本文介绍了一种用于定量活细胞中线粒体或溶酶体的强大方法。通过将特异性针对溶酶体或线粒体的荧光染料与荧光标记的表面标志物抗体相结合，利用多色流式细胞术，可在混合细胞群体（例如从组织样本中分离的原代细胞）中实现对这些细胞器的定量分析。
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摘要
摘要
T细胞利用不同的代谢程序来满足其在分化和增殖过程中的功能需求。线粒体是负责为细胞提供能量的关键细胞器；然而，过多的线粒体会产生过量活性氧（ROS），可能导致细胞死亡。因此，线粒体的数量必须持续调整以适应细胞的需求。这种动态调控部分依赖于溶酶体的功能，溶酶体可清除多余的或受损的细胞器及大分子物质。因此，细胞内线粒体和溶酶体的含量是评估细胞代谢调节状态的关键指标。随着细胞器探针的发展，现已可获得多种经过充分验证的特异性染料，用于标记细胞内的溶酶体和线粒体。多色流式细胞术是分析细胞表型的常用工具，并可与其他检测方法联合使用。本文详细介绍了一种将细胞器特异性染料与细胞表面标志物染色相结合，在流式细胞仪上检测不同T细胞群体中溶酶体和线粒体含量的实验方案。
引言
T细胞的活化与增殖是启动有效免疫应答的关键步骤。近年来的研究进展表明，细胞代谢与T细胞的发育及其功能密切相关。例如，初始T细胞主要依赖氧化磷酸化（OXPHOS）来满足其在次级淋巴器官间循环时的能量需求。在活化后，初始T细胞会经历剧烈的代谢重编程，包括诱导有氧糖酵解以增加ATP的生成，从而满足细胞分化和增殖过程中巨大的代谢需求。无法满足这些代谢需求的细胞将通过凋亡途径死亡1,2。在代谢重编程过程中，线粒体发挥着重要作用，因为线粒体是细胞内主要负责ATP生成以提供能量的细胞器，且在T细胞发育和活化过程中的代谢转换阶段，细胞内线粒体含量会发生动态变化3。然而，过量或受损线粒体的积累会产生过多的活性氧（ROS），从而损伤脂质、蛋白质和DNA，并最终导致细胞死亡4。
代谢改变所产生的过量或受损线粒体通过一种特化的自噬形式被清除5，称为线粒体自噬。线粒体被自噬体包裹后与溶酶体融合，进而被降解。线粒体与溶酶体之间的这种密切互作已引起广泛关注6,7例如，氧化应激会刺激线粒体形成线粒体来源囊泡（MDVs），这些囊泡以磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）诱导的假定激酶1（PINK1）和Parkin（一种E3泛素连接酶）依赖的方式被靶向输送至溶酶体进行降解8还发现线粒体自噬对于米色脂肪细胞向白色脂肪细胞的转化至关重要9,10更重要的是，溶酶体不仅是降解的场所，同时也是细胞信号传导的调控者。由于酶缺乏导致底物过度积累，会通过破坏溶酶体膜通透性引起溶酶体功能障碍，并影响Ca2+ 稳态11T细胞在溶酶体酸性脂肪酶（LAL）缺陷中的功能异常12 或溶酶体代谢物转运蛋白敲除小鼠模型13 进一步表明溶酶体在维持T细胞稳态中的重要性。线粒体和溶酶体均为细胞代谢调控中不可分割的组成部分。因此，细胞线粒体含量的检测已成为评估T细胞代谢状态与功能状态的关键指标。
常用于定量检测细胞线粒体或溶酶体含量的实验方法包括免疫印迹、电子显微镜、免疫荧光（IF）染色以及线粒体DNA拷贝数的PCR分析14,15,16。尽管免疫印迹可对不同样本间的蛋白质水平进行定量比较，而电子显微镜或免疫荧光显微镜可观察这些细胞器的形态学特征17，但这些方法存在一定的技术局限性。例如，获取足够数量的高倍率、高分辨率细胞图像，或对数十个样本中某一蛋白的表达水平进行比较，均耗时较长，因此这些方法被视为通量较低的技术。此外，这些方法仅适用于均质的细胞群体（如细胞系），而不适用于由多种细胞类型组成的组织样本。
