自体影像学作为一种简单而有力的药理靶标可视化和表征方法

Summary

自体影像学方法通常用于研究放射线与组织切片的结合, 以确定定性或定量药理学。

Abstract

体外自动摄影的目的是想象实验动物和人类对组织感兴趣的蛋白质的解剖分布。该方法是基于辐射寡核苷酸及其生物目标的特定结合。因此, 冷冻组织切片用辐射和溶液孵育, 然后通过检测放射性衰变来定位与目标的结合, 例如, 使用光敏膜或荧光粉成像板。由此产生的数字自动测底图显示出显著的空间分辨率, 从而能够在不同的解剖结构中对辐射寡核苷酸进行定量和定位。此外, 定量允许通过离解常数 (k_d)、抑制常数 (k i) 以及选定组织中的结合位点密度 (b_最大值) 对配体亲和力进行药理鉴定.因此, 该方法提供了有关目标定位和配体选择性的信息。在这里, 这项技术的例子是在哺乳动物脑组织中高亲和力γ-羟基丁酸 (ghb) 结合位点的自体成像表征, 特别强调了有关结合试验的方法学考虑。参数、辐射点的选择和检测方法。

Introduction

自动摄影是一种提供放射性衰变图像的方法。该技术通常用于研究一种感兴趣的蛋白质在体外的组织分布, 其基础是放射性标记化合物与其靶点之间的特定药理相互作用。这提供了有关目标配体选择性的直接信息。体外自体影像学也可用于定量测定放射性药物的药理结合参数, 如离解常数 (k_d) 和结合位点密度 (b_最大值), 以及用于测定竞争配体^1,2的抑制常数 (_{k i})。与传统的同质辐射结合相比, 自动影像学具有能够可视化空间解剖和给出区域表达模式简洁细节^{的优点 3}。因此, 自体影像学方法是免疫细胞化学的相关替代方法, 尤其是在没有经过验证的抗体的情况下。在标准的放射性同位素实验室中, 由于有合适的放射位基因和所需的药理特异性, 可以使用用于制备组织切片的微孔低温恒温器, 以及适当的成像, 因此可以很容易地在标准的放射性同位素实验室进行自体测药能够分析各自组织切片中放射性分布的装置。值得注意的是, 辐射寡核苷酸的一个重要选择标准是与非目标地点的结合数量有限。这可以是其他蛋白质, 膜或材料, 如塑料或过滤器, 并统称为非特异性结合。通常情况下, 非特异性结合是不饱和的, 但如果它涉及特定的非目标蛋白, 则可以是饱和的。验证真正的特定结合的最佳方法是将缺乏目标的组织进行比较,例如基因工程 (淘汰赛) 组织⁴。

在这里, 该方法说明了与自交图表征的高亲和力结合位点的γ-羟基丁酸 (ghb) 在哺乳动物大脑中。了解 ghb 与其结合部位之间的药理作用具有重要意义, 因为 ghb 既是治疗嗜睡和酒精中毒^的临床有用药物, 也是哺乳动物大脑的天然成分和娱乐药物⁶。高亲和力 ghb 结合位点首次被描述使用 [³h] ghb 结合大鼠大脑均质7。多年来, 进一步的自体影像学研究 [³h] ghb 和类似 [³h] ncs-382 已显示高密度结合位的前脑区域的大鼠 8^,9,^{10, 小}鼠⁹猪¹¹和猴子人^{的大脑 12}。然而, 这些结合位点的分子特性和确切的功能相关性仍然难以捉摸。

为了进一步确定结合位点的特征, 并便利对 ghb 的生理作用进行研究, 开发了含有不同亲和力的不同同位素的多种放射性寡头 ([³h] ghb, [³h] ncs-382、[³h] hopcca 和 [¹²⁵i] bnoph-ghb)^{13、14、15、16}(17 审查)(图 1)。选择性高亲和力放射性和非常高的组织密度的结合结合结合结合, 使使用荧光粉成像技术^9,11的高质量图像得以产生。除了在建立自动摄影实验的实际要点和一个例子来说明细节的情况外, 讨论部分将强调 (一) 放射性核素的选择, (二) 检测条件的选择, 以及 (三) 荧光粉的使用成像板与 x 射线胶片的对比。本文的总体目标是提供有关自体影像学技术的技术、方法和科学细节, 以了解蛋白质靶的组织分布和药理分析。

