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方法文章

利用活体成像追踪成肌细胞分化与融合过程中的细胞核动态

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DOI：

10.3791/58888

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2019年4月13日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chromatin Dynamics Unit, Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) San Raffaele Scientific Institute, 2Vita-Salute San Raffaele University, 3Department of Electronics, Information and Bioengineering, Politecnico di Milano

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

骨骼肌分化是一个高度动态的过程，尤其依赖于细胞核的定位。本文介绍了一种通过活细胞成像技术在成肌细胞分化及肌管形成过程中追踪细胞核运动的方法，并通过自动追踪获取的信息对细胞核动态进行定量表征。

摘要

细胞内细胞核的定位对于发育和再生过程中的多种细胞活动至关重要。其中最引人注目的例子发生在骨骼肌分化过程中。肌纤维（myofibers）是由肌肉干细胞（卫星细胞）衍生的肌肉前体细胞（成肌细胞，myoblasts）经过增殖和分化后融合形成的多核细胞。肌纤维内细胞核的正确分布对于肌肉的正常再生和功能至关重要。目前评估成肌细胞分化和肌纤维形成的标准方法主要依赖于固定细胞的免疫荧光分析，这种方法限制了对细胞核运动和细胞行为随时间变化的动态研究。本文中，我们描述了一种利用活细胞成像技术分析成肌细胞分化和肌纤维形成的方法。我们提供了一款软件，可实现细胞核的自动追踪，从而对分化和融合过程中细胞核动态及成肌细胞行为（即运动轨迹）进行高通量的定量表征。

引言

骨骼肌是人体最大的组织，占体重的35%-40%1。卫星细胞是肌肉干细胞，其解剖学特征在于其位置（紧邻肌纤维质膜，位于基底膜下方），可产生增殖的成肌细胞（肌源性前体细胞），这些细胞最终分化并融入现有的肌纤维和/或融合形成新的肌纤维2,3,4。卫星细胞的发现及其生物学研究的进展，为肌肉发育和再生机制提供了重要的科学认识。

分离成肌细胞并将其分化为肌管的实验方案早在多年前就已建立，至今仍被广泛用于研究骨骼肌分化5,6,7。然而，这些方法大多为静态流程，依赖于对固定细胞的分析，因此无法使研究人员充分探究诸如成肌细胞融合和肌纤维成熟等高度动态的过程。最显著的例子是细胞核的定位，这一过程受到严格调控：在肌纤维未成熟时，细胞核位于肌纤维中央；而在肌纤维成熟后，细胞核则迁移至肌纤维周边8,9。活体成像技术是深入研究此类特殊现象的最合适方法。

本文介绍了一种方法，可使科研人员通过延时显微镜记录成肌细胞分化及肌管形成过程，并通过对成肌细胞核的自动追踪进行定量分析。该方法可对分化与融合过程中细胞核动态及成肌细胞行为进行高通量定量表征。本实验方案分为四个部分：（1）从小鼠后肢采集肌肉组织；（2）通过机械法和酶解法分离原代成肌细胞；（3）成肌细胞的增殖与分化；（4）活细胞成像，以追踪成肌细胞分化最初16小时内的细胞核动态。

在以下实验步骤中，从小鼠H2B-GFP中分离成肌细胞，并用1 µg/mL的多西环素处理以诱导H2B-GFP表达，具体方法如前所述10。 alternatively，也可从小鼠其他表达核定位荧光蛋白的转基因品系中分离成肌细胞，或如Pimentel等9所述，将从小鼠野生型中分离的细胞转染以表达核内荧光蛋白。

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方案

所有涉及动物实验的操作均经圣拉斐尔机构动物护理与使用委员会批准。

1. 小鼠后肢肌肉的解剖

  1. 通过高压灭菌法对镊子和剪刀（包括直头和弯头）进行灭菌。
  2. 实验开始前，配制并过滤（0.22 µm）所有培养基（封闭培养基、消化培养基、增殖培养基和分化培养基）（见材料表）。
  3. 在35 mm培养皿中加入5 mL磷酸盐缓冲液（PBS），用于肌肉组织的收集。
  4. 采用颈椎脱位法或CO2处死小鼠，并用乙醇对皮肤进行消毒。使用剪刀和镊子去除后肢和前肢的皮肤，以便于肌肉的分离。
    注意：肌肉可从小鼠新生期或成年期个体中分离。与成年小鼠相比，新生小鼠的卫星细胞数量更多。然而，从单只成年小鼠中可分离出的卫星细胞总数足以完成下述实验。
  5. 分离胫骨前肌、比目鱼肌、趾长伸肌（EDL）、腓肠肌、股四头肌和肱三头肌，并将其置于含有PBS的培养皿中。将培养皿置于冰上。使用灭菌的剪刀和镊子仔细去除肌腱和脂肪组织。

