基于多色流式细胞仪的 t 细胞线粒体和溶酶体的定量

Summary

本文说明了一种对活细胞中线粒体或溶酶体进行量化的有力方法。将溶酶体或线粒体特异性染料与针对表面标记物的荧光共轭抗体结合使用, 可以通过使用多色流式细胞术。

Abstract

t 细胞利用不同的代谢程序来满足它们在分化和增殖过程中的功能需求。线粒体是负责提供细胞能量的关键细胞成分;然而, 过量的线粒体也会产生活性氧 (ros), 从而导致细胞死亡。因此, 线粒体的数量必须不断调整, 以适应细胞的需要。这种动态调节在一定程度上是通过溶酶体的功能实现的, 溶酶体去除了表面损伤的细胞器和大分子。因此, 细胞线粒体和溶酶体含量是评估细胞代谢调节的关键指标。随着细胞器探针的发展, 有良好特征的溶酶体或线粒体特异性染料已成为可用的各种格式, 以标记细胞溶酶体和线粒体。多色流式细胞术是一种常用的工具来描述细胞表型, 并具有与其他检测集成的能力。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 如何结合有机特定染料与表面标记染色, 以测量流式细胞仪上不同 t 细胞群中的溶酶体和线粒体的数量。

Introduction

t 细胞的激活和增殖是成功免疫反应的关键步骤。最近的进展表明, 细胞代谢与 t 细胞的发育和功能密切相关。例如, 天真的 t 细胞在很大程度上依赖氧化磷酸化 (oxphos) 来满足继发性淋巴器官循环过程中的能量需求。激活后, 天真的 t 细胞会进行剧烈的代谢重新编程, 包括诱导好氧糖酵解, 以增加 atp 的产生, 并满足细胞分化和增殖过程中的巨大代谢需求。未能通过代谢的细胞死于细胞凋亡^1,2。在代谢重新编程过程中, 线粒体发挥着重要作用, 因为它们是主要负责产生 atp 的细胞器, 为细胞提供能量, 而细胞线粒体含量在代谢开关中波动在整个 t 细胞的发育和激活^过程中3。然而, 多余或受损的线粒体的积累会产生多余的 ros, 损害脂质、蛋白质和 dna, 并最终导致细胞死亡

代谢改变产生的过度或受损的线粒体被一种特殊形式的自体吞噬⁵(称为有丝分裂) 去除。线粒体被自体染色体包裹, 然后与溶酶体融合降解。线粒体和溶酶体之间的这些密切联系引起了人们的极大兴趣。例如, 氧化应激刺激线粒体形成线粒体衍生囊泡 (mdv), 其靶向溶酶体, 以便在磷酸酶和紧张素同源体 (pten) 诱导的假定激酶 1 (pink1) 和副蛋白 (e3 泛素聚类酶) 中降解依赖方式⁸。研究还发现, 有丝分裂是必不可少的甜菜到白色的脂肪细胞过渡^9,10。更重要的是, 溶酶体不仅是一个降解室, 也是细胞信号的调节剂。酶缺乏导致的基质积累过多, 导致溶酶体功能障碍, 破坏溶酶体膜通透性, 并影响 ca^{2 +}稳态¹¹。溶酶体酸脂肪酶 (lal)¹²或溶酶体代谢物转运蛋白敲除小鼠模型¹³的 t 细胞功能缺陷进一步显示溶酶体在维持 t 细胞稳态中的重要性。线粒体和溶酶体都是细胞代谢调节不可分割的部分。因此, 细胞线粒体含量的测定已成为评价 t 细胞代谢和功能状态的重要指标。

常用于量化细胞线粒体或溶酶体的内容包括免疫印迹、电子显微镜、免疫荧光 (if) 染色和线粒体 dna 拷贝数 14, 15 的 pcr 分析^{, 16}. 虽然免疫印迹可以定量地比较不同样本的蛋白质水平, 电子或 if 显微镜可以直观地显示这些细胞器¹⁷的形态特征, 但这些检测存在一定的技术缺陷。例如, 获取足够数量的具有高放大倍率和分辨率的细胞图像, 或比较几十个样本中蛋白质的表达水平, 使这些检测被认为是低吞吐量的方法, 是非常耗时的。此外, 这些检测只能应用于同质细胞群, 如细胞系, 而不能应用于由混合群体组成的组织样本。