Protocol

所有动物处理都是按照丹麦动物实验监察局的准则进行的。

注: 此处描述的协议包括组织准备 (即小鼠脑组织)、体外自动影像学检测, 以便在新的实验室中建立该方法、暴露于荧光粉成像板以及随后对自动影像学进行密度分析 (图 2), 目的是在不同的解剖结构中定位和定量放射性寡核苷酸结合。为了进行组织学比较, 包括了环己基紫罗兰色染色的协议。此外, 确定具有竞争配体的非特定结合已列入议定书。有关如何确定 k_d、b_最大值或 k_{i 的}详细说明, 请参阅以前的出版物⁴。

1. 冷冻切片组织的制备

1. 通过颈椎脱位使小鼠安乐死, 并立即使用剪刀和钳子解剖大脑。直接进入下一步, 以避免组织损伤。
2. 通过在粉状干冰、气体_二氧化碳或异戊烷中浸泡来冷冻组织。将冷冻组织直接转移到温度设置为-20°c 的低温恒温器中。或者, 将组织保存在-80°c, 直到处理。
   注: 避免反复解冻/冷冻, 以减少组织损伤。
3. 在进一步处理之前, 让组织在低温恒温器中符合-20°c-20°c, 以避免组织破碎。
4. 用冷冻恒温器外的嵌入介质覆盖组织支架, 并在嵌入介质仍是液体的情况下, 快速将冷冻组织标本置于所需的方向。例如, 将鼠标大脑垂直地放在小脑上, 以实现正常的冠状部分。将组织支架转移回低温恒温器, 并将嵌入介质暴露在-10°c 以下的温度下进行硬化。
   注: 在安装之前, 应将易碎的组织标本涂在组织模具内的嵌入介质中。
5. 将组织支架放置在低温恒温器的微体中。调整组织的方向, 以避免倾斜的部分。
6. 在立体导图^集18 的引导下, 在所需厚度的部分 (^{建议 [3}h] 标记的配体为12微米) 切割组织。如有必要, 请小心地拉直并展开部分, 并将该部分解冻安装在显微镜幻灯片上。按顺序从感兴趣的区域收集部分, 以便进行所需的技术复制 (例如, 每张幻灯片4个部分)。
7. 在进一步处理之前, 请让滑梯上的部分风干1小时。
   注: 在滑箱中添加干燥剂材料可最大限度地减少组织部分积聚的水分。通过将部分长期存放在-80°c 的幻灯片箱中, 可以在这里暂停。

2.体外自动影像学

注意: 放射性。根据当地法规在经过认证的实验室工作。穿防护服。根据放射性衰变或外包给经认证的公司。

1. 在室温 (rt) 下解冻部分至少30分钟。使用实验条件标记幻灯片。使用铅笔, 因为幻灯片将沐浴在乙醇在随后的染色。
2. 将幻灯片水平放置在塑料托盘中。
   注: 在塑料托盘内的高架平台上定位幻灯片有助于其处理。
3. 通过在滑块上仔细地将适当的体积 (3-4 个啮齿类动物冠状切片为 700μl), 对安装在检测缓冲液中的部分进行预培养, 并根据问题进行调整 (对于 ghb 协议, 使用 50 mm khpo 4 缓冲液 ph 6.0)。
   注: 请确保每个部分完全覆盖液体。
   1. 用盖子覆盖塑料托盘, 以避免在相关温度下蒸发和预孵化 (对于 ghb 协议在 rpm 预孵化 30分钟), 在板振动台的不断温和 (20 转/分) 晃动下。
   2. 用于测定非特异性结合, 用相关浓度的未标记化合物补充测定缓冲液 (适用于 ghb 协议, 1 mm ghb)。
      注: 预孵化可能不需要。
4. 从每张幻灯片中倒出预孵化液, 然后将滑块转移回塑料托盘。
5. 为避免脱水, 请在所需条件下 (对于 ghb 协议, 1 nm [3 h] hocpca, 1 nm [³h] hocpca, 在 rt 上覆盖这些部分, 将这些部分完全覆盖在辐射寡并且溶液 (低千千四只啮齿类动物冠状切片, 为 700μl)。
   1. 在紧闭盖子的塑料托盘在不断温和 (20 转/分) 晃动下孵化。
      注: 在液体闪烁计数器中计数一个脂肪, 可以验证辐射和浓度。
6. 通过将液体倒出并将幻灯片转移到显微镜滑块架中, 取出培养液。立即继续执行下一步, 以避免部分脱水。
7. 清洗幻灯片。对于 ghb 协议, 用冰凉检测缓冲液清洗两次, 时间为 20秒, 然后通过将滑盘架浸入充满冰凉蒸馏水的托盘中进行两次冲洗, 以去除盐分。将滑块垂直放置在机架中, 以便在 racks 进行至少1小时的空气干燥, 或将滑块干燥 5分钟, 并将鼓风机设置为冷温度。
   注: 清洗必须优化,例如, 大量清洗可能有助于减少非特异性结合。
8. 将滑块转移到含有聚甲醛 (pfa) 粉末的固定器中, 以便在 rt 使用 pfa 蒸汽进行隔夜固定, 从而保护配体靶向复合物的完整性。
   注意: pfa 是有毒的。将固定器定位在烟罩中, 避免与 pfa 进行皮眼接触。
9. 第二天, 将幻灯片转移到含有硅胶的干燥箱, 在 rt 工作 3小时, 以消除水分。

