高通量硝基苯并噁二唑标记胆固醇外排检测法

摘要

在巨噬细胞模型中测定血清或血浆体外胆固醇流出能力，是作为动脉粥样硬化生物标志物的一种有前景的工具。在本研究中，我们优化并标准化了一种荧光NBD-胆固醇流出方法，并建立了使用96孔板的高通量分析方法。

摘要

动脉粥样硬化可导致心血管疾病（CVD）。目前尚不明确高密度脂蛋白胆固醇（cHDL）浓度是否在动脉粥样硬化的发展中起因果作用。然而，在动脉粥样硬化斑块形成的早期阶段，一个关键因素是胆固醇向高密度脂蛋白（HDL）的外流能力（即HDL颗粒从巨噬细胞中摄取胆固醇的能力），以避免泡沫细胞的形成。这是防止胆固醇在血管内皮中积聚以及通过肝脏进行胆固醇逆向转运（RCT）以清除胆固醇的关键步骤。在巨噬细胞模型中测定血清或血浆介导的胆固醇外流能力，是一种有前景的动脉粥样硬化生物标志物检测工具。传统上，胆固醇外流实验使用[³H]-胆固醇作为示踪剂。在本研究中，我们旨在建立一种更安全、更快速的方法，利用荧光标记的胆固醇（NBD-胆固醇）在细胞实验中追踪THP-1来源巨噬细胞的胆固醇摄取与外流过程。最后，我们对NBD-胆固醇外流方法进行了优化和标准化，并建立了基于96孔板的高通量分析体系。

引言

根据世界卫生组织的数据，目前全球主要的死亡原因是缺血性心脏病和中风（共导致1520万人死亡）¹。这两种疾病均属于心血管疾病（CVD），可由动脉粥样硬化及血管内粥样斑块破裂所引发^2,3。

动脉粥样硬化是一种血管壁炎症性疾病，其特征是巨噬细胞、T细胞、肥大细胞和树突状细胞从血液中浸润内皮并积聚，最终形成动脉粥样硬化斑块。通过颈动脉内膜中层厚度的高分辨率B型超声测量，可观察到动脉粥样硬化斑块具有脂质核心和胆固醇结晶^4,5。在巨噬细胞中，胆固醇通过ATP结合盒（ABC）受体ABCA1、ATP结合盒G亚家族成员1（ABCG1）以及清道夫受体SR-BI向脂质受体颗粒外流。巨噬细胞内胆固醇流入与流出的失衡被认为是动脉粥样硬化启动的关键过程⁶。胆固醇外流是胆固醇从外周组织经血浆转运至肝脏并最终排出体外的逆向胆固醇转运（RCT）过程中的关键步骤。胆固醇主要从巨噬细胞转移至高密度脂蛋白（HDL）颗粒表面的载脂蛋白A1（ApoA1）。随后，HDL将胆固醇运送至肝脏进行排泄和再利用^7,

方案

本研究获得了伦理委员会批准（巴塞罗那临床医院临床研究伦理委员会，批准编号 HCB/2014/0756）以及所有受试者的书面知情同意。

1. NBD-胆固醇的制备

1. 溶解NBD-胆固醇（分子量494.63；参见 材料清单) 溶于纯乙醇中，配制成2 mM的储备液。对于10 mg的西林瓶，将瓶内全部内容物溶于10.1 mL乙醇中，得到2 mM的储备液。
2. 将NBD-胆固醇从原液用添加了10%胎牛血清和5%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基（R10培养基）稀释，以达到最终浓度 5 μM （例如, 获取10 mL NBD-胆固醇 5 μM 终浓度）通过稀释 25 μL 2 mM NBD-胆固醇储备液加入R10培养基中。此体积足以用于一块96孔板。

2. 细胞培养与接种（第-2天）

1. 将 THP-1 细胞在 R10 培养基中于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养。每 3 天调整细胞密度至 0.3 x 10⁶ 个细胞/mL。
2. 将细胞以每孔 0.2 x 10⁶ 个细胞的密度接种于平底透明白色 96 孔板中，每孔加入 100 μL R10 培养基。
3. 加入佛波酯 12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA；来....

