本文介绍一种从E13小鼠胚胎神经节隆起中分离神经干细胞的新型显微手术技术。
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摘要
摘要
神经干细胞（NSCs）具有多向分化潜能，可分化为中枢神经系统（CNS）的三种主要细胞类型。体外培养和扩增神经干细胞可为神经科学家研究神经元、胶质细胞及其相互作用提供充足的细胞来源。目前已有多种报道的技术用于从成年或胚胎哺乳动物大脑中分离神经干细胞。在显微外科操作中从胚胎 CNS 不同区域分离 NSCs 时，尽可能减少对脑细胞的损伤，以获得最高比例的存活且可扩增的干细胞，是至关重要的。在从小鼠胚胎脑中分离这些细胞时，减少手术时间是一种可能减轻细胞应激的方法。本文展示了一种从 E13 小鼠胚胎纹状体隆起（ganglionic eminence）快速分离这些细胞的改进技术。手术步骤包括：从子宫中取出 E13 小鼠胚胎，用弯针尖切开胚胎的前囟，从颅骨中取出脑组织，对分离的脑组织进行显微解剖以获取纹状体隆起，将所获组织在 NSC 培养基中解离以获得单细胞悬液，最后将细胞悬液接种于悬浮培养体系以形成神经球。
引言
神经干细胞（NSCs）存在于成年和胚胎大脑的不同区域，具有生成多种类型神经元和胶质细胞的倾向1。成年哺乳动物大脑的室下区2以及胚胎大脑的神经节隆起是富含神经干细胞的区域3。在发育中的大脑中，神经节隆起主要提供皮层中间神经元，尤其是GABA能中间神经元3。此外，也有侵入性较小的方法可通过胚胎干细胞（ESCs）或诱导性多能干细胞（iPSCs）生成神经干细胞，从而减少对实验动物的需求。尽管已有可能从ESCs或iPSCs中获得神经干细胞4,5，但与直接从成年或胚胎动物脑组织中分离神经干细胞相比，仍存在一些优缺点6,7,8。诱导ESCs和iPSCs向神经表型分化的方案通常耗时且成本较高，其成功率（70–80% Nestin阳性细胞）5低于直接从动物脑组织中分离NSCs的方法（超过99% Nestin阳性细胞）9。此外，干细胞在多次传代后会丧失遗传稳定性及定向分化能力10,11。尽管已有其他新近报道实现了体细胞向神经干细胞的直接转化，但这些细胞经过基因工程改造，在普通实验室中难以获取12。因此，目前仍迫切需要从动物脑组织中分离神经干细胞；通过改进手术技术，可以减少所需动物数量。缩短手术时间并优化操作技术，有助于避免细胞损伤，从而从每只动物中获得最高比例的神经干细胞。
本文介绍一种从小鼠E13胚胎脑组织中分离神经干细胞的简化且可重复的技术。
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方案
所有动物手术和操作均经伊朗德黑兰Royan研究所动物伦理委员会批准。
1. 手术器械、洗涤缓冲液（HEPES-MEM）、细胞培养基和细胞培养板的准备
- 根据常规灭菌指南，通过高压灭菌法对手术器械（剪刀、手术刀片手柄和镊子）进行灭菌。
- 准备足量的 HEPES-MEM 缓冲液（每只怀孕小鼠约需 100 mL）。向 HEPES-MEM 缓冲液中加入高浓度抗生素（10% 青霉素/链霉素），该浓度的抗生素对于降低微生物污染风险是必要的。
- 配制 HEPES-MEM 缓冲液时，将 0.5958 g HEPES 粉末加入 100 mL MEM（最低必需培养基）中，充分混匀。调节 pH 至 7.3–7.4，并使用 0.22 µm 滤器过滤培养基。
- 配制含神经基础培养基（NB）的 NSC 培养基，添加 20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、1% 100x N2 补充剂或 1% B27 补充剂（不含维生素 A）、1 U/mL 肝素、1% L-谷氨酰胺、1% 非必需氨基酸（NEAA）、1% 青霉素/链霉素以及 0.1 mM β-巯基乙醇。
2. 动物手术与显微解剖
- 在第13天麻醉一只怀孕的小鼠th 妊娠第d（此处使用4月龄BALB/c品系小鼠），通过腹腔注射分别给予每千克体重100 mg的氯胺酮和10 mg的赛拉嗪。
- 通过施加疼痛刺激确认深度麻醉状态例如， 用镊子夹住动物足部，若无疼痛反射，则通过颈椎脱位法处死动物。
- 用70%乙醇喷洒腹部皮肤进行清洁和消毒。
- 控制腹部皮肤，然后用剪刀剪开皮肤及下方筋膜，暴露腹腔和子宫角。
- 用剪刀取出含有胚胎的子宫角，并转移至含有25 mL冷HEPES-MEM缓冲液的50 mL锥形管中。
- 将锥形管置于超净工作台内，在台内打开管盖。取出子宫角，用足量的冰冷 HEPES-MEM 缓冲液冲洗 3 次，以去除碎片和血液。
- 将子宫组织转移至含有7-10 mL冷HEPES-MEM缓冲液的10 cm培养皿中。用精细剪刀打开子宫角，并将胚胎转移至另一含有7-10 mL冷HEPES-MEM缓冲液的新培养皿中。随后将盛有胚胎的10 cm培养皿置于解剖显微镜下，进行显微解剖操作。
- 用25-27 G注射器针头的尖端抵住钢制手术刀刀柄，将其尖端弯曲。弯曲针头尖端至70-90°角。在解剖显微镜下检查针头尖端，观察其弯曲情况。
