需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

利用流式细胞术检测小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏中调节性T细胞亚群

11.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/58848

⸱

2019年2月27日

 ,  ,  , 
1Department of Medical Cell Biology, Uppsala University

本文内容

摘要

本文介绍了一种从小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏制备单细胞悬液的实验方案，以便进一步通过流式细胞术对这些细胞进行研究。此外，该方案还可用于通过流式细胞术鉴定调节性T细胞的不同亚群。

摘要

我们的免疫系统由多种多样的免疫细胞组成，包括调节性T细胞（Treg细胞）。Treg细胞可分为两个亚群：胸腺来源的Treg（tTreg）细胞和外周诱导产生的Treg（pTreg）细胞。这些细胞存在于我们身体的不同器官中，并可通过特定标志物（如Helios和Neuropilin 1）加以区分。已有研究报道，tTreg细胞在功能上比pTreg细胞具有更强的抑制能力。因此，在研究异质性细胞群体时，确定tTreg和pTreg细胞各自的比例非常重要。本文中，我们采集了血糖正常、非肥胖型糖尿病小鼠的胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏，通过流式细胞术来区分tTreg细胞与pTreg细胞。我们手动制备了来自这些器官的单细胞悬液。使用荧光染料标记的表面抗体CD4、CD8、CD25和Neuropilin 1对细胞进行染色，并将样本在冰箱中过夜保存。次日，再用荧光染料标记的细胞内Foxp3和Helios抗体对细胞进行染色。这些标志物用于鉴定Treg细胞的两个亚群。本实验方案展示了一种简单且实用的方法，用于从小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏中制备单细胞悬液，并用于后续的流式细胞分析。

引言

调节性T（Treg）细胞对免疫系统的稳态至关重要。Treg细胞的特征是表达表面抗原CD4和CD25，以及转录因子叉头框P3（Foxp3）1,2,3。Sakaguchi等首次发现CD25在小鼠的T抑制细胞上组成性表达4，这一发现为人类Treg细胞的鉴定提供了开创性的依据。Treg细胞通过多种机制发挥抑制功能，在免疫耐受中起核心作用，这些机制包括通过分泌颗粒酶诱导细胞凋亡的细胞溶解作用、细胞因子消耗以及通过表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）实现抑制5。此外，它们还可分泌抑制性细胞因子，如转化生长因子β（TGF-β）、白细胞介素-10（IL-10）和IL-355。Treg细胞可天然来源于胸腺，此时被称为胸腺来源的Treg（tTreg）细胞，也可在外周器官中被诱导产生，此时称为外周诱导的Treg（pTreg）细胞。

Helios 是 Ikaros 转录因子家族成员，据报道可作为区分胸腺来源调节性T细胞（tTreg细胞）与外周来源调节性T细胞（pTreg细胞）的标志物6。随后，另外两个研究团队报道，在特定条件下，神经纤毛蛋白1（Neuropilin 1, Nrp1），即一种神经纤毛蛋白III受体，可作为tTreg细胞的表面标志物7,8。然而，Singh 等人已证明，在未致敏小鼠中，Helios 是更为优越的标志物9。

调节性T细胞（Treg细胞）的不同亚群在维持免疫系统稳态以及抵御自身免疫和感染方面发挥着关键作用。因此，确定这些细胞群体在淋巴组织和非淋巴组织中的数量和比例具有重要意义。为实现这一目标，需要从这些器官制备单细胞悬液。已有多种方案在先前的研究中被描述或使用。在以往发表的研究中，主要采用自动组织解离仪10,11。使用自动解离仪操作便捷且节省时间，但成本较高。因此，我们采用了一种手动方法，从血糖正常的非肥胖糖尿病（NOD）小鼠的胸腺、胰腺引流淋巴结（PDLNs）和脾脏中制备单细胞悬液，并分离出单个细胞。该方法已在我们之前的研究中应用，我们发现，手动制备单细胞悬液的效率与使用自动解离仪的方法相当9,12,13,14。此外，我们采用流式细胞术检测了CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg细胞及其亚群——胸腺来源的Treg细胞（tTreg）和外周诱导的Treg细胞（pTreg）的比例。tTreg细胞通过Helios和Nrp1作为标志物进行区分。因此，我们的结果表明，手动制备单细胞的方法确实高效，所获得的单细胞悬液可进一步用于流式细胞术相关研究。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

