方法文章

Lucifer Yellow——一种在人血脑屏障细胞模型中可靠的细胞旁通透性标记物

DOI：

10.3791/58900

⸱

2019年8月19日

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical, Administrative and Social Sciences, Duquesne University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, University of Kentucky

本文内容

摘要

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我们介绍了一种荧光检测方法，用于证明 Lucifer Yellow（LY）是一种可靠的标志物，可用于测定人脑微血管内皮细胞 D3 系（hCMEC/D3）单层细胞的表观旁细胞通透性，该细胞模型是人血脑屏障的体外模型。我们利用该检测方法确定了培养的 hCMEC/D3 细胞形成融合单层的动态过程。

摘要

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血脑屏障（BBB）由内皮细胞构成，形成系统循环与大脑之间的屏障，以阻止非必需离子和有毒物质的交换。紧密连接（TJ）有效封闭单层细胞间的旁细胞间隙，从而形成完整的屏障。本研究描述了一种基于荧光素（LY）的荧光检测方法，可用于测定其表观通透系数（Papp），进而用于评估hCMEC/D3单层细胞融合过程中紧密连接屏障完整性的形成动力学。我们进一步展示了该检测方法的另一用途，即评估转染细胞中紧密连接的功能完整性。LY的Papp检测结果显示，在Transwell体系中接种的hCMEC/D3细胞在培养7天后能有效限制LY的旁细胞转运。作为该检测方法的附加应用，我们还证明了DNA纳米颗粒转染不会改变hCMEC/D3单层细胞中LY的旁细胞转运。

引言

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血脑屏障（BBB）是一种保护性屏障，可限制血浆成分进入脑组织，主要由脑血管内皮细胞及周细胞等支持细胞构成。BBB 的主要功能是作为屏障，封闭外周血液与中枢神经系统（CNS）之间的通路，以维持神经微环境的稳态1,2。脑毛细血管内皮细胞通过形成细胞间紧密连接（TJs）有效封闭了旁细胞通路1。该保护性屏障允许葡萄糖和部分营养物质进入脑组织，同时阻止大多数离子、有毒物质和药物穿过这一紧密屏障。除了保护作用外，BBB 的天然屏障功能也给靶向中枢神经系统的药物递送系统的开发带来了严峻挑战。

血脑屏障（BBB）的体外细胞培养模型是研究其生物学特性以及理解药物治疗对紧密连接屏障完整性影响的有力工具。我们采用人脑微血管内皮细胞系（hCMEC/D3）作为体外模型，因其是公认的人脑内皮细胞模型3，并能重现人血脑屏障的多种功能。hCMEC/D3是目前最常用的体外血脑屏障建模细胞系之一4,5,6,7,

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方案

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1. 人脑微血管内皮细胞 hCMEC/D3 的常规培养

  1. 冻存细胞的复苏
    注意：所有细胞培养的维持和实验均在无菌生物安全柜内进行。培养基、添加剂和试剂均购自无菌产品，或通过使用0.22 µm膜滤器过滤灭菌，以防止微生物污染。
    1. 在组织培养瓶（75 cm2生长面积；以下简称T75）中加入8.5 mL胶原蛋白溶液（0.15 mg/mL），置于培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育1小时。
    2. 移除胶原蛋白溶液，并用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤培养瓶。向瓶中加入15 mL完全培养基，放入CO2培养箱中静置15分钟。
      注意：完全培养基（终浓度）包含内皮细胞生长基础培养基-2（500 mL），并添加胎牛血清（5%）、青霉素-链霉素（1%）、氢化可的松（1.4 µM）、抗坏血酸（5 µg/mL）、化学成分明确的脂质浓缩液（1/100）、HEPES（10 mM）和碱性成纤维细胞生长因子（1 ng/mL）。
    3. 从液氮罐中取出一支冻存的hCMEC/D3细胞冻存管，在37 °C水浴中迅速融化（< 1分钟）。
    4. 当仅剩微小冰晶可见时，迅速吸出细胞悬液并转移至含有预热培养基的培养瓶中。轻轻摇动培养瓶，使细胞与培养基充分混匀。
    5. 将培养瓶放回培养箱（37 °C，5% CO2），2小时后在....

