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方法文章

放射自显影作为一种简单而强大的药理学靶点可视化与表征方法

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DOI：

10.3791/58879

⸱

2019年3月12日

 ,  ,  , 
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI, Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET, Copenhagen University Hospital

本文内容

摘要

自显影技术通常用于研究放射性配体与组织切片的结合，以确定药物的定性或定量药理学特性。

摘要

体外放射自显影旨在可视化实验动物以及人类组织中目标蛋白的解剖学分布。该方法基于放射性配体与其生物靶标之间的特异性结合。因此，将冷冻组织切片与放射性配体溶液共同孵育，随后通过检测放射性衰变（例如使用感光胶片或磷屏成像板）来定位配体与靶标的结合部位。所得的数字放射自显影图像具有极佳的空间分辨率，可实现对特定解剖结构中放射性配体结合的定量分析与精确定位。此外，通过定量分析还可利用解离常数（Kd）、抑制常数（Ki）以及结合位点密度（Bmax）对配体亲和力进行药理学表征。因此，该方法可同时提供靶标定位和配体选择性的相关信息。本文以高亲和力γ-羟基丁酸（GHB）结合位点在哺乳动物脑组织中的放射自显影表征为例，重点阐述与结合实验参数、放射性配体选择及检测方法相关的技术要点。

引言

放射自显影是一种提供放射性衰变图像的方法。该技术常用于研究目标蛋白在组织中的分布情况 体外 基于放射性标记化合物与其靶点之间的特定药理学相互作用，从而提供配体对靶点选择性的直接信息。 体外 放射自显影也可用于定量测定放射性配体的药理学结合参数，例如解离常数（Kd）以及结合位点的密度（B最大值），以及确定抑制常数（Ki竞争性配体的量1,2与传统的匀浆放射性配体结合实验相比，放射自显影技术的优势在于能够可视化空间解剖结构，并简洁地展示区域表达模式的详细信息3因此，放射自显影技术是免疫细胞化学的一种相关替代方法，特别是在缺乏经过验证的抗体时尤为适用。只要具备具有所需药理学特异性的合适放射性配体、能够制备组织切片的冷冻切片机以及可分析各组织切片中放射性分布的适当成像设备，放射自显影技术便可在标准放射性同位素实验室中轻松实施。值得注意的是，放射性配体的一个重要筛选标准是其在非靶标位点的结合量应尽可能低。这种结合可能发生在其他蛋白质、膜结构或塑料、滤膜等材料上，统称为非特异性结合。通常情况下，非特异性结合是不可饱和的，但如果涉及特定的脱靶蛋白，则也可能呈现可饱和性。验证真实特异性结合的最佳方法是与缺乏靶标的组织进行比较。 例如，基因工程（敲除）组织4.

本文以γ-羟基丁酸（GHB）在哺乳动物脑内高亲和力结合位点的放射自显影表征为例，说明了相关方法学。阐明GHB与其结合位点之间的药理学相互作用具有重要意义，因为GHB不仅是一种在治疗发作性睡病和酒精依赖方面具有临床应用价值的药物5，同时也是哺乳动物脑内的天然成分以及一种娱乐性药物6。高亲和力GHB结合位点最初是通过[3H]GHB与大鼠脑匀浆结合实验发现的7。多年来，利用[3H]GHB及其类似物[3H]NCS-382进行的进一步放射自显影研究显示，在大鼠8,9,10、小鼠9、猪11以及猴/人脑12的前脑区域均存在高密度的结合位点。然而，这些结合位点的分子身份及其确切的功能意义至今仍不明确。

为了进一步表征GHB结合位点并促进对其生理作用的研究，已开发出多种携带不同同位素、具有不同亲和力的放射性配体，包括[3H]GHB、[3H]NCS-382、[3H]HOCPCA和[125I]BnOPh-GHB13,14,15,16（综述见17）（图1）。高选择性、高亲和力放射性配体与结合位点在组织中高度富集的特点相结合，使得利用磷屏成像技术获得高质量图像成为可能9,11。本文除概述放射自显影实验的实际操作要点并举例说明具体细节外，讨论部分将重点强调：i）放射性核素的选择；ii）测定条件的选择；iii）磷屏成像板与X射线胶片的比较使用。本论文的总体目标是提供有关放射自显影技术的技术性、方法学及科学细节，以支持对蛋白质靶点的组织分布及其药理学分析的研究。

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方案

所有动物操作均按照丹麦动物实验监察局的指南进行。

注意：此处所述方案涵盖组织制备（即，小鼠脑组织），的 体外 放射自显影分析方法的详细操作步骤，足以支持在新实验室中建立该技术，包括对磷屏成像板的曝光以及随后对放射自显影图像进行的密度测定分析图2) 旨在对不同解剖结构中放射性配体结合的位置进行定位和定量。为便于组织学比较，本方案包含焦油紫染色的操作步骤。此外，方案中还包括使用竞争性配体测定非特异性结合的内容。有关如何测定Kd，B最大 或 Ki，参见先前发表的文献4.

