从大鼠骨髓中分离、纯化及诱导破骨细胞前体细胞分化

摘要

破骨细胞是来源于造血干细胞单核-巨噬细胞系的组织特异性多核巨噬细胞。本方案描述了如何分离骨髓细胞，以获得大量破骨细胞，同时降低传统方法中存在的事故风险。

摘要

破骨细胞是来源于单核-巨噬细胞系的大型多核骨吸收细胞，由单核细胞或巨噬细胞前体融合形成。过度的骨吸收是导致溶骨性疾病（包括骨质疏松症、牙周炎和假体周围骨溶解）最重要的细胞机制之一。破骨细胞的主要生理功能是降解骨组织中的羟基磷灰石矿物成分和有机基质，从而在骨表面形成特征性的吸收陷窝。与其他细胞相比，体内破骨细胞数量相对较少，尤其在成人骨骼中更为稀少。近年来的研究重点是如何在更短时间内获得更成熟的破骨细胞，这一直是一个难题。为获得更成熟的破骨细胞，各实验室已对分离与培养技术进行了多项改进。本文介绍一种相较于传统方法更省时省力的骨髓分离方法，该方法使用一种特殊且简单的装置。通过密度梯度离心法，我们可从大鼠骨髓中获得大量完全分化的破骨细胞，并采用经典方法对其进行鉴定。

引言

骨稳态是一种复杂的生理过程，由破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成共同调控¹。成骨细胞和破骨细胞分别介导的成骨活性与破骨活性之间的平衡，对于维持骨骼健康和骨稳态至关重要，因为骨稳态的紊乱可能导致骨骼疾病，例如异常骨生长或骨密度降低。作为独特的骨吸收细胞，破骨细胞在与异常骨破坏相关的疾病中具有重要作用，包括骨质疏松症、牙周炎和假体周围骨溶解^2,3。

破骨细胞培养的发展主要分为两个阶段。20世纪80年代，Boyde 等⁴和Chambers 等⁵建立的方法构成了第一阶段。他们从新生动物骨骼中获得了相对丰富的破骨细胞，该时期为骨骼快速重塑阶段。通过在特殊培养基中将骨骼剪碎并搅拌，可释放出破骨细胞。然而，该方法获得的细胞数量少且纯度较低。第二阶段是发展远距离诱导破骨细胞形成的长期培养技术，使用来源于骨髓的造血系细胞⁶。将细胞因子如1α,25-二羟基维生素D3、前列腺素E2（PGE-2）和甲状旁腺激素（PTH）加入培养体系，通过成骨细胞/基质细胞系统促进破骨细胞形成^7,8。然而，该方法获得的破骨细胞在数量和纯度上仍无法满足现代分子生物学研究的需求。随后，巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子-κB配体受体激活物（RANKL）的发现使破骨细胞生成变得更加容易^9,10,11，目前利用M-CSF和RANKL直接刺激破骨细胞形成的方法已在世界范围内广泛应用。然而，该技术在具体操作细节方面仍存在需要改进之处。

目前，最常用的破骨细胞培养方法如 Marino 等人¹² 和 Pei 等人¹³ 所述，通常需要去除骨骼周围的组织，并使用无菌针头用完全培养基冲洗骨髓腔。该方法存在一些缺点，包括：（1）去除骨骼周围组织耗时较长且需要高超的手术技巧；（2）骨骼较为脆弱，容易导致骨髓流失；（3）骨髓腔可能过于细小而难以冲洗；（4）存在针刺伤的风险。为避免上述问题，我们采用离心含有骨骼的离心管来获取骨髓，而非使用针头冲洗骨髓。本文介绍一种相较于传统方法更稳定、更安全的技术，能够在更短时间内以更少的操作步骤分离骨髓。结合密度梯度离心法，我们可在体外获得大量完全分化的破骨细胞 。

方案

所有涉及实验动物的方法均经南京中医药大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 设置

1. 准备若干纵向切割的1 mL吸头（1 cm）和若干1.5 mL微量离心管。将吸头和微量离心管置于103 kPa、121 °C条件下20分钟，确保其无菌。
2. 准备一盒冰和若干无菌培养皿，用于在分离过程中保存所分离的组织。

