利用流式细胞术检测小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏中调节性T细胞亚群

摘要

本文介绍了一种从小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏制备单细胞悬液的实验方案，以便进一步通过流式细胞术对这些细胞进行研究。此外，该方案还可用于通过流式细胞术鉴定调节性T细胞的不同亚群。

摘要

我们的免疫系统由多种多样的免疫细胞组成，包括调节性T细胞（Treg细胞）。Treg细胞可分为两个亚群：胸腺来源的Treg（tTreg）细胞和外周诱导产生的Treg（pTreg）细胞。这些细胞存在于我们身体的不同器官中，并可通过特定标志物（如Helios和Neuropilin 1）加以区分。已有研究报道，tTreg细胞在功能上比pTreg细胞具有更强的抑制能力。因此，在研究异质性细胞群体时，确定tTreg和pTreg细胞各自的比例非常重要。本文中，我们采集了血糖正常、非肥胖型糖尿病小鼠的胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏，通过流式细胞术来区分tTreg细胞与pTreg细胞。我们手动制备了来自这些器官的单细胞悬液。使用荧光染料标记的表面抗体CD4、CD8、CD25和Neuropilin 1对细胞进行染色，并将样本在冰箱中过夜保存。次日，再用荧光染料标记的细胞内Foxp3和Helios抗体对细胞进行染色。这些标志物用于鉴定Treg细胞的两个亚群。本实验方案展示了一种简单且实用的方法，用于从小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏中制备单细胞悬液，并用于后续的流式细胞分析。

引言

调节性T（Treg）细胞对免疫系统的稳态至关重要。Treg细胞的特征是表达表面抗原CD4和CD25，以及转录因子叉头框P3（Foxp3）^1,2,3。Sakaguchi等首次发现CD25在小鼠的T抑制细胞上组成性表达⁴，这一发现为人类Treg细胞的鉴定提供了开创性的依据。Treg细胞通过多种机制发挥抑制功能，在免疫耐受中起核心作用，这些机制包括通过分泌颗粒酶诱导细胞凋亡的细胞溶解作用、细胞因子消耗以及通过表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）实现抑制⁵。此外，它们还可分泌抑制性细胞因子，如转化生长因子β（TGF-β）、白细胞介素-10（IL-10）和IL-35⁵。Treg细胞可天然来源于胸腺，此时被称为胸腺来源的Treg（tTreg）细胞，也可在外周器官中被诱导产生，此时称为外周诱导的Treg（pTreg）细胞。

Helios 是 Ikaros 转录因子家族成员，据报道可作为区分胸腺来源调节性T细胞（tTreg细胞）与外周来源调节性T细胞（pTreg细胞）的标志物⁶。随后，另外两个研究团队报道，....

方案

乌普萨拉大学当地动物伦理委员会批准了动物实验。

1. 动物器官的采集

1. 通过颈椎脱位法处死小鼠。
2. 将胸腺和脾脏置于含有 5 mL Hanks 平衡盐溶液（HBSS）的 20 mL 闪烁瓶或 15 mL 圆锥管中。将 PDLN 置于含有 1 mL RPMI 1640 的 1.5 mL 微量离心管中。使用完整的胸腺和脾脏，以及所有 PDLN。
   注意：整个操作过程中器官应保持在冰上，研究人员在制备单细胞悬液时应尽量迅速，尤其是在处理胸腺组织时，因为胸腺免疫细胞在较高温度下会迅速降解。

2. 胸腺和脾脏中单细胞的分离

1. 用镊子充分挤压胸腺和脾脏，以释放免疫细胞。弃去剩余的胸腺和脾脏包膜。
2. 将细胞悬液转移至15 mL锥形管中，在4 °C条件下以433 × g离心5分钟，形成细胞沉淀。弃去上清液。
3. 为裂解红细胞，将细胞沉淀重悬于5 mL 0.2 M NH₄Cl溶液中，室温孵育10分钟。每2分钟轻柔颠倒混匀一次。孵育结束后加入5 mL HBSS终止裂解反应。
4. 在4 °C条件下以433 × g离心5分钟。弃去上清液。
5. 将细胞沉淀重悬于约5 mL HBSS中，并用HBSS充满离心....

结果

为了研究Nrp1和Helios在胸腺来源调节性T细胞（tTreg）和外周来源调节性T细胞（pTreg）中的表达情况，我们制备了血糖正常NOD小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结（PDLN）和脾脏的单细胞悬液，并使用调节性T细胞标志物CD4、CD25、Foxp3、Helios和Nrp1进行染色，随后进行流式细胞术分析。结果按照代表性设门策略进行分析（图1）。我们发现，在三种器官中，CD4⁺CD8^-CD25⁺Foxp3⁺ Treg细胞中Helios⁺细胞的比例均高于Nrp1⁺细胞的比例（图2A）。胸腺中超过80%的Treg细胞表达Helios，高于PDLN和脾脏中的比例（图2A）。在Helios⁺ Treg细胞中，PDLN中Nrp1⁺细胞.......

讨论

在本研究中，我们从NOD小鼠的胸腺、外周淋巴结（PDLNs）和脾脏中分离出单个细胞，并通过流式细胞术检测CD4⁺CD8^-CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞（Treg细胞）中Helios和Nrp1的表达。本研究所使用的NOD小鼠是1型糖尿病的小鼠模型。在之前的研究中，我们曾使用野生型小鼠品系CD-1和C57BL/6小鼠，以探讨Helios或Nrp1哪一个更适合作为区分胸腺来源Treg细胞（tTreg）与外周诱导Treg细胞（pTreg）的标志物。在该研究中，我们采用类似方案分析了未免疫小鼠体内Treg细胞亚群的分布⁹，结果发现Helios在此背景下是更优的标志物。因此，本研究进一步在血糖正常的NOD小鼠模型中验证了我们先前的发现，并证实结果与之前一致¹⁰。本方案提供了一种高效且经济的方法，用于制备单细胞悬液并进行后续的流式细胞术分析。已有若干文献报道使用自动组织解离仪来制备单细胞悬液^11,.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NOD 小鼠			本单位繁育
HBSS	Statens veterinärmedicinska anstalt	991750
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883-500ML
NH4Cl	EMD Millipore	1011450500
eBioscience Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装	ThermoFisher	00-5523-00	包含固定/透化浓缩液、固定/透化稀释液和透化缓冲液（10倍浓度）
eBioscience 流式细胞术染色缓冲液	ThermoFisher	00-4222-26
CD4 单克隆抗体 (RM4-5)，FITC，eBioscience	ThermoFisher	11-0042-85
CD25 单克隆抗体 (PC61.5)，PE，eBioscience	ThermoFisher	12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 大鼠抗小鼠 CD8a	BD Biosciences	560182
小鼠 Neuropilin-1 APC 标记抗体	R&D Systems	FAB5994A
FOXP3 单克隆抗体 (FJK-16s)，PE-Cyanine7，eBioscience	ThermoFisher	25-5773-82
Pacific Blue 抗小鼠/人 Helios 抗体	BioLegend	137220
Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带滤网 snap cap	CORNING	352235	双位置 snap cap 中集成了 35 µm 尼龙网膜
15 mL 试管，120 mm × 17 mm，聚丙烯材质	Sarstedt	62.554.002
1.5 mL 微量离心管	Sarstedt	72.690.001
一次性闪烁瓶	WHEATON
流式细胞仪	BD
流式细胞术分析软件	Inivai Technologies	Flowlogic