信号的信噪比。

记录电流可一直持续至膜破裂且两个气泡融合为止。可反复吹出.......

讨论

CBB 法形成脂双层的原理基于由单层膜包被的油中水滴²⁰从技术上讲，构建CBBs的步骤较为简单，尤其对于熟练操作玻璃微电极的膜片钳研究人员而言。当配备两个带有微注射器的微电极操纵器时，膜片钳的电生理装置可直接用于CBB实验。另一方面，由于CBB是传统PLB的延续，而传统PLB已积累了大量的物理化学知识⁸，这一背景知识以及表面化学的相关知识³⁸ 有助于CBB的操作与操控。CBB能够调节化学组成和物理状态，为研究通道-膜相互作用提供了一个多功能平台⁶¹在CBB中，排列在气泡表面的脂质能够自由地跨过单层相与双层叶之间的边界扩散，我们已开发出双层附着-脱离和膜灌流等技术⁴⁵我们已将CBBs扩展用于 体外 通道蛋白合成，其中通道合成在气泡中进行，新合成的通道蛋白在膜电位作用下自发转移至双层膜，同时从KcsA DNA转录/翻译启动时起追踪KcsA通道的新生功能^.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
豆蔻酰卵磷脂（L-α-磷脂酰胆碱，IV-S型）	Sigma-Aldrich	P3644
模数转换器	Molecular Devices	Digidata1550A
Ag/AgCl电极	Warner Instruments	64-1317
超声波清洗仪	Branson	M1800H-J
相机	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
玻璃毛细管	Harvard Apparatus	30-0062
HEPES	Dojindo	342-01375
打孔载玻片	Matsunami Glass	S339929
倒置显微镜	Olympus	IX73
隔振台	Herz	TDI-86LA(Y)2
微量注射器	Narishige	IM-11-2
显微操作器	Narishige	EMM
微电极拉制仪	Narishige	MF-830
微量移液器夹持器
正十六烷	Nacalai	07819-32
膜片钳放大器	HEKA	EPC800
移液管拉制仪	Sutter Instrument Co.	P-87
POPC（1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酸胆碱）	Avanti Polar Lipids	850457
POPE（1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 ）	Avanti Polar Lipids	850757
POPG（1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)）	Avanti Polar Lipids	840457
氯化钾	Nacalai	28514-75
旋转蒸发仪	Iwaki	REN-1000
琥珀酸	Nacalai	32402-05
真空泵	Buchi	V-100