方法文章

Drosophila Melanogaster 中病毒感染的建立及宿主-病毒相互作用分析

DOI：

10.3791/58845

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2019年3月14日

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1The Joint Center for Infection and Immunity, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, 2CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, 3CAS Key Laboratory of Infection and Immunity (CASKLII), Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, 4Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本方案描述了如何建立病毒感染 体内 在 黑腹果蝇 采用纳米注射法及基础技术分析病毒-宿主相互作用。

摘要

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病毒传播是导致流行性疾病的主要原因。因此，深入了解病毒与宿主之间的相互作用，对于拓展病毒感染的预防和治疗知识具有重要意义。果蝇黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）因其强大的遗传学工具和高度保守的先天免疫信号通路，已被证明是筛选抗病毒因子和研究病毒-宿主相互作用最高效且成果最丰富的模式生物之一。本文所述方法展示了一种纳米注射技术，用于在成年果蝇中建立病毒感染并诱导系统性抗病毒反应。该方法可精确控制病毒注射剂量，从而实现较高的实验可重复性。本研究中描述的实验方案包括果蝇与病毒的制备、注射方法、存活率分析、病毒载量测定以及抗病毒通路评估。文中还提到了果蝇遗传背景对病毒感染效应的影响。该感染方法操作简便且具有定量可重复性，可用于筛选参与病毒-宿主相互作用的宿主或病毒因子，并解析病毒感染响应中先天免疫信号通路与其他生物学通路之间的交互作用。

引言

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新发病毒性感染，尤其是虫媒病毒引起的感染，例如 的 基孔肯雅病毒1，登革病毒，黄热病毒2 和寨卡病毒病毒3，已通过引发大流行对公共健康构成巨大威胁4因此，深入了解病毒与宿主之间的相互作用对于控制传染病及治疗人类病毒性疾病变得愈发重要。为实现这一目标，必须建立更为恰当且高效的模型，以研究病毒感染背后的机制。

果蝇 Drosophila melanogaster (D. melanogaster) 是研究病毒与宿主相互作用的有力体系5,6，已被证明是研究人类病毒性疾病的最高效模型之一7,8,9。其高度保守的抗病毒信号通路以及无与伦比的遗传工具，使果蝇成为获得对人类抗病毒研究具有实际意义成果的理想模型。此外，果蝇在实验室中易于饲养且成本低廉，便于在病毒感染过程中对病毒和宿主中新的调控因子进行大规模筛选6<....

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方案

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注意：实验开始前，所使用的细胞系和果蝇品系必须未被其他病原体污染，尤其是DCV、FHV、黑腹果蝇X病毒（DXV）和禽类肾炎病毒（ANV）等病毒。理想情况下，应通过RNA测序或更简单的基于PCR的鉴定方法来检测污染情况10,45。一旦发现污染，在彻底去污染之前，不应继续使用这些细胞系和果蝇品系46。

1. 病毒与果蝇的制备

  1. 病毒扩增与收集
    注意： 果蝇 S2*细胞用于DCV的增殖与滴定。S2*细胞系源自晚期胚胎的原代培养 D. melanogaster 胚胎。该细胞系此前已有详尽描述47.
    1. 在25 °C下，使用Schneider's Drosophila培养基培养S2*细胞，无需额外添加CO2，以1 × 10⁶细胞/10 cm培养皿的密度接种于10 cm细胞培养皿中，形成疏松、半贴壁的单层细胞7 活细胞数/mL。S2*细胞使用完全培养基：Schneider’s果蝇培养基，含10%热灭活胎牛血清、100单位/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。
      注意：健康细胞应呈圆形，且大小均一....

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结果

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本节结果是在DCV感染后获得的 D. melanogaster. 图1 显示病毒感染的流程图 果蝇果蝇通过胸腔内注射接种，随后采集样本以测定病毒的TCID50 基因组RNA水平（图1）。病毒感染可导致细胞裂解，感染后3天可观察到细胞病变效应（CPE）。图 2A）。通过CPE实验测得的病毒载量与qPCR测得的结果一致（图2B）。如图所示 图3, Wolbachia 抑制DCV感染 黑腹果蝇. wol-16S rRNA 和 wsp 引物用于检测 Wolbachia 存在图3A）和 Wolbachia无病毒果蝇在感染DCV后表现出显著降低的存活率（图3B). 图4 展示如何验证 pst 利用特异.......