2. 培养基的制备

1. 配制完全培养基。使用含1%青霉素/链霉素和10%胎牛血清（FBS）的最低必需培养基α（α-MEM）。
2. 使用0.22 μm滤膜过滤步骤2.1中的培养基。
3. 配制骨髓细胞诱导培养基。取49.875 mL完全培养基（来自步骤2.2），加入125 µL浓度为10,000 ng/mL的M-CSF（材料表），配制成终浓度为25 ng/mL M-CSF的50 mL溶液。
4. 配制破骨细胞诱导培养基。取49.5 mL骨髓细胞诱导培养基（来自步骤2.3），加入500 µL浓度为10,000 ng/mL的RANKL（材料表），配制成终浓度为25 ng/mL M-CSF和100 ng/mL RANKL的50 mL溶液。

3. 骨髓来源细胞的分离

1. 安乐死
   1. 通过吸入 CO₂ 并随后进行颈椎脱位的方法处死四只 Sprague Dawley 大鼠，并将其浸入 75% 乙醇中 1 分钟。
      注意：确保动物性别相同且年龄相近。建议使用 2 至 3 周龄的动物。其中两只大鼠用于离心法，另外两只用于传统方法。
2. 传统方法
   1. 将动物仰卧置于消毒板上。使用无菌剪刀在股骨近端做一个小切口（约 1 cm），剥离皮肤。
   2. 解剖分离股骨和胫骨。切断髋关节、膝关节和踝关节周围的双侧连接组织，小心轻柔地分离胫骨和股骨。切除骨骼周围的部分组织，确保彻底清除。整个过程中不得折断胫骨和股骨。
   3. 将清洗后的骨骼放入含有 5 mL 完全培养基的培养皿中。用无菌剪刀剪断长骨，并使用 1 mL 注射器针头以 10 mL 完全培养基小心冲洗骨髓腔，直至骨髓腔变白。
   4. 将步骤 3.2.3 中获得的细胞悬液转移至 50 mL 离心管中，然后用 70 μm 滤网过滤，以去除残留组织。
   5. 向细胞悬液中加入 5 mL 红细胞裂解缓冲液（材料表）。将细胞在冰上孵育 8 分钟，随后在 250 x g 条件下离心 5 分钟，获得细胞沉淀。
   6. 吸除上清液，将细胞重悬于 10 mL 完全培养基中。使用血细胞计数板计数细胞，并计算本节（第 3.2 节）各步骤所耗时间。
3. 改进方法
   1. 将动物仰卧置于消毒板上。使用无菌剪刀在股骨近端做一个小切口（约 1 cm），剥离皮肤。
   2. 解剖分离股骨和胫骨。适当切除骨骼周围的部分组织（无需完全去除）。整个过程中不得折断胫骨和股骨。
   3. 用 12 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗胫骨和股骨，并将其剪成两半。将剪断的胫骨和股骨放入 1 mL 移液器吸头（来自步骤 1.1）中，然后将吸头置入微量离心管，于 4 °C 条件下以 1,000 x g 离心 3 次，每次 45 秒。
   4. 离心后，取出含有骨骼的移液器吸头，使骨髓保留在离心管中。向微量离心管中加入 200 μL 完全培养基，反复吹打以充分分散骨髓。
   5. 将步骤 3.3.4 中获得的细胞悬液转移至 50 mL 离心管中，然后用 70 μm 滤网过滤，以去除残留组织。
   6. 使用血细胞计数板计数细胞，并计算本节（第 3.3 节）各步骤所耗时间。

4. 通过密度梯度离心进行纯化

1. 用α-MEM将步骤3.2.6或步骤3.3.5中的细胞悬液调整至2 mL。
2. 准备一支无菌硅化离心管，并向其中加入8 mL细胞分离液（材料表）。
3. 将步骤4.1中的细胞悬液加入细胞分离液中。将移液器吸头紧贴离心管内壁，并保持与内壁呈45°角。加入悬液后，细胞层与分离液之间将出现清晰的界面。
   注意：操作需格外小心，应缓慢进行。
4. 将分层后的溶液在水平离心机中以500 × g 离心30分钟。离心结束后，从上至下小心吸除含有目标细胞的浑浊第二层。
   注意：离心前应取消离心机的加速和减速设置。离心后共分为六层：第一层为稀释液层，第二层为单核细胞层，第三层为单个核细胞层，第四层为透明分离液层，第五层为粒细胞层，第六层为红细胞层。
5. 将目标细胞转移至新离心管中。加入5 mL PBS洗涤细胞，共洗涤3次。每次洗涤后，以250 × g 离心5分钟，获得细胞沉淀。
6. 用骨髓诱导培养基重悬细胞沉淀，并使用血细胞计数板进行细胞计数。根据步骤2.3提供的骨髓诱导培养基，加入5–8 mL，使最终细胞浓度为300,000个细胞/mL。每孔加入1 mL至24孔板的每个孔中。