3. 接触荧溶成像板和扫描

1. 将切片放置在带辐射屏蔽的成像板盒中, 组织朝上。为了随后对放射性寡核苷酸和结合进行定量, 在每个盒式磁带中包括一个 [^3h] 的微刻度。随机排列各部分, 并在同一盒式磁带中公开部分以进行直接比较。
2. 在使用前立即擦除对三敏感磷成像板, 以消除存储中累积的信号并消除背景信号。因此, 请将板材加载到荧光粉成像机中, 并根据制造商的说明将其暴露在可见光下。
3. 从荧光粉成像机上取下板材, 并立即将其放置在盒式磁带中的部分。确保盒式磁带已完全关闭。在免受光线保护的 rt 中, 将切片暴露在荧光材料成像板上3天。
4. 由于光线会擦除成像板发出的信号, 因此请在黑暗中小心地打开盒式磁带, 并立即将成像板转移到荧光粉成像仪的暗箱中, 或将荧光粉成像仪放置在黑暗的房间中。
   注: 请确保在曝光过程中标记幻灯片的空间排列, 以便在分析后识别数字图像上的单个标本。因此, 荧光粉成像板也以不同的角度显示一个角部切割, 以确定该板在数字图片上的正确方向。
5. 以尽可能高的分辨率扫描板, 以获得数字图像。

4. 可选: 组织切片的 cresyl 紫罗兰染色

1. 将5克状醋酸甲酯混合在500毫升去离子水 (_dh2o)中, 制备1% 的环氧基紫罗兰色溶液, 直至溶解 (约 2小时)。使用漏斗过滤滤纸, 将其过滤成新的500毫升瓶。将 ph 值调整为 3.5-3.8。
2. 将设置的幻灯片染色设置在烟罩下。在白色聚丙烯托盘 (二甲苯除外) 中使用以下溶液准备托盘:
   a. 50% 乙醇/50%_dh2o
   b. 70% 乙醇/30% dh2o
   c. 100% 乙醇
   d. 100% 乙醇
   e. 100% dh2o
   f. 1% 环氧基紫罗兰色
   g. 0.07% 醋酸 (将175μl 的醋酸加入250毫升的 dh2o)。
   h. 绿色耐溶剂托盘中的100% 二甲苯
   i. 100% 二甲苯在绿色耐溶剂托盘中
3. 将幻灯片传输到通风罩, 并将其放置在幻灯片架中。
4. 通过将 dh2o_中的分级系列乙醇加入100% 乙醇 (托盘 a-d), 将滑块浸渍 1分钟, 将脂质溶解。
5. 通过浸渍滑块 1分钟, 将样品补充至_dh2o,方法是降低乙醇浓度 (按相反顺序降低托盘 a-d, 然后是托盘 e)。
6. 将样品浸泡在环己基紫罗兰溶液中10分钟。
7. 用0.07% 的醋酸将试样冲洗干净, 轻轻向上和向下提起 4-8, 用 dh2o 浸渍 1年, 将滑块冲洗干净.
8. 将滑块浸入乙醇浓度上升的 30分钟, 使样品脱水。
9. 将样品通过两个100% 二甲苯 (托盘 h 和 i) 的托盘转移, 以淬火乙醇。
10. 通过浸渍滑块 1分钟, 将样品补充至_dh2o,方法是降低乙醇浓度 (按相反顺序降低托盘 a-d, 然后是托盘 e)。
11. 用钳子从盐水中取出幻灯片。在每张幻灯片上添加几滴有机溶剂安装介质, 并在顶部添加 24 x 60 mm 的盖板, 以保护样品。轻轻按压样品和覆盖物之间的气泡。
    注: 在安装过程中, 将剩余的滑块保存在二甲苯中, 以防止干燥。
12. 在 rt 的烟罩里连夜擦干滑梯。
13. 用显微镜和 1.25 x 目标获取标本的图片。