对于稀有细胞群体而言，应用这些检测方法也十分困难，因为其所需的最低细胞数量通常在106到108之间，难以满足。最后，细胞在检测过程中通常会被裂解或固定，导致无法与其他方法联用以获取更多后续信息。与传统方法相比，基于荧光的流式细胞术具有相对较高的通量——可同时分析和采集由混合细胞群体组成的样本中所有细胞的信息。此外，可在单个细胞上检测超过10个参数，并根据目标表型对细胞进行分选，用于后续检测。已有反应性荧光探针被用于在活细胞中标记溶酶体和线粒体，并可通过流式细胞术进行检测18,19。这些细胞器特异性探针具有细胞膜通透性，且具备特定的理化性质，使其能够富集于特定的亚细胞结构或细胞器中。这些探针还提供多种荧光形式，便于用于多色分析。
本方案详细描述了如何将表面标志物染色与溶酶体或线粒体特异性染料相结合，以标记活细胞中的溶酶体或线粒体。该方法特别适用于来源于原代组织和器官的样本，这类样本通常由异质性细胞群体组成。研究人员可通过细胞表面标志物的表达来鉴定目标细胞群体，并利用细胞器特异性染料特异性地检测这些细胞内的溶酶体或线粒体含量。本文中，我们展示了通过流式细胞术分析脾脏主要T细胞亚群中溶酶体或线粒体数量的详细实验流程。
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方案
本实验方案已获中国台湾阳明大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。
1. 从淋巴器官制备淋巴细胞悬液
- 采用经批准的方法处死小鼠，例如 CO2 在透明亚克力吸入室中吸入麻醉，随后进行颈椎脱位以确保死亡。
注意：保持 CO 的流速2 每分钟以20%的置换率置换舱内气体，压力不超过5 psi（磅/平方英寸）。小鼠通常在2-3分钟内失去意识。维持CO2 动物停止呼吸后，至少继续灌流1分钟（总时长5-7分钟）。 - 将小鼠仰卧置于一块干净的板上（例如 一块聚苯乙烯塑料板）并用胶带固定四肢，用70%乙醇冲洗。
- 用11厘米的解剖剪剪开腹腔以收获脾脏（脾脏位于胃下方和左肾上方）。用镊子取出脾脏，并清除结缔组织（必要时可使用剪刀）。
- 用解剖剪从两侧剪开膈肌和肋骨。用镊子抬起胸骨以暴露整个胸腔。用剪刀小心地将胸腺与周围组织分离，并在用PBS润湿的纸巾上清除残留的结缔组织。
- 使用注射器推杆在含有5 mL预冷FACS缓冲液（PBS中添加2%胎牛血清（FBS）和1 mM EDTA）的6 cm培养皿中机械解离组织。将单细胞悬液转移至15 mL离心管中；用额外的2 mL FACS缓冲液冲洗6 cm培养皿，并将洗涤液合并至细胞悬液中。
- 离心细胞悬液（300 × g，4 °C，5 分钟），弃上清。用 2 mL 氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液（155 mM NH₄Cl，10 mM KHCO₃，0.1 mM EDTA）重悬沉淀。4Cl, 10 mM KHCO₃3 和 0.1 mM Na2EDTA）在室温（RT）下孵育1分钟以裂解红细胞。向细胞悬液中加入10 mL FACS缓冲液以中和ACK缓冲液。
- 将细胞悬液离心（300 × g，4 °C，5 分钟），弃上清液。用 5 mL 完全 RPMI 培养基（RPMI 1640 培养基，添加 44 mM NaHCO₃、25 mM HEPES、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素和 10% 胎牛血清）重悬细胞。3，10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），100 U/mL 青霉素，100 mg/mL 链霉素，2 mM L-谷氨酰胺，1 mM 丙酮酸钠，1% MEM 非必需氨基酸和 10% 胎牛血清（FBS）。
- 通过细胞筛（孔径70 µm）过滤细胞悬液，以去除细胞团块。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数。