2. 原代成肌细胞的分离

注意：所有细胞培养操作均需在无菌条件下进行。

  1. 从 PBS 中取出肌肉组织，使用无菌弯剪将其剪碎，直至获得均匀的组织块。将肌肉碎片放入 50 mL 离心管中。
  2. 向肌肉碎片中加入 10 mL 消化液，在 37 °C 水浴中剧烈振荡（250 min-1）孵育 30 分钟，以进行酶解消化。
  3. 加入 10 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）、1% 谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素和 1% 庆大霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（阻断液），以终止消化反应。
  4. 以 40 × g 离心 5 分钟，将上清液收集至 50 mL 管中。将沉淀物置于冰上保存。
    注意：离心后，上清液中含有部分卫星细胞、血细胞、内皮细胞和成纤维细胞，而沉淀物中则含有未完全消化的肌肉碎片和结缔组织。为增加分离细胞的数量，需对沉淀物进行如下所述的进一步消化处理。
  5. 将上清液以 650 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将沉淀物重悬于 1 mL 含 10% FBS 的 DMEM 中，并将重悬液置于冰上保存。
  6. 对步骤 2.4 中获得的剩余沉淀物重复步骤 2.2–2.5 两次，并将后续获得的重悬沉淀物合并至先前保存在冰上的重悬液中。
  7. 将合并的重悬液依次通过 70 µm 和 40 µm 滤膜过滤。加入 15 mL 含 10% FBS 的 DMEM，以 650 × g 离心 5 分钟。
  8. 将细胞沉淀物重悬于 3 mL 红细胞裂解缓冲液中，以去除红细胞。室温孵育 5 分钟后，加入 40 mL PBS 终止裂解反应，再以 650 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于 5 mL 含 10% FBS 的 DMEM 中。
  9. 作为预贴壁步骤，将细胞接种于 20 mL 增殖培养基中，置于 150 mm 未包被的培养皿中。在细胞培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育 1 小时后，收集培养基。
    注意：成纤维细胞会贴附于培养皿表面，因此被去除，而卫星细胞则保留在悬浮液中。
  10. 重复步骤 2.9 三次，在最后一次预贴壁步骤中收集含有悬浮卫星细胞的培养基。
  11. 以 650 × g 离心 5 分钟。
  12. 在细胞离心过程中，用胶原蛋白（10 mL 0.1% 的 0.1 M 乙酸溶液）包被两个 150 mm 培养皿。操作时将胶原溶液加入培养皿，孵育 5 分钟后吸除，室温晾干 30 分钟。
  13. 弃去步骤 2.11 中获得的上清液，将细胞沉淀物重悬于 40 mL 增殖培养基中（材料表）。将细胞接种至两个胶原包被的 150 mm 培养皿中（每皿 20 mL），并在细胞培养箱（37 °C，5% CO2, 5% O2）中用含 1 µg/mL 多西环素的增殖培养基培养 2–3 天，以诱导 H2B-GFP 表达。
    注意：此步骤可促进成肌细胞增殖，从而获得足够数量的细胞用于后续实验。细胞密度保持较低，以避免成肌细胞自发分化为肌管细胞。