同样很难将这些检测方法应用于罕见的人群, 因为对这些人群来说, 从 10 6 到 10^{8 的}最低细胞数量的要求是不可能满足的。最后, 细胞通常在过程中被裂解或固定, 使其与提取进一步信息的其他方法不兼容。与传统方法相比, 基于荧光的流式细胞仪具有相对较高的吞吐量--可以同时分析和收集混合细胞群样本中所有细胞的信息。此外, 可以检测同一细胞上的10个以上的参数, 并根据所需的表型对细胞进行排序, 以便进一步检测。反应荧光探针已被用来标记溶酶体和线粒体在活细胞中, 可以通过流式细胞仪检测 18^,19。这些特定于细胞的探针具有细胞渗透性, 具有物理化学特性, 使它们能够集中在特定的亚细胞位置或细胞器。方便地, 这些探头有各种荧光格式, 从而使其能够应用于多色分析。

该协议详细介绍了如何将表面标记染色与溶酶蛋白或线粒体特异性染料结合起来, 以标记活细胞中的溶酶体或线粒体。这对于从主要组织和器官中产生的样本尤其有用, 这些组织和器官通常由异质细胞群组成。研究人员可以通过其表面标记表达来识别感兴趣的细胞群, 并通过这些细胞中的有机细胞特异性染料专门测量溶酶体或线粒体含量。在这里, 我们演示流式细胞仪分析的详细过程, 评估溶酶体或线粒体质量的主要脾 t 细胞亚群。

Protocol

这里描述的小鼠组织收获程序已获得国立阳明大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。

1. 淋巴器官淋巴细胞悬浮液的制备

1. 通过一种经批准的方法对小鼠进行安乐死 , 例如在透明的丙烯酸室吸入 co2, 然后进行宫颈脱位, 以确保死亡。
   注: 将 co2 的流速保持在室内每分钟20% 的位移, 并且不高于 5 psi (每平方英寸磅)。鼠标需要2-3分钟才能失去知觉。在动物停止呼吸后至少保持1分钟的二氧化碳流量 (总体为 5-7分钟)。
2. 将鼠标放在清洁的木板上 (例如聚苯乙烯塑料板), 并用胶带固定四肢。用70% 乙醇冲洗。
3. 要收获脾脏, 用11厘米的解剖剪刀切开腹腔 (脾脏在胃部下方和左肾上方)。用钳子取下脾脏, 并从结缔组织中清洗 (必要时使用剪刀)。
4. 为了收获胸腺, 用解剖剪刀从两侧切开隔膜和肋骨笼。使用钳子抬起胸骨, 露出整个胸腔。用剪刀将胸腺与周围组织仔细分离, 并在用 pbs 润湿的纸巾上取出残留的结缔组织。
5. 用注射器柱塞在含有5毫升冰凉流式细胞仪缓冲液 (pbs 补充2% 的胎牛血清 (fbs) 和 1 mm edta) 的6厘米盘中机械分离组织。将单细胞悬浮液转移到15-ml 离心管中;用额外的2毫升流式细胞仪缓冲液清洗6厘米的盘状, 并将清洗与细胞悬浮液结合使用。
6. 离心细胞悬浮液 (300 x 克, 4°c 时 5分钟), 并丢弃上清液。用2毫升的氯化铵钾 (ack) 裂解缓冲液 (155 mm nh4 cl_、10 mm khco₃和 0.1 mm na 2 edta₎重新悬浮颗粒 1分钟, 使红血球裂解。通过向单元格悬浮液中添加 10 ml 流式细胞仪缓冲区来中和 ack 缓冲区。
7. 离心细胞悬浮液 (300 x 克, 4°c 时 5分钟), 并丢弃上清液。在完整 rpmi 介质的5毫升中重新悬浮细胞 (rpmi 1640 培养基, 补充 44 mm nahco₃, 10 mL 4-(2-羟乙基)-1-吡嗪磺酸 (hepes), 100 u/ml 青霉素, 100 mgml 链霉素, 2 mm l-谷氨酰胺, 1 mm 钠丙酮酸,1% mem 非必需氨基酸和 10% fbs)。
8. 通过细胞过滤器 (孔径 70μm) 过滤细胞悬浮液, 以去除细胞团块。用血细胞计或自动细胞计数器计数细胞。