1. 冷冻切片法进行组织制备

  1. 通过颈椎脱位处死小鼠，立即使用剪刀和镊子解剖取出脑组织。直接进入下一步操作，以避免组织损伤。
  2. 将组织浸入粉末状干冰或气态 CO₂ 中进行速冻2 或异戊烷。将冷冻的组织直接转移至预冷至 -20 °C 的冷冻切片机中20 °C. 或者，将组织储存在 -80 °C 直至处理前。
    注意：避免反复冻融，以减少组织损伤。
  3. 让组织在 -20 °C 在进一步处理前，于冷冻切片机中放置20分钟，以避免组织碎裂。
  4. 将组织托盘从冷冻切片机中取出，用包埋介质覆盖托盘，在包埋介质仍处于液态时迅速将冷冻的组织样本以所需方向放置。例如，将小鼠脑垂直放置于小脑部位，以获得吻端冠状切面。将组织托盘放回冷冻切片机内，使包埋介质暴露于低于 -10 °C 用于硬化。
    注意：在安装前，应将脆弱的组织样本置于组织模具中，并用包埋介质包被。
  5. 将组织托架置于冷冻切片机的切片位置，调整组织的方向以避免产生倾斜的切片。
  6. 根据立体定位图谱的指引切割组织18 在所需厚度的切片中（12 µm 推荐用于 [3H]标记的配体）。如有必要，使用小号刷子小心展平并展开切片，然后将切片解冻贴附到显微镜载玻片上。按顺序收集目标区域的切片，以满足所需的技术重复要求（例如，每张切片4个区域。
  7. 将载玻片上的切片在室温下晾干1小时，然后再进行后续操作。
    注意：在载玻片盒中加入干燥剂可减少组织切片上的湿气积聚。此处可将切片长期保存于-80°C的载玻片盒中，暂停本方案。80 °C.

2. 体外放射自显影

警告：放射性。须在经认证的实验室中根据当地法规进行操作。穿戴防护服。按照放射性衰变规定处置，或交由认证公司处理。

  1. 在室温（RT）下解冻切片至少 30 分钟。用铅笔在载玻片上标记实验条件，因为在后续染色过程中载玻片将浸入乙醇，故需使用铅笔标记。
  2. 将载玻片水平放置于塑料托盘中。
    注意：将载玻片置于塑料托盘内的 elevated platform 上有助于操作。
  3. 将载玻片上的切片在针对特定目标调整好的测定缓冲液中预孵育（对于GHB方案，使用50 mM KHPO₄）4 缓冲液 pH 6.0）通过将适量液体小心地加至载玻片上（700 µL 用于3-4个啮齿类动物的冠状切片。
    注意：确保每个区域均被液体完全覆盖。
    1. 用盖子盖住塑料培养板，以防止蒸发，并在相应的温度下（GHB 方案为室温）在板式摇床中以恒定的温和振荡（20 rpm）预孵育 30 分钟。
    2. 为测定非特异性结合，向测定缓冲液中加入相应浓度的未标记化合物（GHB 实验方案中为 1 mM GHB）。
      注：可能无需预孵育。
  4. 倒掉每张载玻片上的预孵育液体，并将载玻片放回塑料托盘中。
  5. 为避免脱水，立即在所需条件下，将切片置于含有适当浓度放射性配体的测定缓冲液中孵育（GHB方案使用1 nM [3H]HOCPCA 在室温下孵育 1 小时）通过将切片完全覆盖于放射性配体溶液中700 µL 用于3-4个啮齿类动物冠状切片。
    1. 在盖上盖子的塑料托盘中，于恒定温和振荡（20 rpm）条件下孵育。
      注意：可通过液体闪烁计数器测定分样来验证放射性配体的浓度。
  6. 倒掉孵育液，将玻片转移至显微镜玻片架中。立即进行下一步操作，以避免切片脱水。
  7. 洗涤载玻片。对于GHB方案，先用预冷的检测缓冲液冲洗两次，每次20秒，然后将载玻片架浸入盛有预冷蒸馏水的托盘中漂洗两次，以去除盐分。将载玻片垂直置于架中，在室温下自然晾干至少1小时，或使用冷风设置的吹风机吹干5分钟。
    注意：洗涤步骤必须优化， 例如，充分洗涤可能有助于减少非特异性结合。
  8. 将载玻片转移至含有多聚甲醛（PFA）粉末的固定装置中，于室温下利用PFA蒸气过夜固定，以保护配体-靶标复合物的完整性。
    警告：多聚甲醛（PFA）有毒。应将固定剂置于通风橱中操作，避免皮肤或眼睛接触PFA。
  9. 次日，将载玻片转移至含有硅胶的干燥器中，在室温下放置3小时以去除水分。