乌普萨拉大学当地动物伦理委员会批准了动物实验。

1. 动物器官的采集

  1. 通过颈椎脱位法处死小鼠。
  2. 将胸腺和脾脏置于含有 5 mL Hanks 平衡盐溶液（HBSS）的 20 mL 闪烁瓶或 15 mL 圆锥管中。将 PDLN 置于含有 1 mL RPMI 1640 的 1.5 mL 微量离心管中。使用完整的胸腺和脾脏，以及所有 PDLN。
    注意：整个操作过程中器官应保持在冰上，研究人员在制备单细胞悬液时应尽量迅速，尤其是在处理胸腺组织时，因为胸腺免疫细胞在较高温度下会迅速降解。

2. 胸腺和脾脏中单细胞的分离

  1. 用镊子充分挤压胸腺和脾脏，以释放免疫细胞。弃去剩余的胸腺和脾脏包膜。
  2. 将细胞悬液转移至15 mL锥形管中，在4 °C条件下以433 × g离心5分钟，形成细胞沉淀。弃去上清液。
  3. 为裂解红细胞，将细胞沉淀重悬于5 mL 0.2 M NH4Cl溶液中，室温孵育10分钟。每2分钟轻柔颠倒混匀一次。孵育结束后加入5 mL HBSS终止裂解反应。
  4. 在4 °C条件下以433 × g离心5分钟。弃去上清液。
  5. 将细胞沉淀重悬于约5 mL HBSS中，并用HBSS充满离心管。
  6. 在4 °C条件下以433 × g离心5分钟。弃去上清液。
  7. 将细胞沉淀重悬于约5 mL HBSS中，并用HBSS充满离心管。
  8. 在4 °C条件下以433 × g离心5分钟。弃去上清液。
  9. 将胸腺细胞沉淀重悬于5 mL HBSS中，脾脏细胞沉淀重悬于10 mL HBSS中。
  10. 取1 mL胸腺细胞悬液和500 µL脾脏细胞悬液，分别加入含细胞筛网帽的5 mL圆底管中。将细胞悬液通过筛网帽过滤。
    注意： 筛网帽内置35 µm尼龙滤网。每管大约收集500万至1000万个细胞。

3. 从 PDLN 中分离单细胞

  1. 将无菌的250 µm金属筛网置于架上的15 mL锥形管上，用1 mL RPMI冲洗筛网。
  2. 将淋巴结转移至金属筛网上，使用一对镊子将其研磨过筛。在筛网上加入1 mL RPMI，以冲洗细胞进入管中。重复此操作3次，然后移除筛网。
  3. 在4 °C条件下，以433 × g离心5分钟。弃去上清液。
  4. 用约5 mL RPMI重悬细胞沉淀。用RPMI充满离心管。
  5. 在4 °C条件下，以433 × g离心5分钟。弃去上清液。
  6. 用约5 mL RPMI重悬细胞沉淀。用RPMI充满离心管。
  7. 在4 °C条件下，以433 × g离心5分钟。弃去上清液。
  8. 用2 mL RPMI重悬细胞沉淀。将2 mL细胞悬液转移至带有细胞筛网帽的5 mL圆底管中。将细胞悬液加至细胞筛网帽上。

4. 流式细胞术

  1. 将来自胸腺、PDLN和脾脏的细胞悬液在4 °C条件下以433 × g 离心5分钟，弃去上清液。
  2. 在100 µL流式细胞术染色缓冲液（FACS缓冲液）中，使用以下表面抗体对细胞进行染色：0.75 µg/100 µL FITC标记的CD4抗体、0.60 µg/100 µL APC-H7标记的CD8抗体、0.30 µg/100 µL PE标记的CD25抗体、5 µL（1:20）APC标记的Nrp1抗体。将样品管置于冰上孵育40分钟。
  3. 向每管中加入200 µL FACS缓冲液，在4 °C条件下以433 × g 离心5分钟，弃去上清液。重复此步骤一次。
  4. 用500 µL通透固定缓冲液（PFB）重悬细胞沉淀，以进行细胞固定和通透。
    注意：PFB通过将1份固定/通透浓缩液与3份固定/通透稀释液混合配制而成。
  5. 将样品管置于4 °C冰箱中过夜。
    注意：孵育1小时也可达到效果。
  6. 在4 °C条件下以433 × g 离心5分钟，弃去上清液。
  7. 用500 µL通透洗涤缓冲液（PWB）重悬细胞沉淀，在4 °C条件下以433 × g 离心5分钟，弃去上清液。
    注意：PWB通过将10倍浓度的通透缓冲液按1:10比例用蒸馏水稀释配制而成。
  8. 在100 µL PWB中，使用以下细胞内抗体对细胞进行染色：0.30 µg/100 µL PE-Cy7标记的Foxp3抗体、4 µL（1:25）PacificBlue标记的Helios抗体。将样品管置于冰上孵育1小时。
  9. 向每管中加入500 µL PWB，在4 °C条件下以433 × g 离心5分钟，弃去上清液。
  10. 用500 µL PWB重悬细胞沉淀，在4 °C条件下以433 × g 离心5分钟，弃去上清液。
  11. 用300 µL FACS缓冲液重悬细胞沉淀。
  12. 在流式细胞仪上分析细胞。
  13. 根据侧向散射-面积、高度和宽度，以及前向散射-面积、高度和宽度对单细胞进行设门，每份样品采集一百万个事件用于分析。
  14. 导出实验的FCS文件，并使用流式细胞术分析软件进行数据分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

