破骨细胞是来源于造血干细胞单核-巨噬细胞系的组织特异性多核巨噬细胞。本方案描述了如何分离骨髓细胞，以获得大量破骨细胞，同时降低传统方法中存在的事故风险。
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本文内容
摘要
摘要
破骨细胞是来源于单核-巨噬细胞系的大型多核骨吸收细胞，由单核细胞或巨噬细胞前体融合形成。过度的骨吸收是导致溶骨性疾病（包括骨质疏松症、牙周炎和假体周围骨溶解）最重要的细胞机制之一。破骨细胞的主要生理功能是降解骨组织中的羟基磷灰石矿物成分和有机基质，从而在骨表面形成特征性的吸收陷窝。与其他细胞相比，体内破骨细胞数量相对较少，尤其在成人骨骼中更为稀少。近年来的研究重点是如何在更短时间内获得更成熟的破骨细胞，这一直是一个难题。为获得更成熟的破骨细胞，各实验室已对分离与培养技术进行了多项改进。本文介绍一种相较于传统方法更省时省力的骨髓分离方法，该方法使用一种特殊且简单的装置。通过密度梯度离心法，我们可从大鼠骨髓中获得大量完全分化的破骨细胞，并采用经典方法对其进行鉴定。
引言
骨稳态是一种复杂的生理过程，由破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成共同调控1。成骨细胞和破骨细胞分别介导的成骨活性与破骨活性之间的平衡，对于维持骨骼健康和骨稳态至关重要，因为骨稳态的紊乱可能导致骨骼疾病，例如异常骨生长或骨密度降低。作为独特的骨吸收细胞，破骨细胞在与异常骨破坏相关的疾病中具有重要作用，包括骨质疏松症、牙周炎和假体周围骨溶解2,3。
破骨细胞培养的发展主要分为两个阶段。20世纪80年代，Boyde 等4和Chambers 等5建立的方法构成了第一阶段。他们从新生动物骨骼中获得了相对丰富的破骨细胞，该时期为骨骼快速重塑阶段。通过在特殊培养基中将骨骼剪碎并搅拌，可释放出破骨细胞。然而，该方法获得的细胞数量少且纯度较低。第二阶段是发展远距离诱导破骨细胞形成的长期培养技术，使用来源于骨髓的造血系细胞6。将细胞因子如1α,25-二羟基维生素D3、前列腺素E2（PGE-2）和甲状旁腺激素（PTH）加入培养体系，通过成骨细胞/基质细胞系统促进破骨细胞形成7,
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方案
所有涉及实验动物的方法均经南京中医药大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 设置
- 准备若干纵向切割的1 mL吸头（1 cm）和若干1.5 mL微量离心管。将吸头和微量离心管置于103 kPa、121 °C条件下20分钟，确保其无菌。
- 准备一盒冰和若干无菌培养皿，用于在分离过程中保存所分离的组织。
2. 培养基的制备
- 配制完全培养基。使用含1%青霉素/链霉素和10%胎牛血清（FBS）的最低必需培养基α（α-MEM）。
- 使用0.22 μm滤膜过滤步骤2.1中的培养基。
- 配制骨髓细胞诱导培养基。取49.875 mL完全培养基（来自步骤2.2），加入125 µL浓度为10,000 ng/mL的M-CSF（材料表），配制成终浓度为25 ng/mL M-CSF的50 mL溶液。
- 配制破骨细胞诱导培养基。取49.5 mL骨髓细胞诱导培养基（来自步骤2.3），加入500 µL浓度为10,000 ng/mL的RANKL（材料表），配制成终浓度为25 ng/mL M-CSF和100 ng/mL RANKL的50 mL溶液。
3. 骨髓来源细胞的分离
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结果
本实验方案的目的是方便地分离和纯化大量破骨细胞前体，并成功诱导形成破骨细胞。通过添加M-CSF和RANKL，在第5–6天可观察到巨大的破骨细胞。通过TRAP染色可成功鉴定破骨细胞的形成（图1A）。体积较大、呈紫色且具有多个细胞核（通常≥三个细胞核）的细胞被视为TRAP阳性多核细胞。采用该方法，在24孔板中通常可获得约800个破骨细胞，每个破骨细胞最多可含30个细胞核（图1B）。与传统方法相比，改进后的方法在整个分离过程中节省了约20分钟（图1C）。
利用骨片评估骨吸收活性是体外实验中的常用方法。通过甲苯胺蓝染色，吸收区域呈现浅绿色（图2A），并据此计算吸收面积。骨陷窝的结构与特征通过扫描电子显微镜清晰观察（
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讨论
体外获取并研究破骨细胞的能力，是任何希望研究骨代谢的研究人员所必需的一项关键且基础的技能，该技术有助于理解骨吸收性疾病的机制，并开发新型治疗药物。本研究描述了一种在既往方法基础上进行部分改良的实验方案。
通过使用移液器吸头和微量离心管获取骨髓，与传统方法相比，该方法显著缩短了获取骨髓的操作时间，并减轻了实验人员的工作负担。同时，该方法避免了骨髓样本丢失或针刺伤的风险。在先前的研究中，骨髓来源的细胞在分离后立即进行接种培养12,13。采用密度梯度离心法，根据沉降系数的差异来分离骨髓单核细胞。在密度梯度离心过程中，必须沿管壁轻柔、小心地加入细胞分离液，以确保界面清晰。然而，该技术受限于离心机的功能，以及是否可设置加速度和减速度参数。接种密度是破骨细胞培养的关键条件。由于接种细胞时密度不当，该实验方案曾多次失败。因此，本方案推荐每24孔板每孔接种约300,000个细胞。该方案也适用于从大鼠或其他动物（如小鼠、兔、鸡）中获取多种类型的骨髓来源细胞。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由国家自然科学基金（81473692）资助，项目负责人为马勇。作者谨此感谢南京中医药大学第一临床医学院医学研究中⼼的所有工作人员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 酸性磷酸酶白细胞（TRAP）试剂盒 | Sigma-Aldrich | 387A | |
| 自动硬组织切片机 | Lecia | RM2265 | |
| 牛股骨骨组织 | 自行采购 | ||
| 细胞培养箱 | Heraus | BB16/BB5060 | |
| 胎牛血清 | Sarana | s-fbs-au-015 | |
| 山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 488） | Abcam | ab150077 | |
| 硬组织研磨器 | Lecia | SP-2600 | |
| Histopaque 试剂盒 | 天津灏洋 | TBD2013DR | 硅化离心管及细胞分离液 |
| Hochest33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| 倒置相差显微镜 | Olympus | CKX31 | |
| 倒置荧光显微镜 | Lecia | DMI-3000 | |
| 不含谷氨酰胺的MEM培养基 | Gibco | 11090-081 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Gibco | 15140122 | |
| 兔抗降钙素受体抗体 | Bioss | bs-0124R | |
| 重组大鼠M-CSF | PeproTech | 400-28 | |
| 重组大鼠sRANK配体 | PeproTech | 400-30 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | Absin | abs47014932 | |
| 扫描电子显微镜 | FEI | Quanta 200 | |
| 甲苯胺蓝 | Sigma-Aldrich | 89649 |
参考文献
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level. Clinical Biochemistry. 45 (12)....
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