3. 暴露于磷光成像板及扫描

  1. 将切片放入具有辐射屏蔽功能的成像板暗盒中，组织面朝上。为了后续对放射性配体结合进行定量分析，每个暗盒中均需放入一个[3H]微标尺。将切片随机排列，并在同一暗盒中进行曝光，以便直接比较。
  2. 在使用前立即擦除氚敏感型磷屏成像板，以清除储存期间积累的信号并消除背景信号。因此，应按照制造商的说明，将成像板装入磷屏成像仪中，并暴露于可见光/红外光下进行擦除。
  3. 从磷屏成像仪中取出成像板，并立即将其放置到暗盒中的切片上。确保暗盒完全闭合。在室温避光条件下，使切片与磷屏成像板接触曝光3天。
  4. 由于光照会擦除成像板上的信号，因此应在暗处小心打开暗盒，并立即将成像板转移至磷屏成像仪的暗箱中，或将磷屏成像仪置于暗室中。
    注意：为确保在分析后的数字图像中能够识别各个样本，必须在曝光期间记录载玻片的空间排列位置。因此，磷屏成像板的一个角通常被切割成特定角度，以便在数字图像中识别成像板的正确方向。
  5. 以尽可能高的分辨率扫描成像板，以获得数字图像。

4. 可选步骤：组织切片的焦油紫染色

  1. 将5 g乙酸甲苯胺紫溶于500 mL去离子水（dH₂O）中，配制1%甲苯胺紫溶液2O），直至完全溶解（约2小时）。使用漏斗和滤纸过滤，收集滤液至新的500 mL瓶中。调节pH至3.5–3.8。
  2. 将玻片染色套装置于通风橱内。在白色聚丙烯托盘中准备以下溶液（二甲苯除外）：
    a. 50% 乙醇/50% 去离子水2O
    b. 70% 乙醇/30% dH₂O2O
    c. 100% 乙醇
    d. 100% 乙醇
    e. 100% 去离子水2O
    f. 1% 甲苯胺蓝
    g. 0.07% 乙酸（添加 175 µL 将乙酸加入至250 mL dH₂O中2O).
    h. 绿色耐溶剂托盘中的100%二甲苯
    i. 绿色耐溶剂托盘中的100%二甲苯
  3. 将载玻片转移至通风橱中，并放入载玻片架内。
  4. 通过在 dH₂O 中逐步增加梯度浓度的乙醇溶解脂质2将切片浸入100%乙醇（a-d号托盘）中1分钟。
  5. 将标本重水化至去离子水2通过将载玻片依次浸入浓度递减的乙醇中（按相反顺序使用 a-d 槽，随后使用 e 槽）进行处理，每步 1 分钟。
  6. 将标本浸入焦油紫溶液中染色10分钟。
  7. 用移液器将切片在 0.07% 乙酸溶液中轻轻上下移动 4–8 秒，以冲洗样本。通过将切片浸入 dH₂O 中洗涤。2O 1 分钟。
  8. 将载玻片依次浸入递增浓度的乙醇（a-d号托盘）中，每个浓度处理30秒，以进行标本脱水。
  9. 将样本依次转移至两个盛有100%二甲苯的托盘（托盘h和i）中，以淬灭乙醇。
  10. 将标本重水化至去离子水2通过将载玻片依次浸入浓度递减的乙醇中（按相反顺序使用 a-d 槽，随后使用 e 槽）进行处理，每步 1 分钟。
  11. 用镊子将载玻片从盐水中取出。每张载玻片上滴加数滴有机溶剂封片介质，加盖 24 × 60 mm 的盖玻片以保护样本。轻轻按压盖玻片，排除样本与盖玻片之间的气泡。
    注意：封片过程中应将剩余切片置于二甲苯中，以防止干燥。
  12. 在室温下于通风橱中将载玻片干燥过夜。
  13. 使用显微镜和1.25倍物镜获取样本图像。