5. 培养与分化

1. 将细胞在 37 °C 培养 24 小时后，轻柔吸除培养基，每孔加入 1 mL 破骨细胞诱导培养基。轻轻振荡培养板，然后将其放入 37 °C 培养箱中。
2. 每 48 小时更换一次破骨细胞诱导培养基。更换时，每孔更换 0.8 mL 培养基，并轻轻振荡培养板。
   注意：通常在第 4 至 6 天，在倒置显微镜下应可观察到孔内出现体积较大、具有运动性且多核的破骨细胞。

6. 抗酒石酸酸性磷酸酶染色

注意：如果诱导成功（第5节），4–6天后将出现多核破骨细胞。

1. 通过混合4 mL的37%甲醛、32.5 mL丙酮和12.5 mL柠檬酸溶液来配制固定液。将固定液储存于4 °C。
2. 通过将50 µL亚硝酸钠、50 µL快红GBC盐基溶液、50 µL萘酚AS-BI磷酸盐溶液、200 µL醋酸盐溶液和100 µL酒石酸盐溶液加入4.55 mL预热至37 °C的去离子水中，配制抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色液（材料表）。然后轻轻颠倒混匀1分钟，并静置2分钟。
3. 成功诱导破骨细胞后，吸除培养基，并用PBS轻柔洗涤孔板3次。
4. 将固定液恢复至室温（RT）。每孔加入2 mL固定液，作用30秒，注意防止细胞干燥。
5. 吸除固定液，用预热至37 °C的去离子水轻柔洗涤3次，然后吸除水分。
6. 每孔加入2 mL TRAP染色液，在37 °C避光孵育1小时。
7. 孵育1小时后，吸除染色液，用预热至37 °C的去离子水轻柔洗涤样本，然后吸除水分。
8. 用苏木精溶液对细胞复染1分钟。染色后，吸除苏木精溶液，并用去离子水轻柔洗涤细胞3次。
9. 使用明场显微镜观察破骨细胞，含有三个或更多细胞核的TRAP⁺细胞呈紫色。

7. 使用甲苯胺蓝染色法进行骨吸收检测

1. 骨片预处理
   1. 使用微型电动锯沿新鲜牛股骨骨干的纵轴切成2 cm厚的骨片，然后用硬组织研磨机将骨片切割并研磨至80 µm。
   2. 将骨片置于烧杯中，用去离子水清洗，并以100 Hz超声处理1小时，重复3次。
   3. 将骨片浸入75%酒精中2小时，吸除酒精后，在洁净台中将骨片每面暴露于紫外线下照射1小时。
   4. 接种细胞前，将骨片浸入培养基中至少2小时。
2. 甲苯胺蓝染色
   1. 将预处理后的骨片放入24孔板中，按步骤4.6所述接种细胞，并按第5节所述进行诱导。
   2. 待破骨细胞出现后（4–6天后），用1 mL 0.25 M氢氧化铵溶液清洗骨片，并超声处理3次，每次5分钟，以去除活细胞，便于分析骨片上的吸收陷窝。随后弃去氢氧化铵溶液，每片加入1 mL 1%（wt/vol）甲苯胺蓝溶液染色2分钟。
   3. 用PBS清洗骨片，随机选取五个视野，使用图像分析软件对吸收面积进行半定量分析。

8. 扫描电子显微镜

1. 将步骤 7.2.1 中的骨片用 2.5% 戊二醛溶液（每片 1 mL）在室温下预固定 2 小时，然后用 1 M 氢氧化铵超声处理 3 次，每次 3 分钟，以去除细胞，并清除氢氧化铵。
2. 用 PBS 洗涤骨片 3 次，每次 12 分钟。
3. 用 1% 锇酸在室温下固定骨片 2 小时。
4. 进行乙醇梯度脱水，依次使用 50%、70%、80%、90% 和 95% 乙醇，每个梯度处理 15 分钟，然后用乙酸异戊酯替换乙醇，处理 15 分钟。
5. 用金钯合金对骨片进行镀膜，随后通过扫描电子显微镜进行分析。