为了研究Nrp1和Helios在胸腺来源调节性T细胞（tTreg）和外周来源调节性T细胞（pTreg）中的表达情况，我们制备了血糖正常NOD小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结（PDLN）和脾脏的单细胞悬液，并使用调节性T细胞标志物CD4、CD25、Foxp3、Helios和Nrp1进行染色，随后进行流式细胞术分析。结果按照代表性设门策略进行分析（图1）。我们发现，在三种器官中，CD4+CD8-CD25+Foxp3+ Treg细胞中Helios+细胞的比例均高于Nrp1+细胞的比例（图2A）。胸腺中超过80%的Treg细胞表达Helios，高于PDLN和脾脏中的比例（图2A）。在Helios+ Treg细胞中，PDLN中Nrp1+细胞...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

在本研究中，我们从NOD小鼠的胸腺、外周淋巴结（PDLNs）和脾脏中分离出单个细胞，并通过流式细胞术检测CD4+CD8-CD25+Foxp3+调节性T细胞（Treg细胞）中Helios和Nrp1的表达。本研究所使用的NOD小鼠是1型糖尿病的小鼠模型。在之前的研究中，我们曾使用野生型小鼠品系CD-1和C57BL/6小鼠，以探讨Helios或Nrp1哪一个更适合作为区分胸腺来源Treg细胞（tTreg）与外周诱导Treg细胞（pTreg）的标志物。在该研究中，我们采用类似方案分析了未免疫小鼠体内Treg细胞亚群的分布9，结果发现Helios在此背景下是更优的标志物。因此，本研究进一步在血糖正常的NOD小鼠模型中验证了我们先前的发现，并证实结果与之前一致10。本方案提供了一种高效且经济的方法，用于制备单细胞悬液并进行后续的流式细胞术分析。已有若干文献报道使用自动组织解离仪来制备单细胞悬液11,...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了瑞典研究理事会、EXODIAB、瑞典糖尿病基金会、瑞典儿童糖尿病基金、SEB糖尿病基金会以及O.E.和Edla Johansson科学基金会的经费支持。作者还要感谢Per-Ola Carlsson和Stellan Sandler提供的支持与讨论。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
NOD 小鼠本单位繁育
HBSSStatens veterinärmedicinska anstalt991750
RPMI-1640Sigma-AldrichR0883-500ML
NH4ClEMD Millipore1011450500
eBioscience Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装ThermoFisher00-5523-00包含固定/透化浓缩液、固定/透化稀释液和透化缓冲液（10倍浓度）
eBioscience 流式细胞术染色缓冲液ThermoFisher00-4222-26
CD4 单克隆抗体 (RM4-5)，FITC，eBioscienceThermoFisher11-0042-85
CD25 单克隆抗体 (PC61.5)，PE，eBioscienceThermoFisher12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 大鼠抗小鼠 CD8aBD Biosciences560182
小鼠 Neuropilin-1 APC 标记抗体R&D SystemsFAB5994A
FOXP3 单克隆抗体 (FJK-16s)，PE-Cyanine7，eBioscienceThermoFisher25-5773-82
Pacific Blue 抗小鼠/人 Helios 抗体BioLegend137220
Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带滤网 snap capCORNING352235双位置 snap cap 中集成了 35 µm 尼龙网膜
15 mL 试管，120 mm × 17 mm，聚丙烯材质Sarstedt62.554.002
1.5 mL 微量离心管Sarstedt72.690.001
一次性闪烁瓶WHEATON
流式细胞仪BD
流式细胞术分析软件Inivai TechnologiesFlowlogic

参考文献

  1. Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
  2. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
  3. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  4. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  5. Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
  6. Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
  7. Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
  8. Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
  9. Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767(2015).
  10. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
  11. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
  12. Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633(2015).
  13. Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229(2017).
  14. Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

T Helios Neuropilin 1 Foxp3 CD25 CD4 CD8
利用流式细胞术检测小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏中调节性T细胞亚群
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。