5. 数字图像的光密度分析

  1. 测量每个校准标准品的相对光密度（RODs）从[3H]微尺度，使用图像分析软件。
    1. 为每个点选择相同大小的区域3H]微尺度使用一种工具进行 区域创建 来自菜单项 区域确定. 通过点击为每个选定的区域分配一个编号 数量 在菜单项下 标记.
    2. 通过单击导出校准标准每个点的 OD 值 文件 | Export | 二维区域报告将ROD值导入电子表格，并根据所选区域的大小进行归一化处理。通过线性回归分析获得标准曲线，用于后续的密度测定分析。
      注意：应标记所选区域，以便识别对应的 ROD 值和样品。
  2. 使用专用成像软件通过选择感兴趣区域（ROI）对放射自显影图像进行定量分析 区域创建 在每个切片中使用工具测量其OD值。通过创建感兴趣区域的模板，在每个切片中选择相同的区域，并将该模板复制后手动调整，以适应每张放射自显影图像中脑解剖结构的微小差异。通过将放射自显影图像与脑图谱进行比对，确定感兴趣区域的解剖位置18当比较多种处理时，应对分析过程进行盲法和随机化处理，以避免对感兴趣区域（ROIs）的选择产生偏倚。
  3. 单击以将选定区域的 ROD 值和尺寸导出到电子表格中 文件 | Export | 二维区域报告.
  4. 将所选 ROI 的测量 ROD 除以其面积，以获得单位面积的密度。
  5. 测量培养板背景的ROD值，并将相应的ROD值和面积大小导出至电子表格中。从每个ROI的ROD值中减去平均背景信号。
  6. 对技术重复的相对光密度值（RODs）取平均值， 即使用同一只动物的组织进行区段重复。
  7. 使用标准曲线将光密度值（ROD）转换为放射性配体结合单位。 即nCi/mg 组织当量（TE）
    注意：使用 TE 这一术语是因为采用模拟组织的材料来生成标准品。
  8. 根据放射性配体的比活性，通过将每毫克的纳居里（nCi/mg）转换为每毫克的纳摩尔三碘甲状腺原氨酸当量（nmol/mg TE）来表示结合活性（公式1）。
    配体结合计算公式，特异性活性分析方程，生物化学研究 (1)
  9. 为获得特异性结合值，需从总结合中减去非特异性结合。
  10. 使用每个动物的技术重复（在步骤5.6中获得）的平均值，计算每个生物学重复的结合水平的平均值。

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结果

通过使用所述方案，利用放射性标记的GHB类似物[3H]HOCPCA对小鼠脑组织中的高亲和力GHB结合位点的解剖分布进行了可视化，脑组织被切成冠状面、矢状面和水平面切片（图3）。在海马和皮层中观察到高水平的结合，在纹状体中结合水平较低，而在小脑中未检测到结合，这与先前报道的高亲和力GHB结合位点的表达模式一致9,10,11,12。如本图所示，可通过不同切面方向观察解剖结构，并可通过焦油紫染色支持组织解剖完整性。对于GHB高亲和力结合位点，尤其是放射性配体结合水平较低的区域（如小脑），可通过后续组织染色加以确认（图3）。冠状面切片在文献中最常见9<...

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讨论

自显影分析的质量通常取决于放射性配体的灵敏度。其中一个主要影响因素是所选用的放射性同位素，其选择依据为已知配体的可获得性，或特定标记技术在产生具有适当比活度（即，单位摩尔放射性配体所含的放射性活度）且化学降解程度较低的配体方面的可行性23。大量已知配体的放射性配体均使用氚进行标记9,10,24,25,26，这具有多项优势。首先，氚（3H）具有较长的半衰期（12.43年），有利于各批次试剂的长期储存。其次，由于3H标记的配体在生物学上与其母体化合物无法区分，因此放射性核素不会干扰配体与靶标的相互作用。氚释放低能量的β-粒子，在组织中穿透距离短，从而实现高空间分辨率，进而更清晰地区分解剖结...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由灵北基金会（资助号 R133-A12270）和诺和诺德基金会（资助号 NNF0C0028664）提供支持。作者感谢 Aleš Marek 博士提供[3H]放射性配体。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无水乙醇Merck Millipore107017
乙酸Sigma-AldrichA6283
BAS-TR2040 成像板GE Healthcare Life Science2895648120×40 cm — 对氚敏感
醋酸克里西林紫Sigma-AldrichC5042-10G
DPX（非水性显微镜封片介质）Merck Millipore100579
O.C.T. 包埋剂，12 × 125 mLSakura4583Tissue-Tek
多聚甲醛Sigma-Aldrich16005-1KG-R
Superfrost Plus 载玻片VWR631-9483显微镜载玻片
Tissue-Tek 手动玻片染色套装Sakura Finetek Denmark ApS4451
玻璃基氚标准品American Radiolabeld Chemicals, Inc.ART 0123
二甲苯替代品Sigma-AldrichA5597

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放射自显影作为一种简单而强大的药理学靶点可视化与表征方法
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