3. 成肌细胞增殖与分化实验

注意：当成肌细胞密度较高时，部分细胞会启动伸长过程，此时需要对细胞进行传代。通常情况下，传代2至3次不会影响细胞的表型。

  1. 弃去培养基，用 5 mL PBS 洗涤细胞，加入 2 mL 胰蛋白酶（1x），在细胞培养箱中 37 °C 孵育 5 分钟。在显微镜下观察，当细胞变圆并脱落时，加入 5 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 以灭活胰蛋白酶。计数细胞数量（通常每只小鼠可获得约 1 × 106 个细胞）。
    注意：通常孵育 5 分钟胰蛋白酶即可使增殖中的成肌细胞脱落。
  2. 将细胞用于以下所述的其中一项检测。
    1. 增殖检测
      1. 在胶原包被的 12 孔板中，每孔接种 50,000 个细胞，每孔加入 1 mL 增殖培养基，在细胞培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育。在 24、48 或 72 小时时固定并计数细胞。
        注意：每 48 小时更换一次培养基，以避免营养耗尽。
    2. 分化检测
      1. 用 350 µL 含基底膜基质（1:100）的分化培养基包被 12 孔板。在 37 °C 孵育 30 分钟后弃去培养基。
      2. 在基质包被的孔板中，每孔接种 200,000 个细胞于分化培养基中。在细胞培养箱（37 °C，5% CO2, 5% O2）中孵育，直至细胞贴壁（通常 2 小时足以使细胞贴附并启动分化）。
      3. 为评估分化情况，按照先前所述方法11对肌球蛋白重链和细胞核进行染色。或者，按照下文所述进行活细胞成像分析。

4. 成肌细胞分化及核追踪的活体成像

  1. 进行活细胞成像时，将第3.2.2节中获得并接种于12孔板中的细胞置于共聚焦显微镜下，显微镜需配备孵育系统，以维持细胞在37 °C、5% CO2的环境中。
  2. 使用20倍干镜（0.7 NA）获取包含数百个细胞的视野，足以监测肌纤维的形成。H2B-GFP细胞可使用低强度488 nm氩离子激光进行成像。
    注意：开放针孔可确保成像深度（约10 µm）包含细胞厚度，从而使细胞在整个实验过程中保持聚焦。使用共聚焦显微镜具有优势，因其可提高图像的信噪比，尽管宽场显微镜也可用于此目的。肌纤维的形成可通过透射光通道进行监测。
  3. 每6分钟采集一次图像，持续16小时，每帧图像为16位、1,024 × 1,024像素。针对每个采集位置，生成一个多帧.tif文件（示例见补充文件）。
    注意：本方案中使用了与显微镜配套的商业软件（材料表）；若使用其他显微镜，请使用相应软件实现相同目标。
  4. 下载以.zip格式提供的补充文件软件。
    注意：这些程序是必须在MATLAB中运行的脚本。该软件改编自已发表的软件12，并针对肌管形成过程中细胞核的追踪进行了优化。该软件分为两部分：第一部分通过分割识别每帧中的细胞核，第二部分生成细胞核运动的“轨迹”（路径）。完整的细胞核分割与追踪代码以及逐步操作指南均提供在补充文件中。
  5. 解压zip文件，并将其保存至所用个人计算机（PC）上的指定路径。所有后续操作均应在已安装必要软件的PC上进行。请注意，该.zip文件包含以下所述的三个文件夹。
    注意：分割程序文件夹包含用于执行分割的函数。追踪程序文件夹则包含执行追踪所需的函数。示例分割追踪文件夹提供了用于熟悉系统的基础脚本和文件。用于细胞核分割与追踪的软件可在MATLAB R2015a或更高版本中正常运行。
  6. 从.tif文件中分割细胞核时，将文件命名为例如NameFile.tif。
    1. 打开示例分割追踪文件夹，点击DoSegmentation.m，这将在MATLAB中打开命令窗口。
    2. 检查左侧的当前文件夹窗口，查看示例分割追踪文件夹中的所有内容。双击DoSegmentation.m。
      注意：脚本中需修改的详细信息可在StepbyStep.txt文件中找到。必须修改脚本，使变量filenameinput为NameFile.tif，且folderinput为包含该.tif文件的文件夹。
    3. 运行脚本（点击绿色的运行按钮）。分割结果将保存为.mat文件（SegmentedNameFile.mat），而细胞核的分割结果可在输出图像中可视化。
      注意：脚本中描述的分割参数可根据需要进行修改。可使用脚本CheckSegmentation.m检查分割质量（参见StepbyStep.txt文件）。若分割质量较差（仅检测到少数细胞核），请调整DoSegmentation.m脚本中明确标示的分割参数，并重复该过程。
  7. 利用分割所得的细胞核位置信息，生成轨迹（即每个细胞核随时间变化的运动路径），在相同工作目录下运行脚本GenerateTracks.m。务必正确添加此前获得的分割文件作为输入（详见StepbyStep.txt文件）。
    注意：输出结果将生成一个名为TrackedNameFile.mat的文件，其中包含一个用于轨迹x坐标的矩阵和另一个用于y坐标的矩阵。
  8. 使用CheckTracking.m评估轨迹质量（详见StepbyStep.txt文件）。利用该步骤的输出图像可帮助可视化每个细胞核随时间的位置变化。在图像左侧查看绿色十字标记，其表示每个已分割的细胞核。使用下方滚动条选择特定细胞核，所选细胞核将以红色圆圈标出；在右侧，可通过上方滚动条随时间追踪所选细胞核的运动轨迹。