2. 线粒体和溶酶体的定量

注: 首先进行有机染料染色, 因为这些染料的最佳染色条件是在37°c 孵育。由于在该温度下存在抗体封盖和内化, 表面标记染色可显著降低。

1. 在圆底流式细胞仪管、离心机管 (300 x 克, 4°c 时 5分钟) 和丢弃上清液中加入 1 x 10 6个细胞。
2. 将探针库存溶液稀释到预热37°c 无血清培养介质中的最终工作浓度 (100 nm mitochondria-克·格林或 lysotracker green; 以下分别为线粒体或溶酶原染料)。这是溶酶体或线粒体特异性染料的工作解决方案。
   注: 测试多种浓度, 包括制造商建议的工作浓度范围 (线粒体特异性染料为 20-200 nm, 此处使用的溶酶原染料为 50-75 nm), 以获得最佳染色效率。选择已知具有良好表达染色靶点 (如溶酶体) 作为阳性对照 (如人类 cd14⁺单核细胞) 的细胞群。选择工作浓度的基础上, 在良好的分离的消极和积极的染色, 以及良好的细胞活力。
3. 将细胞重新复制100μl 的溶酶或线粒体特异性染料工作溶液, 并在37°c 下的 5% co2 孵化器中孵育 15分钟或30分钟。
4. 加入1毫升的冰凉流式细胞仪缓冲液来停止反应。颗粒细胞通过离心 (300 x 克, 在4°c 下 5分钟) 和丢弃上清液。细胞现在已经准备好进行表面标记染色。

3. 表面标记染色

1. 块 fc 受体与100μl 的预滴定 2.4 g2 杂交体上清液在冰上10分钟用1毫升的流式细胞袋缓冲液和离心机 (300 x g, 在4°c 下 5分钟) 清洗细胞。放弃上清液。
2. 用50μl 预滴定荧光结合抗体组合在冰上的 facs 缓冲液中培养细胞 20分钟, 避免发光。
   注: 准备单个彩色染色细胞, 其中包括抗体组合中存在的所有荧光抗体, 以及仅使用特定于组织的染料处理的细胞, 以设置每个荧光探测器的电压并在流量上进行补偿调整细胞仪。同样, 准备荧光 minus one (fmo) 作为背景控制, 使用细胞染色的所有抗体, 但没有染色的有机特异性染料。
3. 通过离心 (300 x g, 4°c 时 5分钟) 加入1毫升的流式细胞袋缓冲液和颗粒清洗细胞。放弃上清液。
4. 将含有1μgml 碘化物 (pi) 的流式细胞库中的细胞重新移植, 并立即在流式细胞仪上分析样品。

4. 流式细胞仪样本采集

1. 根据机器平台, 打开计算机、流式细胞仪、流式细胞仪采集软件和任何其他辅助设备。运行 pbs 约 1分钟, 以确保流线充满 pbs 和护套缓冲区。确保流流平稳运行。
2. 打开新的实验, 并根据制造商的指示选择细胞仪参数 (荧光探测器)。过滤细胞通过70微米的细胞过滤器和涡旋之前, 获取每个样品, 以避免团块和双块形成。
3. 制作前向散射 (fsc) 和侧向散射 (ssc) 的点图, 分别表示单元格大小和粒度。优化 fsc 和 ssc 的电压, 以确保感兴趣的细胞出现在图中。制作 fsc-a与fsc-w (或 fsc-h) 的点图, 并为单个单元格绘制一个门。
4. 制作每个荧光参数的点图。使用未染色的电池来确定背景信号, 并使用单一的彩色染色控制来调整每个荧光参数的电压, 以便在动态采集范围内清楚地区分正极和负细胞群。
5. 在设置了所有电压后, 请使用自动补偿 (如果可用), 或手动调整补偿与未染色和单一彩色染色控制, 以纠正光谱溢出。将补偿应用于样品。
6. 根据您的实验设置, 绘制每个参数的点图并绘制闸门。例如, fsc-a vs . fsc-h (或 fsc-w) 排除双人, 其次是 fsc-a vs. ssc-a 用于淋巴细胞门控;ssc-a vs. pi (活单元) 和 cd4 vs. cd8 (图 1).
7. 收集足够多的事件 (细胞总数), 以便在人群之间进行有意义的比较。通常情况下, 在有关人口中至少需要获得 1 000个事件,²⁰。
8. 采集所有样品后, 利用流式细胞仪分析软件对出口流数据进行分析。将实验另存为模板, 以保留细胞仪设置和参数, 以便将来应用于类似的实验。