9. 降钙素受体的免疫荧光染色

注意：如果诱导成功（第5节），在4–6天后将出现多核破骨细胞。

1. 吸去培养基，用 PBS 轻柔洗涤孔板 3 次。
2. 用预冷至 4 °C 的 4% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟。
3. 每孔加入 1 mL 含 0.3% 非离子型表面活性剂的 PBS，冰上孵育 30 分钟。然后吸去含 0.3% 非离子型表面活性剂的 PBS，每孔加入 1 mL 含 5% FBS 的 PBS，冰上孵育 30 分钟。
4. 吸去 PBS，将膜与抗降钙素受体抗体（anti-CTR）以 1:100 的稀释比例溶于 PBS 中，于 4 °C 过夜孵育。
5. 吸去溶液，将膜与 Alexa-488 标记的抗兔 IgG 抗体以 1:1,000 的稀释比例溶于 PBS 中，室温孵育 1 小时。
6. 吸去溶液，用 PBS 轻柔洗涤细胞 3 次。用 Hoechst 33342 染色剂在室温下对细胞核进行复染，孵育 3 分钟。
7. 吸去溶液，用 PBS 轻柔洗涤细胞 3 次。通过荧光显微镜观察 CTR 的荧光强度。

结果

本实验方案的目的是方便地分离和纯化大量破骨细胞前体，并成功诱导生成破骨细胞。通过添加M-CSF和RANKL，在第5至6天可观察到巨大的破骨细胞。通过TRAP染色成功鉴定破骨细胞的形成（图1A）。体积较大、呈紫色且具有多个细胞核（通常≥三个细胞核）的细胞被视为TRAP阳性多核细胞。采用该方法，在24孔板中通常可获得约800个破骨细胞，每个破骨细胞最多可含有30个细胞核（图1B）。与传统方法相比，改进后的方法在整个分离过程中节省了约20分钟（图1C）。

利用骨片评估骨吸收活性是体外实验中的常用方法。通过甲苯胺蓝染色，吸收区域呈现浅绿色（图2A），并据此进行定量计算。通过扫描电子显微镜可清晰观察骨陷窝的结构与特征（

讨论

体外获取并研究破骨细胞的能力，是任何希望研究骨代谢的研究人员所必需的一项关键且基础的技能，该技术有助于理解骨吸收性疾病的机制，并开发新型治疗药物。本研究描述了一种在既往方法基础上进行部分改良的实验方案。

通过使用移液器吸头和微量离心管获取骨髓，与传统方法相比，该方法显著缩短了获取骨髓的操作时间，并减轻了实验人员的工作负担。同时，该方法避免了骨髓样本丢失或针刺伤的风险。在先前的研究中，骨髓来源的细胞在分离后立即进行接种培养^12,13。采用密度梯度离心法，根据沉降系数的差异来分离骨髓单核细胞。在密度梯度离心过程中，必须沿管壁轻柔、小心地加入细胞分离液，以确保界面清晰。然而，该技术受限于离心机的功能，以及是否可设置加速度和减速度参数。接种密度是破骨细胞培养的关键条件。由于接种细胞时密度不当，该实验方案曾多次失败。因此，本方案推荐每24孔板每孔接种约300,000个细胞。该方案也适用于从大鼠或其他动物（如小鼠、兔、鸡）中获取多种类型的骨髓来源细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酸性磷酸酶白细胞（TRAP）试剂盒	Sigma-Aldrich	387A
自动硬组织切片机	Lecia	RM2265
牛股骨骨组织			自行采购
细胞培养箱	Heraus	BB16/BB5060
胎牛血清	Sarana	s-fbs-au-015
山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 488）	Abcam	ab150077
硬组织研磨器	Lecia	SP-2600
Histopaque 试剂盒	天津灏洋	TBD2013DR	硅化离心管及细胞分离液
Hochest33342	Sigma-Aldrich	B2261
倒置相差显微镜	Olympus	CKX31
倒置荧光显微镜	Lecia	DMI-3000
不含谷氨酰胺的MEM培养基	Gibco	11090-081
青霉素-链霉素溶液	Gibco	15140122
兔抗降钙素受体抗体	Bioss	bs-0124R
重组大鼠M-CSF	PeproTech	400-28
重组大鼠sRANK配体	PeproTech	400-30
红细胞裂解缓冲液	Absin	abs47014932
扫描电子显微镜	FEI	Quanta 200
甲苯胺蓝	Sigma-Aldrich	89649