2. 线粒体与溶酶体的定量分析
注意：请先进行细胞器特异性染料染色，因为这些染料的最佳染色条件是在 37 °C 下孵育。在此温度下，表面标志物染色会因抗体成帽和内化而显著减弱。
- 加入 1 x 106 将细胞转移至圆底FACS管中，以300 × g离心5分钟（4 °C），弃去上清液。
- 将探针储备液稀释至终工作浓度（100 nM MitoTracker Green 或 LysoTracker Green；下文中分别称为线粒体或溶酶体特异性染料） 在预热至37 °C的无血清培养基中。此为溶酶体或线粒体特异性染料的工作液。
注意：请测试多个浓度，包括制造商建议的工作浓度范围（本实验所用的线粒体特异性染料为 20 – 200 nM，溶酶体特异性染料为 50 – 75 nM），以获得最佳染色效率。选择已知对染色靶标表达良好的细胞群体例如 溶酶体）作为阳性对照（例如 人CD14+ 单核细胞）。根据阴性与阳性染色之间的良好分离程度以及细胞活性来选择工作浓度。 - 将细胞重悬于 100 µL 溶酶体或线粒体特异性染料工作液中，在 5% CO₂ 条件下孵育2 分别在37 °C培养箱中孵育15分钟或30分钟。
- 加入1 mL预冷的FACS缓冲液以终止反应。将细胞在300 × g、4 °C条件下离心5 min，弃上清液。细胞现可用于表面标志物染色。
3. 表面标志物染色
- 用 100 µL 预滴定的 2.4G2 杂交瘤上清液在冰上封闭 Fc 受体 10 分钟。加入 1 mL FACS 缓冲液洗涤细胞，并离心（300 × g，4 °C 下 5 分钟）。弃去上清液。
- 将细胞与 50 µL 预滴定的荧光标记抗体组合物在 FACS 缓冲液中混合，冰上孵育 20 分钟。避光操作。
注意：准备单色染色细胞，包含抗体组合中使用的所有荧光抗体，以及仅用细胞器特异性染料处理的细胞，用于设定流式细胞仪各荧光检测器的电压和补偿调节。同样，通过使用包含所有抗体但未用细胞器特异性染料染色的细胞制备荧光减一对照（FMO），作为背景对照。 - 加入 1 mL FACS 缓冲液洗涤细胞，离心（300 × g，4 °C 下 5 分钟）形成细胞沉淀。弃去上清液。
- 将细胞重悬于含 1 µg/mL 碘化丙啶（PI）的 300 µL FACS 缓冲液中，并立即在流式细胞仪上分析样品。
4. 流式细胞仪上的样本采集
- 打开计算机、流式细胞仪、FACS 数据采集软件以及根据仪器平台所需的其他附属设备。运行 PBS 约 1 分钟，以确保流动管路充满 PBS 和鞘液缓冲液。确保流动液流平稳。
- 打开新实验，根据制造商说明设置流式细胞仪参数（荧光检测器）。在采集每个样本前，使用70 µm细胞筛过滤细胞，并涡旋振荡以避免细胞团块和双联体形成。
- 制作前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）的散点图，分别代表细胞大小和颗粒度。优化FSC和SSC的电压，确保目标细胞出现在图中。制作FSC-A的散点图 与 FSC-W（或 FSC-H）并绘制单细胞门。
- 绘制每种荧光参数的点图。使用未染色细胞确定背景信号，并使用单色染色对照调整每种荧光参数的电压，以确保阳性与阴性细胞群体清晰可辨，并处于采集的动态范围之内。
- 所有电压设置完毕后，若有自动补偿功能则使用该功能，或利用未染色及单色染色对照样本手动调整补偿，以校正光谱重叠。将补偿参数应用于样本。
- 根据实验设置，对每个参数绘制点图并圈定门控区域。例如，FSC-A 与 FSC-H（或 FSC-W）用于排除双联体，随后使用 FSC-A 与 SSC-A 用于淋巴细胞设门；SSC-A 与 PI（活细胞）和 CD4 与 CD8（图1).
- 收集足够的事件数（总细胞数），以便在不同细胞群体间进行有意义的比较。通常，目标群体中至少需要获得 1,000 个事件20.