5. 数据分析

注: 有许多工具来分析流式细胞测量数据, 包括商业软件和自由软件。流式细胞仪的采集软件也可以用于数据分析。在这里, 我们用 flowjo 作为一个例子。

1. 启动软件并将 fcs 文件拖到工作区中。单击示例以打开图形窗口。通过单击 x 轴和 y 轴, 选择要在 x 和 y 轴上显示的参数。使用工具栏根据细胞群的不同表达标记或定义的表型绘制门。
2. 为每个参数添加闸门, 如图 1所示。将门拖动到工作区中的所有示例, 以便它们获得相同的门控。
3. 将图形拖到布局编辑器以创建图形报告。
4. 通过单击图形窗口中的统计按钮 () 并选择 "平均值" 和相应的参数 (例如用于检测特定于组织的染料的通道), 显示每个感兴趣人群的平均荧光强度 (mfi)。然后点击 "添加"。
5. 单击表编辑器图标, 然后将 mfi 拖到表格编辑器以创建统计报告。另存为 excel、text 或 csv 文件, 以将增量 mfi (mfi) 计算为 mfi (特定于组织的染料)-mfi (fmo)。
   注: 不要在不同细胞仪设置 (电压、荧光通道或补偿) 采集的样品之间计算 mfi。比较不同设置的实验得出的值是无意义和有偏差的。
6. 从布局编辑器中导出工作区中的所有值和图形, 以便制作表格和图形。

Results

脾脏和胸腺主要 t 细胞亚群的鉴定

总之, 脾脏和胸腺的单细胞悬浮液由红细胞裂解, 用 2.4 g2 上清液孵育, 然后用荧光共轭抗体进行有机染料和表面标记染色 (表 1)。胸腺细胞的发育过程可以用抗体来描述共同受体 cd8 和 cd4。最不成熟的胸腺细胞不表达 cd4 或 cd8, 被称为双阴性 (dn)。然后, 它们上调 cd4 和 cd8, 并成为双阳性 (dp)。最后, 他们向下调节 cd4 或 cd8, 并成为成熟的单个阳性 (sp) 细胞准备离开器官。t 细胞发育的最初阶段, 当细胞不表达共同受体 cd4 和 cd8 时, 可以根据 cd44 和 cd25 表达进一步分类。最早的祖细胞是 cd44⁺ cd25-(dn1), 然后他们开始表达 cd25, 成为 cd44 ⁺cd25 + (dn2) 细胞.之后, 细胞向下调节 cd44, 成为 cd44-cd25⁺ (dn3) 细胞, 最后, 它们向下调节 cd25 以及成为 cd44^-cd25^- (dn4) 细胞, 这些细胞正在表达 cd4 和 cd8 并成为 cd44.双阳性 (dp) 细胞。

在脾脏中, t 细胞可分为细胞毒性 cd8⁺和辅助 cd4^{+ t 细胞}。根据 cd62l 和 cd44 染色, 这两个群体可进一步分为天真的、效应器和记忆亚群。详细的门控策略如图 1所示。

