本方案描述了如何建立病毒感染 体内 在 黑腹果蝇 采用纳米注射法及基础技术分析病毒-宿主相互作用。
方法文章
* These authors contributed equally
本方案描述了如何建立病毒感染 体内 在 黑腹果蝇 采用纳米注射法及基础技术分析病毒-宿主相互作用。
病毒传播是导致流行性疾病的主要原因。因此,深入了解病毒与宿主之间的相互作用,对于拓展病毒感染的预防和治疗知识具有重要意义。果蝇黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)因其强大的遗传学工具和高度保守的先天免疫信号通路,已被证明是筛选抗病毒因子和研究病毒-宿主相互作用最高效且成果最丰富的模式生物之一。本文所述方法展示了一种纳米注射技术,用于在成年果蝇中建立病毒感染并诱导系统性抗病毒反应。该方法可精确控制病毒注射剂量,从而实现较高的实验可重复性。本研究中描述的实验方案包括果蝇与病毒的制备、注射方法、存活率分析、病毒载量测定以及抗病毒通路评估。文中还提到了果蝇遗传背景对病毒感染效应的影响。该感染方法操作简便且具有定量可重复性,可用于筛选参与病毒-宿主相互作用的宿主或病毒因子,并解析病毒感染响应中先天免疫信号通路与其他生物学通路之间的交互作用。
新发病毒性感染,尤其是虫媒病毒引起的感染,例如 的 基孔肯雅病毒1,登革病毒,黄热病毒2 和寨卡病毒病毒3,已通过引发大流行对公共健康构成巨大威胁4因此,深入了解病毒与宿主之间的相互作用对于控制传染病及治疗人类病毒性疾病变得愈发重要。为实现这一目标,必须建立更为恰当且高效的模型,以研究病毒感染背后的机制。
果蝇 Drosophila melanogaster (D. melanogaster) 是研究病毒与宿主相互作用的有力体系5,6,已被证明是研究人类病毒性疾病的最高效模型之一7,8,9。其高度保守的抗病毒信号通路以及无与伦比的遗传工具,使果蝇成为获得对人类抗病毒研究具有实际意义成果的理想模型。此外,果蝇在实验室中易于饲养且成本低廉,便于在病毒感染过程中对病毒和宿主中新的调控因子进行大规模筛选6,10。
四种主要的高度保守的抗病毒通路(例如,RNA干扰(RNAi)通路11JAK-STAT 信号通路12NF-κB 通路和自噬通路13)在研究中已有充分探讨 果蝇 近年来6RNAi 通路是一种广泛的抗病毒机制,能够抑制大多数类型的病毒感染6,14. 通过突变破坏该通路中的基因,例如 Dicer-2 (Dcr-2) 或 Argonaute 2 (AGO2) 可导致病毒滴度升高和宿主死亡率增加15,16,17JAK-STAT 通路已被证实在控制病毒感染方面发挥作用,该病毒属于 Dicistroviridae 家族和 黄病毒科 昆虫中的科 例如,果蝇中的果蝇C病毒(DCV)16 以及蚊子中的西尼罗病毒(WNV)和登革病毒18,19。该 黑腹果蝇 Toll通路(与人类NF-κB通路同源)和免疫缺陷(IMD)通路(类似于人类NF-κB和TNF通路)均参与抵御病毒感染20,21,22自噬是另一种参与调控病毒感染的保守机制,该机制在 果蝇23,24因此,可轻松建立用于鉴定这些通路中的新型调控因子,并解析抗病毒信号通路与其他生物通路(如代谢、衰老、神经反应等)之间相互串扰的实验体系 黑腹果蝇 系统。
尽管大多数已建立的病毒性感染模型在 果蝇 由RNA病毒诱导,无脊椎动物虹彩病毒6型(IV-6)和Kallithea病毒的感染已显示出在果蝇中研究DNA病毒的潜力25,26此外,该病毒还可被改造以允许感染 果蝇,例如 流感病毒9。这极大地拓展了该技术的应用范围 果蝇 筛选平台。在此流程中,我们以DCV为例,描述如何构建病毒感染系统 果蝇DCV 是一种正义单链 RNA 病毒,基因组长约 9300 个核苷酸,编码 9 种蛋白质27. 作为一种天然病原体 D. melanogaster,DCV被认为是在宿主-病毒相互作用及共同进化过程中研究宿主生理、行为和基础免疫反应的合适病毒28此外,野型果蝇在感染后迅速出现死亡率,这使得DCV可用于筛选宿主中与抗性或易感性相关的基因29.
然而,在研究病毒感染时存在若干值得关注的方面 果蝇例如,共生细菌 Wolbachia 能够抑制多种RNA病毒增殖 果蝇 和蚊子30,31,32最近的证据显示了一种可能的机制 Wolbachia 通过上调宿主甲基转移酶Mt2的表达来阻断辛德毕斯病毒(SINV)感染33此外,昆虫的遗传背景对病毒感染也至关重要。例如,基因中的自然多态性 pastrel (pst),决定对DCV感染的易感性 果蝇34,35,而位点的 Ubc-E2H 和 CG8492 参与蟋蟀麻痹病毒的相关作用 (CrPV)和Flock house病毒(FHV)感染36.
