利用活体成像追踪成肌细胞分化与融合过程中的细胞核动态

摘要

骨骼肌分化是一个高度动态的过程，尤其依赖于细胞核的定位。本文介绍了一种通过活细胞成像技术在成肌细胞分化及肌管形成过程中追踪细胞核运动的方法，并通过自动追踪获取的信息对细胞核动态进行定量表征。

摘要

细胞内细胞核的定位对于发育和再生过程中的多种细胞活动至关重要。其中最引人注目的例子发生在骨骼肌分化过程中。肌纤维（myofibers）是由肌肉干细胞（卫星细胞）衍生的肌肉前体细胞（成肌细胞，myoblasts）经过增殖和分化后融合形成的多核细胞。肌纤维内细胞核的正确分布对于肌肉的正常再生和功能至关重要。目前评估成肌细胞分化和肌纤维形成的标准方法主要依赖于固定细胞的免疫荧光分析，这种方法限制了对细胞核运动和细胞行为随时间变化的动态研究。本文中，我们描述了一种利用活细胞成像技术分析成肌细胞分化和肌纤维形成的方法。我们提供了一款软件，可实现细胞核的自动追踪，从而对分化和融合过程中细胞核动态及成肌细胞行为（即运动轨迹）进行高通量的定量表征。

引言

骨骼肌是人体最大的组织，占体重的35%-40%¹。卫星细胞是肌肉干细胞，其解剖学特征在于其位置（紧邻肌纤维质膜，位于基底膜下方），可产生增殖的成肌细胞（肌源性前体细胞），这些细胞最终分化并融入现有的肌纤维和/或融合形成新的肌纤维^2,3,4。卫星细胞的发现及其生物学研究的进展，为肌肉发育和再生机制提供了重要的科学认识。

分离成肌细胞并将其分化为肌管的实验方案早在多年前就已建立，至今仍被广泛用于研究骨骼肌分化^5,6,7。然而，这些方法大多为静态流程，依赖于对固定细胞的分析，因此无法使研究人员充分探究诸如成肌细胞融合和肌纤维成熟等高度动态的过程。最显著的例子是细胞核的定位，这一过程受到严格调控：在肌纤维未成熟时，细胞核位于肌纤维中央；而在肌纤维成熟后，细胞核则迁移至肌纤维周边^8,9。活体成像技术是深入研究此类特殊现象的最合适方法。

方案

所有涉及动物实验的操作均经圣拉斐尔机构动物护理与使用委员会批准。

1. 小鼠后肢肌肉的解剖

1. 通过高压灭菌法对镊子和剪刀（包括直头和弯头）进行灭菌。
2. 实验开始前，配制并过滤（0.22 µm）所有培养基（封闭培养基、消化培养基、增殖培养基和分化培养基）（见材料表）。
3. 在35 mm培养皿中加入5 mL磷酸盐缓冲液（PBS），用于肌肉组织的收集。
4. 采用颈椎脱位法或CO₂处死小鼠，并用乙醇对皮肤进行消毒。使用剪刀和镊子去除后肢和前肢的皮肤，以便于肌肉的分离。
   注意：肌肉可从小鼠新生期或成年期个体中分离。与成年小鼠相比，新生小鼠的卫星细胞数量更多。然而，从单只成年小鼠中可分离出的卫星细胞总数足以完成下述实验。
5. 分离胫骨前肌、比目鱼肌、趾长伸肌（EDL）、腓肠肌、股四头肌和肱三头肌，并将其置于含有PBS的培养皿中。将培养皿置于冰上。使用灭菌的剪刀和镊子仔细去除肌腱和脂肪组织。

2. 原代成肌细胞的分离

注意：所有细胞培养操作均需在无菌条件下进行。

1. 从 PBS 中取出肌肉组织，使用无菌弯剪将其剪碎，直至获得均匀的组织块。将肌肉碎片放入 50 mL 离心管中。
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结果

为了在活体成像过程中自动追踪成肌细胞分化期间的细胞核运动，应优先对细胞核进行荧光标记。需要注意的是，使用DNA嵌入型分子并不可行，因为这类分子会干扰原代成肌细胞的增殖与分化¹³。例如，已在培养时添加或未添加Hoechst的原代成肌细胞中分析了其增殖与分化能力（图1）。显然，在添加Hoechst 33342的培养条件下，成肌细胞的增殖（图1A、B）和分化（图1C，中图）均受到显著抑制。相反，从H2B-GFP小鼠分离并在含多西环素的培养基中培养的成肌细胞，其细胞核呈现绿色荧光，且分化能力与来自野生型小鼠的成肌细胞相似（图1C，右图和左图分别为H2B-GFP与野生型）。

讨论

肌纤维（myofibers）是多核细胞，由起源于肌肉干细胞（卫星细胞）的肌肉前体细胞（成肌细胞，myoblasts）经过增殖和分化后融合形成^2,3,4。为了评估成肌细胞的分化情况，常规方法是将成肌细胞在诱导分化培养基中培养，并在不同时间点固定细胞，随后进行免疫荧光染色以检测分化标志物MyHC，同时使用DNA嵌入分子（如Hoechst）对细胞核进行染色⁵。该方法可用于通过测量多种参数来评估成肌细胞分化，例如分化指数（MyHC阳性细胞数/总细胞数）或融合指数（含有至少两个细胞核的肌管数/总细胞数）。然而，成肌细胞的融合及肌管的形成是高度动态的过程，依赖于细胞核的运动能力⁸。事实上，细胞核在肌纤维内的精确定位对于肌肉的正常再生和功能至关重要¹⁷。成肌细胞及其细胞核的运动性可能成为评估成肌细胞分化以及揭示肌肉疾病中新缺.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鸡胚提取物	Seralab	CE-650-J
胶原酶	Sigma	C9263-1G	125单位/毫克
小牛皮肤胶原蛋白	Sigma	C8919
dispase	Gibco	17105-041	1.78 单位/毫克
doxyciclin	Sigma	D1515
DMEM	Sigma	D5671
胎牛血清	Life technologies	10270106
庆大霉素	Sigma	G1397
马血清	Invitrogen	16050-098
Hoechst	life technologies	33342
IMDM	Sigma	I3390
L-谷氨酰胺	Sigma	G7513
Matrigel	康宁	356231
青霉素-链霉素	Sigma	P0781
红细胞裂解液	Biolegend	420301
消化培养基
胶原酶	40 mg
dispase	70 mg
PBS	20 ml
0.22 μm 过滤
封闭液
DMEM
胎牛血清	10%
L-谷氨酰胺	1%
青霉素-链霉素	1%
庆大霉素	1 ‰
0.22 μm 过滤
增殖培养基
IMDM
胎牛血清	20%
L-谷氨酰胺	1%
青霉素-链霉素	1%
庆大霉素	1 ‰
鸡胚胎提取物	3%
0.22微米滤膜过滤
分化培养基
IMDM
马血清	2%
L-谷氨酰胺	1%
青霉素-链霉素	1%
庆大霉素	1 ‰
鸡胚提取物	1%
0.22 μm 过滤