自体影像学作为一种简单而有力的药理靶标可视化和表征方法

Summary

自体影像学方法通常用于研究放射线与组织切片的结合, 以确定定性或定量药理学。

Abstract

体外自动摄影的目的是想象实验动物和人类对组织感兴趣的蛋白质的解剖分布。该方法是基于辐射寡核苷酸及其生物目标的特定结合。因此, 冷冻组织切片用辐射和溶液孵育, 然后通过检测放射性衰变来定位与目标的结合, 例如, 使用光敏膜或荧光粉成像板。由此产生的数字自动测底图显示出显著的空间分辨率, 从而能够在不同的解剖结构中对辐射寡核苷酸进行定量和定位。此外, 定量允许通过离解常数 (k_d)、抑制常数 (k i) 以及选定组织中的结合位点密度 (b_最大值) 对配体亲和力进行药理鉴定.因此, 该方法提供了有关目标定位和配体选择性的信息。在这里, 这项技术的例子是在哺乳动物脑组织中高亲和力γ-羟基丁酸 (ghb) 结合位点的自体成像表征, 特别强调了有关结合试验的方法学考虑。参数、辐射点的选择和检测方法。

Introduction

自动摄影是一种提供放射性衰变图像的方法。该技术通常用于研究一种感兴趣的蛋白质在体外的组织分布, 其基础是放射性标记化合物与其靶点之间的特定药理相互作用。这提供了有关目标配体选择性的直接信息。体外自体影像学也可用于定量测定放射性药物的药理结合参数, 如离解常数 (k_d) 和结合位点密度 (b_最大值), 以及用于测定竞争配体^1,2的抑制常数 (_{k i})。与传统的同质辐射结合相比, 自动影像学具有能够可视化空间解剖和给出区域表达模式简洁细节^{的优点 3}。因此, 自体影像学方法是免疫细胞化学的相关替代方法, 尤其是在没有经过验证的抗体的情况下。在标准的放射性同位素实验室中, 由于有合适的放射位基因和所需的药理特异性, 可以使用用于制备组织切片的微孔低温恒温器, 以及适当的成像, 因此可以很容易地在标准的放射性同位素实验室进行自体测药能够分析各自组织切片中放射性分布的装置。值得注意的是, 辐射寡核苷酸的一个重要选择标准是与非目标地点的结合数量有限。这可以是其他蛋白质, 膜或材料, 如塑料或过滤器, 并统称为非特异性结合。通常情况下, 非特异性结合是不饱和的, 但如果它涉及特定的非目标蛋白, 则可以是饱和的。验证真正的特定结合的最佳方法是将缺乏目标的组织进行比较,例如

Protocol

所有动物处理都是按照丹麦动物实验监察局的准则进行的。

注: 此处描述的协议包括组织准备 (即小鼠脑组织)、体外自动影像学检测, 以便在新的实验室中建立该方法、暴露于荧光粉成像板以及随后对自动影像学进行密度分析 (图 2), 目的是在不同的解剖结构中定位和定量放射性寡核苷酸结合。为了进行组织学比较, 包括了环己基紫罗兰色染色的协议。此外, 确定具有竞争配体的非特定结合已列入议定书。有关如何确定 k_d、b_最大值或 k_{i 的}详细说明, 请参阅以前的出版物⁴。

1. 冷冻切片组织的制备

1. 通过颈椎脱位使小鼠安乐死, 并立即使用剪刀和钳子解剖大脑。直接进入下一步, 以避免组织损伤。
2. 通过在粉状干冰、气体_二氧化碳或异戊烷中浸泡来冷冻组织。将冷冻组织直接转移到温度设置为-20°c 的低温恒温器中。或者, 将组织保存在-80°c, 直到处理。
   注: 避免反复解冻/冷冻, 以减少组织损伤。
3. 在进一步处理之前, 让组织在低温恒温器中符合-20°c-20°c, 以避免组织破碎。
4. 用冷冻恒温器外的嵌入介质覆盖组织支架, 并在嵌入介质仍....

Results

使用所述协议, 利用小鼠大脑中的放射性 ghb 模拟 [³h] hocpca 对高亲和力 ghb 结合位点的解剖分布进行了可视化, 该模拟被切割成冠状、矢状和水平部分 (图 3).).在海马和皮层中观察到高度的结合, 在纹状体中较低的结合, 在小脑中没有发现结合, 这与以前报告的高亲和力 ghb 位点^9、10的表达模式相对^{应。 11,12}。如图所示, 解剖结构可以通过不同的切片平面进行可视化, 解剖完整性可以通过 cresyl 紫红色染色来支持。对于 ghb 高亲和力结合位点, 特别是低半径结合区 (如小脑), 随后通过组织染色得到确认 (图 3)。日冕部分在文学

Discussion

自体影像学检测的质量通常是由放射线的敏感性决定的。一个主要的促成因素是选定的放射性同位素, 它是根据已知配体的供应情况或特定标签技术产生具有适当特定活性 (即放射性的数量) 的配体的可行性得出的每单位摩尔的一个半径)²³和有限的化学降解量。大量已知配体的放射性被贴上了^{9、10、24、25、26}的标记, 这推断了几个优势。首先, (³h) 的特点是半衰期长 (12.43年), 促进单个批次的长期储存。其次, 配体-目标相互作用不会被放射性核素扭曲, 因为³h-配体在生物学上与其亲本化合物无法区分。发射低能β-粒子, 这些粒子在组织中的距离很短, 因此空间分辨率很高, 随后解剖结构

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
无水乙醇	默克 Millipore	107017
乙酸	Sigma-Aldrich	A6283
BAS-TR2040 成像板	GE Healthcare 生命科学	28956481	20x40 cm - 对氚敏感
甲酚紫乙酸	Sigma-Aldrich	C5042-10G
DPX（显微镜用非水性封固剂）默	克Millipore	100579
O.C.T. 化合物，12 x 125 mL	Sakura	4583	组织-Tek
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R
Superfrost Plus 载玻片	VWR	631-9483	显微镜载玻片
Tissue-Tek 手动载玻片染色套装	Sakura Finetek 丹麦 ApS	4451
玻璃	氚标准品美国放射性标记化学品公司	ART 0123
二甲苯替代品	Sigma-Aldrich	A5597