在巨噬细胞模型中测定血清或血浆体外胆固醇流出能力，是作为动脉粥样硬化生物标志物的一种有前景的工具。在本研究中，我们优化并标准化了一种荧光NBD-胆固醇流出方法，并建立了使用96孔板的高通量分析方法。
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摘要
摘要
动脉粥样硬化可导致心血管疾病（CVD）。目前尚不明确高密度脂蛋白胆固醇（cHDL）浓度是否在动脉粥样硬化的发展中起因果作用。然而，在动脉粥样硬化斑块形成的早期阶段，一个关键因素是胆固醇向高密度脂蛋白（HDL）的外流能力（即HDL颗粒从巨噬细胞中摄取胆固醇的能力），以避免泡沫细胞的形成。这是防止胆固醇在血管内皮中积聚以及通过肝脏进行胆固醇逆向转运（RCT）以清除胆固醇的关键步骤。在巨噬细胞模型中测定血清或血浆介导的胆固醇外流能力，是一种有前景的动脉粥样硬化生物标志物检测工具。传统上，胆固醇外流实验使用[3H]-胆固醇作为示踪剂。在本研究中，我们旨在建立一种更安全、更快速的方法，利用荧光标记的胆固醇（NBD-胆固醇）在细胞实验中追踪THP-1来源巨噬细胞的胆固醇摄取与外流过程。最后，我们对NBD-胆固醇外流方法进行了优化和标准化，并建立了基于96孔板的高通量分析体系。
引言
根据世界卫生组织的数据，目前全球主要的死亡原因是缺血性心脏病和中风（共导致1520万人死亡）1。这两种疾病均属于心血管疾病（CVD），可由动脉粥样硬化及血管内粥样斑块破裂所引发2,3。
动脉粥样硬化是一种血管壁炎症性疾病，其特征是巨噬细胞、T细胞、肥大细胞和树突状细胞从血液中浸润内皮并积聚，最终形成动脉粥样硬化斑块。通过颈动脉内膜中层厚度的高分辨率B型超声测量，可观察到动脉粥样硬化斑块具有脂质核心和胆固醇结晶4,5。在巨噬细胞中，胆固醇通过ATP结合盒（ABC）受体ABCA1、ATP结合盒G亚家族成员1（ABCG1）以及清道夫受体SR-BI向脂质受体颗粒外流。巨噬细胞内胆固醇流入与流出的失衡被认为是动脉粥样硬化启动的关键过程6。胆固醇外流是胆固醇从外周组织经血浆转运至肝脏并最终排出体外的逆向胆固醇转运（RCT）过程中的关键步骤。胆固醇主要从巨噬细胞转移至高密度脂蛋白（HDL）颗粒表面的载脂蛋白A1（ApoA1）。随后，HDL将胆固醇运送至肝脏进行排泄和再利用7,8,9。
传统上，氚（3H）放射性标记胆固醇已被用于胆固醇外流实验10。放射性同位素的发射信号具有高度敏感性10；然而，放射性标记胆固醇存在明显缺陷，例如实验周期长、存在电离辐射暴露风险，以及需要特殊的放射性设施和设备以确保放射性物质的安全操作。相比之下，荧光技术因其荧光信号检测简便、可用的荧光染料种类丰富且安全性高，已成功应用于诊断技术中11。已有多种荧光标记的甾醇被用于研究胆固醇代谢，包括具有内在荧光特性的去氢麦角甾醇（dehydroergosterol）、丹磺酰胆固醇（dansyl cholesterol）、4,4-二氟-3a,4-二氮杂-s-茚并[1,2,3-cd]芘（BODIPY）-胆固醇，以及22-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-23,24-双去甲-5-胆烯-3β-醇（NBD-胆固醇）。其中，NBD-胆固醇在人细胞中表现出高效的摄取能力12。目前有两种不同的NBD标记胆固醇可供使用：22-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-23,24-双去甲-5-胆烯-3b-醇（22-NBD）和25-(N-[(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)-甲基]氨基)-27-去甲胆固醇（25-NBD；图1）。使用22-NBD基团标记的胆固醇可能更适用于胆固醇外流研究，而25-NBD-胆固醇则主要用于细胞膜动力学研究13,14。