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结果

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首先，我们通过测定培养时间对LY通透性的影响，以确定紧密连接（TJ）形成的表观动力学。LY的平均P应用程序 第1天至第10天接种后的数值如图所示 图2a第1天，平均P应用程序 为 4.25 × 10-4 厘米/分钟，并略微下降至 3.32 x 10-4 cm/min，第2天的平均P应用程序 数值略微增加至 3.93 x 10-4 第3天为 cm/min，随后在第6天之前波动但无显著变化。P应用程序 数值显著下降至 2.36 x 10-4 cm/min，第7天与第1天相比（P < 0.05），可能表明屏障变得更加紧密。P应用程序 数值稳定在 2.14 × 10 的范围内-4 和 2.36 × 10-4 从第7天到第10天，cm/min，表明屏障已完全形成并具备功能，导致L.......

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讨论

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血脑屏障（BBB）的关键作用是阻止非必需离子和有毒物质在体循环与大脑之间交换，以维持神经微环境的稳态。BBB的一个特征性特点是毛细血管内皮细胞能够形成紧密连接（TJs），从而有效封闭细胞旁路的物质转运途径。我们展示了荧光素标记的葡聚糖（LY）表观通透系数（Papp）测定法，作为一种定量方法，用于测定培养的hCMEC/D3单层细胞中紧密连接屏障形成的表观动力学。通过Western blot检测ZO-1表达水平，从正交角度验证了LY Papp实验所得数据，下文将对此进行详细讨论。作为该检测方法的进一步应用，我们还证明了DNA纳米颗粒（NP）转染未显著改变LY Papp值，表明该方法适用于在实验体系中检测紧密连接屏障特性的变化。

Western blot 数据显示，ZO-1 表达量在接种后第 3、5、7 天明显增加，在接种后第 10 天略有下降 (图4a)。从 图1可以看.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者感谢美国药学协会2017年新研究者奖、杜肯大学Hunkele罕见疾病奖以及Manickam实验室药学院启动资金提供的财务支持。我们感谢杜肯大学Leak实验室在Western印迹实验方面的协助，并允许我们使用其Odyssey 16位成像系统。我们还要特别感谢Manickam实验室的Kandarp Dave在Western印迹实验中提供的帮助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
hCMEC/D3 细胞系Cedarlane Laboratories102114.3C-P25人脑微血管内皮细胞系 
gWizLucAldevron 5000-5001编码荧光素酶基因的质粒 DNA
荧光黄 CH 二锂盐 Invitrogen155267
带聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）径迹蚀刻膜的 Transwell 小室Falcon353095
组织培养瓶 Olympus Plastics25-207
24 孔平底板 Olympus Plastics25-107
黑色 96 孔免疫板 Thermo Scientific437111
S-MEM 1XGibco1951695旋转式最低必需培养基（S-MEM）
EBM-2CloneticsCC-3156内皮细胞基础培养基-2（EBM-2） 
1× 磷酸盐缓冲液HyCloneSH3025601
I 型胶原蛋白 Discovery Labware, Inc.354236
Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒 Thermo Scientific23227
细胞裂解液 5X 试剂 PromegaE1531
甲虫荧光素钾盐 PromegaE1601
SpectraMax i3 Molecular Devices荧光酶标仪
台盼蓝溶液，0.4%Gibco15250061
ZO-1 多克隆抗体 ThermoFisher61-7300
抗 GAPDH 抗体abcamab8245
Alexa Fluor 680 标记的 AffiniPure 驴抗小鼠 IgG(H+L)Jackson ImmunoResearch Inc128817
12 孔平底板Olympus Plastics25-106
RIPA 裂解缓冲液（5X）Alfa AesarJ62524
抑肽酶Fisher BioReagentsBP2503-10
Odyssey CLx 成像系统LI-COR Biosciences用于扫描 Western 印迹膜

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platfo....

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hCMEC D3 DNA ZO 1

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