注意：胚胎在培养皿中自然呈侧位。 - 保持胚胎位置不变，用精细镊子夹住胚胎的颈部和躯干，然后将针尖的弯曲部分插入胚胎头部的前囟门。此处可能会有少量出血或血凝块。
- 将针尖浅层移动。当弯曲部分位于朝向前额的隆起处，然后移向头后部时，务必切开皮肤和颅骨，避免损伤下方的脑组织。
- 用针尖向侧方推动皮肤以暴露脑组织，从皮肤侧方将针插入脑组织下方区域。通过推动脑组织使其从解剖后的颅骨中移出，从而将脑组织取出。
- 用弯镊固定脑组织，使用显微剪刀剪开两侧半球的皮层，以暴露神经节隆起。
- 握住脑组织，将分离出的神经节隆起放入含有神经干细胞培养基的15 mL离心管中。神经节隆起的中部和外侧部分清晰可见。
- 重复此步骤，直至所有脑组织均完成显微解剖。
- 将移液管枪头抵住管底，切割已解剖出的神经节隆起组织。上下吹打悬浮液4至5次，以充分分散组织，获得单细胞悬液。
- 将悬液在110 × g下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液中。
- 在37 °C下孵育细胞悬液10分钟，然后加入等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂（25 µg/mL）以终止胰蛋白酶活性。用移液器将细胞悬液上下吹打，确保胰蛋白酶已完全失活。
- 将细胞悬液在110 × g下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1 mL完全NSC培养基中，并计数细胞数量。
- 将细胞接种（2×10⁶）5 细胞/mL）接种至适当大小的组织培养瓶中。将5 mL接种至T25培养瓶，20 mL接种至T75培养瓶，40 mL接种至T175培养瓶。
注意：神经球将在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中培养3天后出现2培养6-7天后，细胞球直径应达到150-200 µm，即可进行传代。将一百万个原代神经干细胞培养七天后，细胞数量可增至300-400万个。
3. 神经球的胰酶消化与传代
- 传代神经球时，将含有悬浮神经球的培养基转移至离心管中，在110 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37°C孵育10分钟。
- 使用大豆胰蛋白酶抑制剂终止胰蛋白酶反应，并轻轻吹打神经球，使其解离为单细胞。
- 将细胞悬液在110 × g条件下离心5分钟，弃去上清液，用1 mL NSC培养基重悬细胞。这些细胞可用于下一次传代，或接种于经层粘连蛋白和多聚-L-鸟氨酸包被的表面以进行后续实验。
- 进行下一次传代时，将神经干细胞（NSCs）转移至新的培养瓶中（参照步骤2.8），并在NSC培养基中继续培养。如需诱导神经元分化，则将NSCs接种于经层粘连蛋白和多聚-L-鸟氨酸包被的培养板中，在不含bFGF和EGF的NSC培养基中进行培养（图1B）。
- 包被操作步骤：向细胞培养板中加入足量稀释后的多聚-L-鸟氨酸溶液（25 µg/mL），确保完全覆盖培养表面，于37°C孵育2小时。
- 吸除多聚-L-鸟氨酸溶液，用PBS洗涤孔板两次。加入足量浓度为5 µg/mL的层粘连蛋白溶液，完全覆盖培养表面，于37°C孵育2小时。在接种细胞前吸除层粘连蛋白溶液，或于4°C保存备用。
4. 流式细胞术检测
注意：可通过流式细胞术检测神经干细胞、神经元和胶质细胞特异性标志物的表达13。本方案基于 Menon et al.13 的方法，略有修改。
- 通过胰蛋白酶消化将神经球解离，或从包被的培养板上脱离培养的神经干细胞（NSCs），使其成为单细胞。向含有约100万细胞（足以用于每种抗体染色）的100 µL细胞悬液中加入500 µL固定液（含2%多聚甲醛（PFA）的PBS），然后在室温下孵育15分钟。
- 向离心管中加入1 mL PBS洗涤细胞，并在110 × g下离心5分钟。弃去上清液，重悬细胞沉淀，保留约100 µL液体在管中。
- 加入500 µL含0.7% Tween-20的PBS缓冲液（PBS中含0.7% Tween-20）对细胞进行通透处理，将细胞悬液（100 µL）与通透缓冲液混合。在室温下置于旋转摇床（100 rpm）孵育15分钟。
- 重复离心和PBS洗涤步骤，彻底弃去离心管中的上清液，仅保留细胞沉淀。加入100 µL稀释的一抗溶液（用含1%牛血清白蛋白、10%血清（山羊血清）和0.5% Tween-20的PBS稀释缓冲液，将兔抗小鼠βtub-III、GFAP和Nestin抗体稀释至1:200浓度），轻轻吹打混匀。在室温下置于旋转摇床上孵育30分钟。
- 用PBS洗涤细胞一次，彻底弃去上清液，仅保留细胞沉淀。
- 向细胞沉淀中加入100 µL稀释的二抗溶液（FITC标记的山羊抗兔抗体，用PBS稀释至1:500浓度），轻轻吹打混匀。在避光条件下，于室温在摇床上孵育30分钟。
- 用PBS洗涤样本2次，再用流式缓冲液洗涤1次。离心后，将细胞重悬于约150 µL流式缓冲液中，用于流式细胞仪分析。
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结果