体外胆固醇流出实验中常用的细胞系为单核细胞样细胞，例如人白血病来源的 THP-1 细胞、小鼠 Raw 264.7 细胞15或 J774.1 细胞。这些细胞均可通过佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸盐（PMA）在体外诱导分化为巨噬细胞，但其中由 THP-1 细胞分化而来的巨噬细胞（dmTHP-1）最能反映并模拟人巨噬细胞的特性16。
本研究中，我们优化并标准化了一种基于dmTHP-1细胞的荧光高通量方法，利用22-NBD-胆固醇替代[3H]-胆固醇，用于测定血清样本的胆固醇外流能力。此外，我们将优化后的荧光技术与标准的放射性类似方法进行了比较。
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方案
本研究获得了伦理委员会批准（巴塞罗那临床医院临床研究伦理委员会，批准编号 HCB/2014/0756）以及所有受试者的书面知情同意。
1. NBD-胆固醇的制备
- 溶解NBD-胆固醇（分子量494.63；参见 材料清单) 溶于纯乙醇中，配制成2 mM的储备液。对于10 mg的西林瓶，将瓶内全部内容物溶于10.1 mL乙醇中，得到2 mM的储备液。
- 将NBD-胆固醇从原液用添加了10%胎牛血清和5%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基（R10培养基）稀释，以达到最终浓度 5 μM （例如, 获取10 mL NBD-胆固醇 5 μM 终浓度）通过稀释 25 μL 2 mM NBD-胆固醇储备液加入R10培养基中。此体积足以用于一块96孔板。
2. 细胞培养与接种（第-2天）
- 将 THP-1 细胞在 R10 培养基中于 37 °C、5% CO2 条件下培养。每 3 天调整细胞密度至 0.3 x 106 个细胞/mL。
- 将细胞以每孔 0.2 x 106 个细胞的密度接种于平底透明白色 96 孔板中，每孔加入 100 μL R10 培养基。
- 加入佛波酯 12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA；来自 10 μM 储存液）至终浓度 100 nM，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 48–72 小时，使 THP-1 细胞分化为 dmTHP-1 细胞。
注意：建议在 500 μL R10 培养基中加入 5 μL PMA 储存液（10 μM）。在此之前，将 1 g 冻干粉溶于 10 mL 二甲基亚砜（DMSO）中配制 10 μM PMA 储存液，分装后于 -20 °C 保存。 - 可选（建议）：合并步骤 2.2 与 2.3 以获得更均匀的细胞分布。取 10 mL THP-1 细胞置于 15 mL 离心管中，加入 200 μL PMA 储存液（10 μM），轻轻混匀后立即每孔接种 100 μL 至培养板中。后续孵育条件同步骤 2.3 所述。
3. 载脂蛋白B耗竭血清（ABDS）的制备（第2天或第3天）
- 配制聚乙二醇（PEG）溶液时，将甘氨酸用含无菌 H2O 的 10% PBS 稀释至 pH 7.4，浓度为 200 mM。取 40 mL 的 200 mM 甘氨酸溶液加入 10 g PEG 8000 中，得到 20%（w/v）的 PEG 溶液。剧烈混合溶液以确保均匀。
- 在每份血清/血浆样本中（置于 1.5 mL 离心管中），按每 10 份血清/血浆加入 4 份 20% PEG 的比例添加，并将混合物置于冰上孵育 25 分钟17（例如，对于 100 μL 血浆或血清，加入 40 μL 20% PEG 溶液）。
- 在 4 °C 条件下，以 13,000 × g 离心 15 分钟，沉淀 PEG-载脂蛋白 B 复合物。
- 弃去沉淀物，将上清液转移至新离心管中。