5. 数字图像的密度分析

1. 使用图像分析软件从 [³h] 微刻度测量每个校准标准的相对光学密度 (rod)。
   1. 使用用于创建 "区域"的工具, 从菜单项 "区域" 确定中为[ ³h] 微刻度的每个点选择一个大小相等的区域。通过单击菜单项 "标签"下的"数字", 为每个选定区域分配一个数字。
   2. 通过单击"文件"导出校准标准的每个点的 od 值e报告.将 rod 值传输到电子表格, 并按所选区域的大小进行规范化。执行线性回归, 以获得进一步密度分析的标准曲线。
      注: 确保所选区域的标签, 以确定匹配的 rod 值和样本。
2. 使用专有成像软件, 使用每个部分的区域创建工具选择感兴趣的区域 (roi) 并测量其 od, 从而对自动影像学进行量化。通过为感兴趣的区域创建一个模板, 在每个部分中选择相同的区域, 该模板将被复制并手动调整为每个自动标记的大脑解剖的微小变化。通过将自动影像学与大脑地图集¹⁸进行比较, 确定 roi 的解剖结构。当比较多个处理时, 执行盲目和随机的分析, 以避免偏颇的 roi 选择。
3. 通过单击"文件",将选定区域的 rod 值和大小导出到电子表格中e报告.
4. 将所选 roi 的测量 rod 除以其面积, 以获得每个特定区域的密度。
5. 测量板的背景的 rod, 并将相应的 rod 值和面积大小导出到电子表格中。从每个 roi 的每个 rod 值中减去平均背景信号。
6. 技术复制的平均 rod,即使用同一动物的组织复制的部分。
7. 使用标准曲线将 rod 转换为辐射和结合的单位,即nCi/mg 组织等价物 (te)。
   注: 之所以使用 te 一词, 是因为标准是用模拟组织的材料生成的。
8. 根据放射线的特异性活性 (公式 1), 通过将 nci变 mg 转化为 nmomsg/ge 来表达结合。
   (2)
9. 若要获取特定绑定值, 请从总绑定中减去非特定绑定。
10. 通过使用每种动物的技术复制平均值 (在步骤5.6 中获得), 平均每种生物复制的结合。

Results

使用所述协议, 利用小鼠大脑中的放射性 ghb 模拟 [³h] hocpca 对高亲和力 ghb 结合位点的解剖分布进行了可视化, 该模拟被切割成冠状、矢状和水平部分 (图 3).).在海马和皮层中观察到高度的结合, 在纹状体中较低的结合, 在小脑中没有发现结合, 这与以前报告的高亲和力 ghb 位点^9、10的表达模式相对^{应。 11,12}。如图所示, 解剖结构可以通过不同的切片平面进行可视化, 解剖完整性可以通过 cresyl 紫红色染色来支持。对于 ghb 高亲和力结合位点, 特别是低半径结合区 (如小脑), 随后通过组织染色得到确认 (图 3)。日冕部分在文学

Discussion

自体影像学检测的质量通常是由放射线的敏感性决定的。一个主要的促成因素是选定的放射性同位素, 它是根据已知配体的供应情况或特定标签技术产生具有适当特定活性 (即放射性的数量) 的配体的可行性得出的每单位摩尔的一个半径)²³和有限的化学降解量。大量已知配体的放射性被贴上了^{9、10、24、25、26}的标记, 这推断了几个优势。首先, (³h) 的特点是半衰期长 (12.43年), 促进单个批次的长期储存。其次, 配体-目标相互作用不会被放射性核素扭曲, 因为³h-配体在生物学上与其亲本化合物无法区分。发射低能β-粒子, 这些粒子在组织中的距离很短, 因此空间分辨率很高, 随后解剖结构

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
无水乙醇	默克 Millipore	107017
乙酸	Sigma-Aldrich	A6283
BAS-TR2040 成像板	GE Healthcare 生命科学	28956481	20x40 cm - 对氚敏感
甲酚紫乙酸	Sigma-Aldrich	C5042-10G
DPX（显微镜用非水性封固剂）默	克Millipore	100579
O.C.T. 化合物，12 x 125 mL	Sakura	4583	组织-Tek
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R
Superfrost Plus 载玻片	VWR	631-9483	显微镜载玻片
Tissue-Tek 手动载玻片染色套装	Sakura Finetek 丹麦 ApS	4451
玻璃	氚标准品美国放射性标记化学品公司	ART 0123
二甲苯替代品	Sigma-Aldrich	A5597