- 所有样本采集完成后，将流式数据导出，以便使用流式细胞术分析软件进行分析。将实验保存为模板，以保留细胞仪的设置和参数，供将来类似实验使用。
5. 数据分析
注意：有许多工具可用于分析流式细胞术数据，包括商业软件和免费软件。流式细胞仪的采集软件也可用于数据分析。此处我们以 FlowJo 为例。
- 启动软件，将 FCS 文件拖入工作区。单击样本以打开图形窗口。通过单击 X 轴和 Y 轴来选择要在 X 轴和 Y 轴上显示的参数。使用工具栏根据细胞群体差异表达的标志物或定义的表型绘制门控区域。
- 按照图1所示，为每个参数添加门控。将门控拖动至工作区中的所有样本，以实现一致的门控设置。
- 将图拖动至布局编辑器中，以创建图形报告。
- 在图形窗口中单击统计按钮（Σ），选择"均值"及相应参数（例如用于检测细胞器特异性染料的通道），以显示每个目标群体的平均荧光强度（MFI）。然后单击"添加"。
- 单击表格编辑器图标，并将 MFI 拖入表格编辑器以生成统计报告。保存为 Excel、Text 或 CSV 文件，以计算 ΔMFI（ΔMFI = 细胞器特异性染料的 MFI - FMO 的 MFI）。
注意：切勿对使用不同流式细胞仪设置（电压、荧光通道或补偿）获取的样本进行 MFI 计算。不同实验条件下获得的数据比较无意义且存在偏差。 - 导出工作区中的所有数值以及布局编辑器中的图表，用于制作表格和图像。
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结果
脾脏和胸腺中主要T细胞亚群的鉴定
简而言之，来自脾脏和胸腺的单细胞悬液经红细胞裂解后，用2.4G2上清液孵育，随后使用荧光标记抗体对细胞器特异性染料和表面标志物进行染色（表1）。胸腺细胞的发育进程可通过针对共受体CD8和CD4的抗体来描述。最不成熟的胸腺细胞不表达CD4或CD8，称为双阴性（DN）细胞。随后，它们上调CD4和CD8的表达，转变为双阳性（DP）细胞。最后，它们下调CD4或CD8的表达，成为成熟的单阳性（SP）细胞，准备离开器官。在T细胞发育的最早阶段，当细胞尚未表达共受体CD4和CD8时，可根据CD44和CD25的表达进一步分类。最早的前体细胞为CD44+ CD25-（DN1）；随后开始表达CD25，转变为CD44+CD25+（DN2）细胞；之后，细胞下调CD44，成为CD44
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讨论
本方案结合细胞器特异性染料与表面标志物染色，用于定量不同T细胞群体中线粒体或溶酶体的数量。该方法旨在克服传统方法（如电子显微镜和免疫印迹分析）对细胞数量和均一性的限制，特别适用于稀有细胞群体的分析，以及同时检测多种细胞类型。
该实验步骤的持续时间以及孵育温度是本方案中最关键的因素。正确的细胞器标记需要对细胞器特异性染料进行精确的滴定。细胞也必须严格保持在冰上，以提高细胞活力，并避免抗体封端和内化。此外，这些细胞器特异性染料的荧光信号对光照和温度变化敏感。因此，在染色步骤完成后立即进行样本分析至关重要。我们 consistently 能够在2小时内完成整个实验。
由于本实验方案依赖流式细胞仪的多色荧光检测能力来评估细胞内组分，采集参数设置（例如 PMT电压）以及光谱重叠的补偿（荧光信号溢出至相邻检测通道）会显著影响信号强度。当用于鉴定目标细胞类型的表面标志物超过六个时，这一问题尤为突出。在此情况下，设计多色流式细胞术实验的经验对于高质量数据的获取至关重要。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本方案的开发得到了中国台湾科技部（MOST）NSC103-2320-B-010-002-MY2 和 MOST104-2628-B-010-002-MY4 项目资助，授予 C.L. Hsu。C.W. Wei 获得国立阳明大学微生物与免疫学研究所优秀论文奖。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 cm 直齿有齿镊（直头带齿） | Dimeda | ||
| 11 cm 眼科剪（直头尖/尖刃） | Dimeda | ||
| 15 mL 离心管 | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL 注射器 | TERUMO | ||
| 6 cm 培养皿 | α-plus | ||
| 70 µm 尼龙细胞滤网 | SPL Lifesciences | 93070 | |
| 氯化铵（NH4Cl） | Sigma | A9434 | |
| 抗小鼠 CD25 | Biolegend | 102007 | 克隆号：PC61 |
| 抗小鼠 CD4 | Biolegend | 100453 | 克隆号：GK1.5 |
| 抗小鼠 CD44 | Biolegend | 103029 | 克隆号：IM7 |
| 抗小鼠 CD62L | Biolegend | 104407 | 克隆号：MEL-14 |
| 抗小鼠 CD8 | Biolegend | 100713 | 克隆号：53-6.7 |
| 抗小鼠 TCRβ | Biolegend | 109233 | 克隆号：H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5 mL 聚苯乙烯圆底管（FACS 管） | BD Biosciences | 352052 | |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| 羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） | Sigma | H4034 | |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM 非必需氨基酸（100X） | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Gibco | 15140122 | |
| 碳酸氢钾（KHCO3） | J.T.baker | 298-14-6 | |
| 碘化丙啶溶液 | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 培养基（粉末） | Gibco | 31800089 | |
| 碳酸氢钠（NaHCO3） | Sigma | S5761 | |
| 丙酮酸钠（100 mM） | Gibco | 11360070 |
参考文献
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