建立果蝇中病毒与宿主相互作用的具体方法,必须根据研究目的进行选择,例如用于筛选宿主细胞组分的高通量筛选 果蝇 细胞系37,38,口服感染以研究肠道特异性抗病毒反应22,39,40,针刺41,42 或通过纳米注射穿透上皮屏障以刺激全身免疫反应。纳米注射可精确控制病毒剂量,从而诱导可控的抗病毒反应和生理性损伤43从而确保实验具有高度的可重复性44本研究中,我们描述了一种纳米注射方法,用于研究病毒与宿主之间的相互作用 黑腹果蝇,强调了果蝇背景效应的重要性。
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注意:实验开始前,所使用的细胞系和果蝇品系必须未被其他病原体污染,尤其是DCV、FHV、黑腹果蝇X病毒(DXV)和禽类肾炎病毒(ANV)等病毒。理想情况下,应通过RNA测序或更简单的基于PCR的鉴定方法来检测污染情况10,45。一旦发现污染,在彻底去污染之前,不应继续使用这些细胞系和果蝇品系46。
1. 病毒与果蝇的制备
2. 病毒感染在 果蝇
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本节结果是在DCV感染后获得的 D. melanogaster. 图1 显示病毒感染的流程图 果蝇果蝇通过胸腔内注射接种,随后采集样本以测定病毒的TCID50 基因组RNA水平(图1)。病毒感染可导致细胞裂解,感染后3天可观察到细胞病变效应(CPE)。图 2A)。通过CPE实验测得的病毒载量与qPCR测得的结果一致(图2B)。如图所示 图3, Wolbachia 抑制DCV感染 黑腹果蝇. wol-16S rRNA 和 wsp 引物用于检测 Wolbachia 存在图3A)和 Wolbachia无病毒果蝇在感染DCV后表现出显著降低的存活率(图3B). 图4 展示如何验证 pst 利用特异...
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本文详细介绍了一种利用纳米注射技术在成年黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中建立病毒感染系统的详细实验流程。该方法包括合适的果蝇品系和病毒原液的制备、感染操作技术、感染指标的评估以及抗病毒反应的检测。尽管本文以双链RNA病毒(DCV)作为病毒病原体的示例,但已有数十种不同类型的病毒成功应用于果蝇系统的研究。此外,通过在果蝇中进行的大规模筛选,已鉴定出数百种来自病毒或宿主的调控因子。因此,该方法具有高度的可适应性,并不仅限于DCV与Drosophila之间的相互作用研究。
为了成功扩增并收获高滴度的DCV,必须采取一些预防措施。细胞应保持健康状态,以适当的密度培养,并及时收获。减少细胞培养体积对病毒滴度无显著影响。通常,以MOI=0.01感染107个细胞,最终可获得约108-109 TCID50的DCV,足以满足大多数in vivo和in vitro实验的需求。本方案中描述了通过CPE实验和qRT-PC...
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作者无任何利益冲突需要披露。
我们感谢中国科学院植物生理生态研究所潘实验室全体成员。感谢中国科学院植物生理生态研究所王兰凤博士提供实验协助,感谢Springer Nature的Gonalo Cordova Steger博士、巴黎居里研究所的Jessica VARGAS博士和Seng Zhu博士提出的宝贵意见。本研究得到了中国科学院战略性先导科技专项对L.P(XDA13010500)和H.T(XDB29030300)的资助,以及国家自然科学基金对L.P(31870887和31570897)及J.Y(31670909)的资助。L.P为中国科学院青年创新促进会会员(2012083)。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm 滤器 | Millipore | SLGP033RS | |
| 1.5 ml 微量离心管 | Brand | 352070 | |
| 1.5 ml 无RNase微量离心管 | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm 细胞培养皿 | Sigma | CLS430167 | 细胞培养 |
| 100 根替换用毛细管 | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| 15 ml 离心管 | Corning | 352096 | |
| ABI 7500 qPCR 系统 | ABI | 7500 | qPCR |
| 细胞培养箱 | Sanyo | MIR-553 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5810R | |
| 离心机 | Eppendorf | 5424R | |
| 氯仿 | Sigma | 151858 | RNA 提取 |
| DEPC 处理水 | Sigma | 95284-100ML | RNA 提取 |
| 果蝇培养箱 | Percival | I-41NL | 果蝇饲养 |
| FBS | Invitrogen | 12657-029 | 细胞培养 |
| 平底96孔板 | Sigma | CLS3922 | 细胞培养 |
| 荧光显微镜 | Olympus | DP73 | |
| 异丙醇 | Sigma | I9516 | RNA 提取 |
| 裂解液(RNA提取用) | Thermo Fisher | 15596026 | TRIzol 试剂 |
| 裂解液(液体样本RNA提取用) | Thermo Fisher | 10296028 | TRIzol LS 试剂 |
| 显微镜 | Olympus | CKX41 | |
| Nanoject II 自动纳升级注射仪 | Drummond Scientific | 3-000-204 | Nanoject II 可调体积(2.3 至 69 nL)自动注射仪,配玻璃毛细管(110V) |
| 光学粘合膜 | ABI | 4360954 | qPCR |
| 青霉素-链霉素溶液(液体) | Invitrogen | 15140-122 | 细胞培养 |
| qPCR 板 | ABI | A32811 | qPCR |
| Schneider’s 昆虫培养基 | Sigma | S9895 | 细胞培养 |
| 统计分析软件 | GraphPad Prism 7 | ||
| TransScript Fly 第一链 cDNA 合成超混合液 | TransScript | AT301 | RNA 提取 |
| 涡旋振荡器 | IKA | VORTEX 3 | RNA 提取 |
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