注意：建议在第 3 天新鲜配制 ABDS。若无法实现，可在第 2 天配制后于 4 °C 保存过夜。
4. NBD-胆固醇细胞加载（第2天）
- 弃去 dmTHP-1 的培养基，用 1× 磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤细胞两次。
- 在 R10 培养基中加入 5 μM NBD-胆固醇（每孔 100 μL），加载细胞，并在 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜。
5. 与胆固醇受体共孵育（第3天）
- 弃去培养基，用 PBS 洗涤细胞两次。
- 将细胞与 2–5% ABDS 或所需浓度的纯化脂质受体（HDL、ApoA、ApoE 等）在无色 RPMI 1640 培养基中稀释后孵育（每孔 100 μL），37 °C 孵育 4–6 小时。
注意：应设置阴性对照（C-），即不含受体的无色 RPMI 1640 培养基，以及阳性对照（C+）（例如来自健康供体池的 ABDS 或纯化的 HDL）。当分析患者样本（疾病状态）时，尤其需要设置阳性对照（补充图 1）。 - 配制 200 mL 细胞裂解液 1（50 mM Tris 缓冲液，150 mM NaCl，H2O）。将细胞裂解液 1 与纯乙醇按 1:1（v:v）比例混合，得到裂解液 2。
6. 荧光信号采集（第3天）
- 培养基中NBD-胆固醇的检测
- 从培养板中移除细胞培养基，并将其收集到新的白色不透明平底96孔板中。
- 为在培养基样品中获得最佳荧光信号检测效果，向每100 μL培养基样品中加入100 μL纯乙醇，使最终体积在白色96孔板中达到1:1的比例。
- 将处理后的样品板保留，用于后续在发光仪中以463⁄536 nm（激发/发射）波长测定荧光强度（FI）。
- 细胞内NBD-胆固醇的检测
- 用PBS洗涤细胞两次。
- 为获取细胞内胆固醇，每孔加入100 μL裂解液2，孵育以裂解细胞，并在室温（RT）下振荡培养板25分钟。
- 为在细胞裂解液样品中获得最佳荧光信号检测效果，将细胞裂解液的荧光强度直接在相同的白色透明平底96孔板中检测（即步骤2.2中接种细胞所用的同一块板）。
- 6.3 在发光仪中测定荧光强度（FI），同时在软件中将灵敏度参数调整为50（参见材料表）。
7. 结果分析
- 根据以下公式计算样品的胆固醇外流率，并以百分比表示：
- 通过从待测样品的胆固醇外流（CE）值中减去阴性对照（样品加载NBD-胆固醇后，与无色RPMI 1640培养基孵育，不含胆固醇受体）的胆固醇外流值，获得最终的胆固醇外流（CE）测量结果：
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结果
胆固醇流出实验的目的是在体外测定含有高密度脂蛋白（HDL）颗粒的特定血清、血浆或上清液的胆固醇流出能力。该方法包括将标记胆固醇加载至标准巨噬细胞系培养物中，并将细胞与稀释于无胎牛血清（FBS）培养基中的待测样品共孵育。最后，测定培养基和细胞裂解液中的NBD荧光水平。为优化检测，将从细胞流出至培养基中的胆固醇与等体积含乙醇的溶剂混合。细胞内残留的NBD-胆固醇则重悬于含乙醇或去污剂的溶剂中后再进行检测。最终计算流出的标记胆固醇与总标记胆固醇的比值。为建立该技术，采用了来自健康供者混合血清的载脂蛋白B耗竭血清（ABDS）。
我们研究了NBD-胆固醇在培养基和乙醇中的最佳稀释条件。测试了游离NBD-胆固醇在多种溶剂环境中的荧光特性，包括不同比例的乙醇与无色RPMI 1640培养基。NBD-胆固醇在水溶液中稀释时荧光强度（FI）最低，而在纯乙醇中则发出最强的荧光强度。这表明22-NBD-胆固醇分子的荧光发射高度依赖其所处的介质环境。因此，当22-NBD-胆固醇处于含乙醇的介质中时，其荧光信号显著增强。我们观察到，在培养基与乙醇1:1比例条件下，胆固醇类似物浓度在0.5–50 μM范围内时，...