显微解剖、细胞分离与神经球培养。 本文介绍了一种快速高效的小鼠 E13 胚胎脑部显微手术及神经干细胞分离方法。该方法可通过前囟门的微小破裂，完整取出 E13 小鼠胚胎的整个脑组织。采用此法，脑组织损伤更小，且可从脑的不同区域分离细胞。所获得的细胞在含有 bFGF 和 EGF 的神经干细胞培养基中可形成神经球，培养 7 天后直径达 150–200 µm（图 1A）。使用 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 对神经球进行消化，使其解离为单细胞，并接种于层粘连蛋白/多聚-L-鸟氨酸包被的培养皿中，在无 bFGF 和 EGF 的条件下培养 7–10 天后，细胞可延伸出类似神经突的分支结构，并呈现神经元样形态（图 1B）。
流式细胞术检测结果。
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讨论
使用合适的神经干细胞来源对神经科学家而言至关重要。神经干细胞可以从胚胎大脑的不同区域获取，并能够生成特定类型的神经元和胶质细胞。目前已有多种方法可用于诱导神经干细胞分化，促使其产生成熟的神经元和胶质细胞。大量研究表明，在特定的培养条件和营养因子组合下，神经干细胞可在体外分化为神经元14、少突胶质细胞15,16以及星形胶质细胞17in vitro。根据文献报道，神经节隆起是获取具有分化为多种抑制性和兴奋性神经元潜能的神经干细胞的良好来源，例如可生成GABA能18和多巴胺能19神经元。因此，由于这些神经干细胞天然倾向于生成较高比例的GABA能神经元，它们成为研究抑制性神经元的适宜来源。
本文中，我们改进了脑微解剖技术，能够在对脑组织造成较小损伤的情况下，从E
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致谢
本工作由 Royan 研究所资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 离心管 | Falcon | 352097 | |
| 50 mL 离心管 | Falcon | 352235 | |
| Adson 镊子，12 cm，直头 | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A2153 | |
| 10 cm 培养皿 | Falcon | 353003 | |
| 敷料镊，12.5 cm，直头 | WPI | 15908 | |
| Dumont 镊子，11 cm，直头 | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| 乙醇 | Merck | 100983 | |
| 谷氨酸 | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| 山羊抗兔 FITC 标记二抗 | Sigma | AP307F | |
| 山羊血清 | Sigma | G9023 | |
| 肝素 | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| 胰岛素注射器配 25–27 号针头 | SUPA medical | A1SNL127 | |
| 层粘连蛋白 | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 添加剂 | Gibco | 17502048 | |
| NB 培养基 | Gibco | 21103-31 | |
| 非必需氨基酸（NEAA） | Gibco | 11140050 | |
| 不含 Ca 和 Mg 的 PBS | Gibco | 20012050 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 5140122 | |
| 多聚-L-鸟氨酸 | Sigma | P4957 | |
| 兔抗小鼠 β-微管蛋白 III 抗体 | Sigma | T2200 | |
| 兔抗小鼠 GFAP 抗体 | Sigma | G4546 | |
| 兔抗小鼠 Nestin 抗体 | Sigma | N5413 | |
| 手术刀柄 #3 | WPI | 500236 | |
| 弯头剪刀 | WPI | 14396 | |
| 尖头直剪 | WPI | 14192 | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 | Roche | 10109886001 | |
| 组织培养瓶，T25 | BD | 353014 | |
| 组织培养瓶，T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas 剪刀， 8 cm，直头 | WPI | 14003 | |
| β-巯基乙醇 | Sigma | M6250 |
参考文献
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