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讨论

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本文详细介绍了一种利用纳米注射技术在成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中建立病毒感染系统的详细实验流程。该方法包括合适的果蝇品系和病毒原液的制备、感染操作技术、感染指标的评估以及抗病毒反应的检测。尽管本文以双链RNA病毒（DCV）作为病毒病原体的示例，但已有数十种不同类型的病毒成功应用于果蝇系统的研究。此外，通过在果蝇中进行的大规模筛选，已鉴定出数百种来自病毒或宿主的调控因子。因此，该方法具有高度的可适应性，并不仅限于DCV与Drosophila之间的相互作用研究。

为了成功扩增并收获高滴度的DCV，必须采取一些预防措施。细胞应保持健康状态，以适当的密度培养，并及时收获。减少细胞培养体积对病毒滴度无显著影响。通常，以MOI=0.01感染107个细胞，最终可获得约108-109 TCID50的DCV，足以满足大多数in vivo和in vitro实验的需求。本方案中描述了通过CPE实验和qRT-PC.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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我们感谢中国科学院植物生理生态研究所潘实验室全体成员。感谢中国科学院植物生理生态研究所王兰凤博士提供实验协助，感谢Springer Nature的Gonalo Cordova Steger博士、巴黎居里研究所的Jessica VARGAS博士和Seng Zhu博士提出的宝贵意见。本研究得到了中国科学院战略性先导科技专项对L.P（XDA13010500）和H.T（XDB29030300）的资助，以及国家自然科学基金对L.P（31870887和31570897）及J.Y（31670909）的资助。L.P为中国科学院青年创新促进会会员（2012083）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm 滤器MilliporeSLGP033RS
1.5 ml 微量离心管Brand352070
1.5 ml 无RNase微量离心管AxygenMCT-150-C
10 cm 细胞培养皿SigmaCLS430167细胞培养
100 根替换用毛细管Drummond Scientific3-000-203-G/X
15 ml 离心管Corning352096
ABI 7500 qPCR 系统ABI7500qPCR
细胞培养箱SanyoMIR-553
离心机Eppendorf5810R
离心机Eppendorf5424R
氯仿Sigma151858RNA 提取
DEPC 处理水Sigma95284-100MLRNA 提取
果蝇培养箱PercivalI-41NL果蝇饲养
FBSInvitrogen12657-029细胞培养
平底96孔板SigmaCLS3922细胞培养
荧光显微镜OlympusDP73
异丙醇SigmaI9516RNA 提取
裂解液（RNA提取用）Thermo Fisher15596026TRIzol 试剂
裂解液（液体样本RNA提取用）Thermo Fisher10296028TRIzol LS 试剂
显微镜OlympusCKX41
Nanoject II 自动纳升级注射仪Drummond Scientific3-000-204Nanoject II 可调体积（2.3 至 69 nL）自动注射仪，配玻璃毛细管（110V）
光学粘合膜ABI4360954qPCR
青霉素-链霉素溶液（液体）Invitrogen15140-122细胞培养
qPCR 板ABIA32811qPCR
Schneider’s 昆虫培养基SigmaS9895细胞培养
统计分析软件GraphPad Prism 7
TransScript Fly 第一链 cDNA 合成超混合液TransScriptAT301RNA 提取
涡旋振荡器IKAVORTEX 3RNA 提取

参考文献

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  1. Rahim, M. A., Uddin, K. N. Chikungunya: an emerging viral infection with varied clinical presentations in Bangladesh: Reports of seven cases. BMC Research Notes. 10, 410(2017).
  2. Douam, F., Ploss, A. Yellow Fever....

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重印与许可

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PCR

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