不同 t 细胞亚群线粒体质量的定量

线粒体特异性染料被用来测量 t 细胞群中线粒体的数量。我们发现线粒体含量在 dn1 中最低, 在 dn2-dn3 达到峰值, 然后在 dn4 和 dp 胸腺细胞中略有下降, 在 cd4 和 cd8 粒细胞中甚至更低 (图 2a)。然而, cd4 或 cd8 sp 胸腺细胞的线粒体染色 mfi 高于脾 cd4 或 cd8 t 细胞 (图 2b)。这些观察表明, 在 t 细胞发育过程中, 线粒体含量波动较大, 未成熟的胸腺细胞的线粒体含量高于成熟的胸腺细胞, 而在富氧血液中循环的天真 t 细胞则更低线粒体质量。有趣的是, 线粒体含量的减少在 cd8 中比 cd4 t 谱系 (图 2b) 更为突出, t 细胞的激活进一步降低了它。在活化 t 细胞中, cd4⁺记忆 t 细胞的线粒体比效应体略多;然而, cd8⁺ t 细胞的情况正好相反: cd8⁺记忆 t 细胞在所有 t 细胞亚群中的线粒体质量最低 (图 2b)。

t 细胞不同亚群溶酶体含量的测定

使用溶酶原特异性染料, 我们观察到所有 t 细胞群体中溶酶体含量相对较低, 但可检测到, dn1 胸腺细胞中溶酶体的存在更为突出 (图 3a)。从 dn1 开始, 胸腺细胞亚群之间无显著性差异。在周围, 在记忆和效应细胞 cd8^{+ t 细胞}中发现的溶酶体数量相对较高。这种现象与以前的研究一致, 表明激活的 cd8⁺ t 细胞增加了他们的溶酶相关膜蛋白 1 (lamp-1)^21,22的表达, 反映出他们拥有溶酶体-细胞毒性颗粒 (图 3b)

图 1: 脾淋巴细胞和胸腺细胞的起动策略.细胞在 fsc/ssc 和 pi^上进行预控, 以获得活单片。(a)小鼠胸腺细胞总数被 cd4、cd8、cd44 和 cd25 染色。cd4 和 cd8表达式用于区分 cd4⁺cd8-sp、cd4-cd8 + sp、cd4⁺cd8⁺ dp 和 cd4-cd8-dn 子集. cd4-cd8-dn 子集进一步划分为 cd44⁺cd25-dn1、cd44 + cd25⁺dn2^、 cd44-cd25 + dn3 和 cd44-cd25-dn4亚群. (b)小鼠总脾细胞被 tcrβ、cd4、cd8、cd44 和 cd62l 染色。tcrβ⁺细胞被分离成 cd4 + 和 cd8^{+ t 细胞}, 进一步分为天真 (cd44-cd62l⁺)、记忆 (cd44⁺cd62l⁺) 和效应器 (cd44⁺cd62l)^-)人口。结果代表了n = 3-4 的三个独立实验。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 显示每个细胞群体线粒体染色的代表性直方图.在37°c 下, 用线粒体染料染色细胞 15分钟, 然后进行表面标记染色。采用流式细胞仪获得染色细胞的荧光信号, 并进行分析。(a) dn 和 dp 胸腺细胞的线粒体染色。(b) cd4sp 和 cd8sp 胸腺细胞线粒体染色和脾 t 细胞群染色。mfi = mfi (线粒体染色)-mfi (fmo)。实线红线表示线粒体染色, 实心蓝线表示 fmo 控制, 虚线表示每个人群线粒体染色的平均荧光强度。结果代表了n = 3-4 的三个独立实验。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:有代表性的直方图, 显示脾淋巴细胞和胸腺细胞中的溶酶体染色.在37°c 时, 用溶酶原染料对细胞进行30分钟染色, 然后进行表面标记染色。采用流式细胞仪获得染色细胞的荧光信号并进行分析。(a) dn 和 dp 胸腺细胞的溶酶体染色。(b) cd4sp 和 cd8sp 胸腺细胞和脾脏 t 细胞群的溶酶体染色。mfi = mfi (溶酶体染色)-mfi (fmo)。实心绿线表示溶酶体染色, 实心蓝线表示 fmo, 虚线表示每个人群中溶酶体染色的平均荧光强度。结果代表了 n = 5 的一个实验。请点击这里查看此图的较大版本.