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讨论
荧光标记的胆固醇是一种有前景的策略，可用于体外分析和研究天然胆固醇的性质及其代谢。其主要优势在于可被细胞摄取，能够用于细胞内及膜分布研究，并可应用于胆固醇外流检测，例如本方案中所述的方法。图7一些荧光标记的固醇可用于体外胆固醇追踪，包括BODIPY-胆固醇、丹磺酰-胆固醇、去氢表胆固醇、22-NBD-胆固醇和25-NBD-胆固醇12特别是，22-NBD-胆固醇适用于研究不同类型细胞中的胆固醇动态变化，并可作为放射性标记胆固醇的替代物。18目前尚无统一的方法来评估胆固醇外流实验中的荧光信号。Song 等14 收获的培养基和细胞裂解物用于分别测量FI；Liu 等14 将培养基转移至其他培养板，并直接在培养板中测量细胞内荧光信号；Zhang 等人15 使用裂解缓冲液裂解细胞，随后纯化荧光胆固醇，将其溶解于纯乙醇中...
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披露
作者声明，他们基于本方法申请了一项专利（欧洲专利局；18382337.6-1118；2018年5月17日），专利名称为"胆固醇流出量测定方法"，且为该专利的发明人。
致谢
本工作部分得到了西班牙马德里卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III）研究基金FIS（PS12/00866）、欧洲区域发展基金（Fondo Europeo para el Desarrollo Regional, FEDER）、西班牙艾滋病研究网络（Red de Investigación en SIDA, RIS）、ISCIII-RETIC（RD16/0025/0002）以及CERCA计划/加泰罗尼亚自治区政府（Generalitat de Catalunya）的资助。作者感谢巴塞罗那 August Pi i Sunyer 生物医学研究所（Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi I Sunyer, IDIBAPS）的逆转录病毒学与病毒免疫病理学实验室。我们感谢T. Escribà、C. Rovira和C. Hurtado提供的协助，以及知识与技术转让办公室的S. Cufí在发明保护方面给予的指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔收集板 | 康宁公司 | Costar 3912 | 白色不透明底透96孔板 |
| 96孔培养板 | 康宁公司 | Costar 3610 | 白色96孔板，带透明平底 |
| 细胞胆固醇外流检测试剂盒 | Abcam | ab196985 | 旨在测定胆固醇外流的商用高通量细胞实验试剂盒 |
| 无色 RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | 不含酚红的RPMI 1640 |
| Gen5 数据分析软件 | BioTek | 版本 2.0 | |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | G8790-100G | 甘氨酸，非动物用途 |
| 光度计 | Biotek | SYNERGY HT | 多功能微孔板读板仪 |
| 裂解液1 | 内部 | 50 mM Tris缓冲液，150 mM NaCl和H2O | |
| 裂解液2 | 内部 | 纯乙醇与细胞裂解液1:1（v:v） | |
| NBD-胆固醇 | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-23,24-双去甲-5-胆烯-3β-奥尔 |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | 磷酸盐缓冲 生理盐水 |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | 聚乙二醇 |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | 佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯 |
| R10 | 内部 | RPMI 1640 培养基，添加 10% 胎牛血清和 5% 青霉素/链霉素。 | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | 含2 mM L-谷氨酰胺、1.5 g/L碳酸氢钠和4.5 g/L葡萄糖的RPMI 1640培养基 |
| THP-1 细胞 | Sigma-Aldrich | ATCC，#TIB-202 | 源自一岁婴儿白血病的类单核细胞系 |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
参考文献
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