结果

胆固醇流出实验的目的是在体外测定含有高密度脂蛋白（HDL）颗粒的特定血清、血浆或上清液的胆固醇流出能力。该方法包括将标记胆固醇加载至标准巨噬细胞系培养物中，并将细胞与稀释于无胎牛血清（FBS）培养基中的待测样品共孵育。最后，测定培养基和细胞裂解液中的NBD荧光水平。为优化检测，将从细胞流出至培养基中的胆固醇与等体积含乙醇的溶剂混合。细胞内残留的NBD-胆固醇则重悬于含乙醇或去污剂的溶剂中后再进行检测。最终计算流出的标记胆固醇与总标记胆固醇的比值。为建立该技术，采用了来自健康供者混合血清的载脂蛋白B耗竭血清（ABDS）。

我们研究了NBD-胆固醇在培养基和乙醇中的最佳稀释条件。测试了游离NBD-胆固醇在多种溶剂环境中的荧光特性，包括不同比例的乙醇与无色RPMI 1640培养基。NBD-胆固醇在水溶液中稀释时荧光强度（FI）最低，而在纯乙醇中则发出最强的荧光强度。这表明22-NBD-胆固醇分子的荧光发射高度依赖其所处的介质环境。因此，当22-NBD-胆固醇处于含乙醇的介质中时，其荧光信号显著增强。我们观察到，在培养基与乙醇1:1比例条件下，胆固醇类似物浓度在0.5–50 μM范围内时，.......

讨论

荧光标记的胆固醇是一种有前景的策略，可用于体外分析和研究天然胆固醇的性质及其代谢。其主要优势在于可被细胞摄取，能够用于细胞内及膜分布研究，并可应用于胆固醇外流检测，例如本方案中所述的方法。图7一些荧光标记的固醇可用于体外胆固醇追踪，包括BODIPY-胆固醇、丹磺酰-胆固醇、去氢表胆固醇、22-NBD-胆固醇和25-NBD-胆固醇¹²特别是，22-NBD-胆固醇适用于研究不同类型细胞中的胆固醇动态变化，并可作为放射性标记胆固醇的替代物。¹⁸目前尚无统一的方法来评估胆固醇外流实验中的荧光信号。Song 等¹⁴ 收获的培养基和细胞裂解物用于分别测量FI；Liu 等¹⁴ 将培养基转移至其他培养板，并直接在培养板中测量细胞内荧光信号；Zhang 等人¹⁵ 使用裂解缓冲液裂解细胞，随后纯化荧光胆固醇，将其溶解于纯乙醇中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔收集板	康宁公司	Costar 3912	白色不透明底透96孔板
96孔培养板	康宁公司	Costar 3610	白色96孔板，带透明平底
细胞胆固醇外流检测试剂盒	Abcam	ab196985	旨在测定胆固醇外流的商用高通量细胞实验试剂盒
无色 RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R7509	不含酚红的RPMI 1640
Gen5 数据分析软件	BioTek		版本 2.0
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G8790-100G	甘氨酸，非动物用途
光度计	Biotek	SYNERGY HT	多功能微孔板读板仪
裂解液1	内部		50 mM Tris缓冲液，150 mM NaCl和H2O
裂解液2	内部		纯乙醇与细胞裂解液1:1（v:v）
NBD-胆固醇	Thermo-Fisher	N1148	22-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-23,24-双去甲-5-胆烯-3β-奥尔
PBS	Sigma-Aldrich	P3813	磷酸盐缓冲 生理盐水
PEG 8000	Sigma-Aldrich	202452-250G	聚乙二醇
PMA	Sigma-Aldrich	79346	佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯
R10	内部		RPMI 1640 培养基，添加 10% 胎牛血清和 5% 青霉素/链霉素。
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758	含2 mM L-谷氨酰胺、1.5 g/L碳酸氢钠和4.5 g/L葡萄糖的RPMI 1640培养基
THP-1 细胞	Sigma-Aldrich	ATCC，#TIB-202	源自一岁婴儿白血病的类单核细胞系
Tween 80	Sigma-Aldrich	P1754