表 1: 多色流式细胞仪面板设计.这里列出了染色混合物中的荧光和抗 bodiesicel细胞器染料的浓度。强烈建议在设置新的染色板时对每个抗体进行滴定和测试。

Discussion

该协议结合了有机特异染料和表面标记染色, 以量化不同 t 细胞群的线粒体或溶酶体的数量。该方法是为了克服细胞数量的限制和电子显微镜和免疫印迹分析等传统方法的同质性要求而开发的。它在分析稀有细胞群和同时检查多种细胞类型方面特别有用。

手术时间和孵化温度是该方案中最关键的因素。适当的细胞器标记需要对特定于细胞器的染料进行精确的滴定。细胞也应严格保持在冰上, 以提高活力, 避免抗体封盖和内化。此外, 这些特定于有机的染料的荧光容易受到光暴露和温度变化的影响。因此, 一旦染色程序完成, 立即对样品进行分析是非常重要的。我们一直能够在2小时内完成整个实验。

由于该协议依赖于通过流式细胞仪检测多色荧光的能力来评估细胞内的成分, 因此采集设置 (如 pmt 电压) 和频谱重叠的补偿 (溢出效应荧光到相邻通道) 会严重影响信号的强度。当识别相关细胞类型所需的表面标记增加到六个以上时, 这一点尤其重要。在这种情况下, 设计多色流式细胞术实验的经验对于高质量的数据采集变得非常重要。

免疫系统保护身体免受病原体的侮辱和感染, t 细胞激活在向其他免疫细胞提供必要信号方面发挥着关键作用。最近的研究表明, 不同的 t 细胞群体有独特的代谢程序, 线粒体和溶酶体的内容是代谢变化的关键指标。然而, 这种现象并不是 t 细胞所独有的。先天免疫细胞 (如巨噬细胞和树突状细胞) 的分化和激活也与它们的代谢状态 23^,24密切相关。该方案的优点是, 它可以通过使用针对特定系标记的抗体来适应任何感兴趣的细胞群。此外, 结合其他细胞特异性染料, 如 e-或 cyto-id, 它有可能评估不同类型的细胞器或细胞隔间。

这种线粒体或溶酶体定量方法的建立不仅有助于研究 t 细胞的代谢, 而且具有巨大的潜力, 可以为关注疾病环境中的代谢变化 (如癌症或癌症) 的代谢变化而受益。自身免疫性疾病^25,26。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Graefe 镊子（直和锯齿）	Dimeda
11 cm 鸢尾剪刀（直，带尖头/尖头）	Dimeda
15 mL 离心管	Thermo Fisher Scientific	339650
5 mL 注射器	TERUMO
6 cm 培养皿	α-plus
70 µm 尼龙电池过滤器	SPL Lifesciences	93070
氯化铵 （NH4Cl）	Sigma	A9434
抗小鼠 CD25	Biolegend	102007	克隆：PC61
抗小鼠 CD4	Biolegend	100453	克隆：GK1.5
抗小鼠 CD44	Biolegend	103029	克隆：IM7
抗小鼠 CD62L	Biolegend	104407	克隆：MEL-14
抗小鼠 CD8	Biolegend	100713	克隆：53-6.7
抗小鼠 TCR&β;	Biolegend	109233	克隆：H57-579
BD LSR公司	BD Biosciences
乙二胺四乙酸（EDTA）	生物碱性	6381-92-6
FALCON 5ml 聚苯乙烯圆底管（FACS管）	BD Biosciences 352052
胎牛血清（FBS）	Hyclone	ATD161145
Flowjo， LLC	BD生物科学
羟乙基哌嗪乙磺酸 （HEPES）	Sigma	H4034
L-谷氨酰胺 （200 mM）	Gibco	A2916801
LysoTracker Green DND26	Thermo Fisher Scientific	L7526
MEM 非必需氨基酸 （100X）	Gibco	11140050
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher科学	M7514
青霉素-链霉素 （10,000 U/mL）	Gibco	15140122
碳酸氢钾 （KHCO3）	J.T.baker	298-14-6
碘化丙啶溶液	Sigma	25535-16-4
RPMI 1640 培养基（粉末）	Gibco	31800089
碳酸氢钠 （NaHCO3）	Sigma	S5761
丙酮酸钠 （100 mM）	Gibco	11360070