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结果

为了在活体成像过程中自动追踪成肌细胞分化期间的细胞核运动，应优先对细胞核进行荧光标记。需要注意的是，使用DNA嵌入型分子并不可行，因为这类分子会干扰原代成肌细胞的增殖与分化13。例如，已在培养时添加或未添加Hoechst的原代成肌细胞中分析了其增殖与分化能力（图1）。显然，在添加Hoechst 33342的培养条件下，成肌细胞的增殖（图1A、B）和分化（图1C，中图）均受到显著抑制。相反，从H2B-GFP小鼠分离并在含多西环素的培养基中培养的成肌细胞，其细胞核呈现绿色荧光，且分化能力与来自野生型小鼠的成肌细胞相似（图1C，右图和左图分别为H2B-GFP与野生型）。

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讨论

肌纤维（myofibers）是多核细胞，由起源于肌肉干细胞（卫星细胞）的肌肉前体细胞（成肌细胞，myoblasts）经过增殖和分化后融合形成2,3,4。为了评估成肌细胞的分化情况，常规方法是将成肌细胞在诱导分化培养基中培养，并在不同时间点固定细胞，随后进行免疫荧光染色以检测分化标志物MyHC，同时使用DNA嵌入分子（如Hoechst）对细胞核进行染色5。该方法可用于通过测量多种参数来评估成肌细胞分化，例如分化指数（MyHC阳性细胞数/总细胞数）或融合指数（含有至少两个细胞核的肌管数/总细胞数）。然而，成肌细胞的融合及肌管的形成是高度动态的过程，依赖于细胞核的运动能力8。事实上，细胞核在肌纤维内的精确定位对于肌肉的正常再生和功能至关重要17。成肌细胞及其细胞核的运动性可能成为评估成肌细胞分化以及揭示肌肉疾病中新缺...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了法国肌肉萎缩症协会-电信基金会（AFM-Telethon）对 E.V. 的资助（项目编号 #21545）以及圣拉斐尔医院（OSR）对 S.Z. 的种子基金资助（项目编号 ZAMBRA5X1000）。特此感谢巴斯德研究所影像分析中心的 Jean-Yves Tinevez 博士公开分享其 "Simple Tracker" MATLAB 程序。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
鸡胚提取物SeralabCE-650-J
胶原酶SigmaC9263-1G125单位/毫克
小牛皮肤胶原蛋白SigmaC8919
dispaseGibco17105-0411.78 单位/毫克
doxyciclinSigmaD1515
DMEMSigmaD5671
胎牛血清Life technologies10270106
庆大霉素SigmaG1397
马血清Invitrogen16050-098
Hoechstlife technologies33342
IMDMSigmaI3390
L-谷氨酰胺SigmaG7513
Matrigel康宁356231
青霉素-链霉素SigmaP0781
红细胞裂解液Biolegend420301
消化培养基
胶原酶40 mg
dispase70 mg
PBS20 ml
0.22 μm 过滤
封闭液
DMEM
胎牛血清10%
L-谷氨酰胺1%
青霉素-链霉素1%
庆大霉素1 ‰
0.22 μm 过滤
增殖培养基
IMDM
胎牛血清20%
L-谷氨酰胺1%
青霉素-链霉素1%
庆大霉素1 ‰
鸡胚胎提取物3%
0.22微米滤膜过滤
分化培养基
IMDM
马血清2%
L-谷氨酰胺1%
青霉素-链霉素1%
庆大霉素1 ‰
鸡胚提取物1%
0.22 μm 过滤

参考文献

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