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方法文章

中尺度粒子图像测速法在神经血管血流研究中的应用 体外

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DOI：

10.3791/58902

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2018年12月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, University of California, Riverside, 2Division of Interventional Neuroradiology, University of California, Los Angeles, 3Materials Science and Engineering Program, University of California, Riverside, 4Department of Bioengineering, University of California, Riverside

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了制备透明神经血管仿体及其内部流动表征的简化方法。我们强调了若干关键参数，并展示了这些参数与测量场准确度之间的关系。

摘要

粒子图像测速技术（PIV）因其能够在大范围时空尺度上精确可视化并量化流动现象，已被广泛应用于众多领域。然而，该技术的实施通常需要使用昂贵且专用的仪器设备，限制了其更广泛的应用。此外，在生物工程领域，体外流动可视化研究还常常受限于商业化组织模拟体（phantom）的高昂成本，尤其是那些涵盖介观尺度（即亚毫米至毫米量级）解剖结构的模型。本文提出了一种简化的实验方案，以应对上述限制，其关键要素包括：1）采用3D打印与硅胶浇铸技术制备介观尺度组织模拟体的相对低成本方法；2）一个开源的图像分析与处理框架，可降低对测量介观尺度流动（即速度达数十毫米/秒）所需仪器设备的要求。总体而言，该方案利用了许多生物工程研究人员已具备的资源，从而降低了非专业人员的技术门槛。我们以神经血管流动表征为例，验证了该方案的适用性；但预计其还可广泛适用于生物工程及其他领域的多种介观尺度研究场景。

引言

粒子图像测速技术（PIV）在实验流体力学中被广泛用于流动可视化以及对从大气尺度到微循环流动等不同长度尺度下的流体运动进行定量研究1,2,3。尽管其具体实施方法随应用范围而异，但几乎所有PIV研究都有一个共同特点：在工作流体中引入示踪粒子，通过视频成像记录其运动，随后对连续的图像帧进行成对分析，以提取所需的流动特征。通常，该过程首先将每幅图像划分为若干较小区域，称为 interrogation window（ interrogation 窗口）。由于分散粒子的位置具有随机性，每个 interrogation 窗口内都包含独特的像素强度分布。若合理选择窗口尺寸和数据采集速率，则可通过计算每个窗口内强度信号的互相关，来估算该区域内的平均位移。最后，在已知放大倍数和帧率等实验参数的情况下，即可快速计算出瞬时速度矢量场。

与单点测量技术相比，PIV 的主要优势在于其能够在一个二维或三维区域内映射矢量场。血流动力学应用尤其受益于这一能力，因为它可以对局部流动进行深入研究，而这些局部流动已知在血管疾病或血管重塑（例如，动脉粥样硬化、血管生成）中起着重要作用4,5,6。这一优势同样适用于神经血管血流的评估及其与血管内装置（例如，血流导向装置、支架、囊内弹簧圈）的相互作用研究，因为在这些应用中，相关的长度尺度通常跨越一个或多个数量级（例如，从微米到毫米），且装置的几何结构和放置位置会显著影响局部流体力学特性7。

大多数开展基于PIV的血流动力学研究的团队都依赖于实验装置，这些装置 closely模仿了早期关于支架对血管血流影响的一些研究7,8。通常，这些装置包括：a）脉冲激光器和高速相机，用于捕捉高速流动；b）同步器，用于防止激光脉冲频率与相机采集帧率之间的混叠；c）柱面光学元件，用于形成光片，从而最小化 interrogation 平面上下区域示踪粒子产生的背景荧光；d）对于商用即插即用系统，还需使用专有的软件包进行互相关分析。然而，尽管某些应用需要这些组件共同提供的性能和/或灵活性，但许多其他应用并不需要。此外，用于复现目标血管结构的商用组织仿体价格高昂，也限制了许多体外（in vitro）研究的开展，特别是对于跨越介观尺度（> 500美元/仿体）特征的仿体而言尤为如此。本文中，我们报道了一种简化的PIV实施协议，用于体外（in vitro）可视化神经血管流动，这类流动在空间和时间尺度上通常均处于介观尺度范围（i.e.，长度尺度从亚毫米到毫米，流速可达数十毫米/秒）。该协议旨在利用许多生物工程研究人员已具备的资源，从而降低非专家用户的使用门槛。

本方案的第一步涉及使用失蜡铸造技术，利用3D打印的可牺牲模具在实验室内制备透明的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基组织模拟体。通过近年来日益普及的3D打印机，特别是共享或多用户设施中的设备，例如，机构设施或公共创客空间），该方法可显著降低成本（例如, < 100美元/模型，在本案例中），同时能够快速制造各种设计和几何形状的模型。在本实验方案中，采用熔融沉积成型系统，以丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（ABS）作为构建材料，所打印的部件用作后续模型铸造的牺牲模具。我们的经验表明，ABS非常适用于此类用途，因为它可溶于常见的溶剂中。例如，丙酮），并且在去除支撑材料后仍具有足够的强度和刚性以保持模具的完整性例如，以防止微小模具结构的变形或断裂）。在本方案中，使用实心打印模型可进一步确保模具的完整性，但会延长溶解时间。在某些情况下，也可采用空心模型以增强溶剂的渗透性，从而缩短溶解时间。然而，需谨慎评估空心结构对模具完整性可能造成的影响。最后，尽管本文所制备的模型基于常用计算机辅助设计（CAD）软件生成的理想化神经血管结构，但该方案同样适用于更复杂、患者特异性几何结构的制备例如, 通过 使用由临床影像数据转换生成的模型文件（转换为大多数3D打印机所使用的.STL文件格式）。有关模体制造过程的更多详细信息，请参见方案的第2节。

实验方案的第二个步骤涉及使用一款开源的 ImageJ 插件来执行互相关分析9。这结合了一种简单的统计阈值化方案的实施（即，强度截断）10 在互相关之前改善图像信号，以及采用互相关后的矢量验证方法——归一化中值检验（NMT），通过将每个矢量与其最近邻进行比较以消除虚假矢量11综上所述，这使得成像过程可以使用许多生物工程实验室中常见的设备来完成，从而无需购置典型PIV系统中许多昂贵的组件（例如，脉冲激光器、同步器、柱面光学元件和专有软件）。有关视频采集、图像处理和数据分析的更多细节详见方案的第5和第6节。

图1 展示了本方案中使用的PIV装置设置，该装置基于配备高速相机用于成像的荧光显微镜，以及一个外部连续白光光源（即，金属卤化物灯）以实现通过物镜的体照明。使用可变速齿轮泵，使透明的模拟血液溶液在神经血管组织模拟体中循环流动。该溶液由去离子水（DI水）与甘油按60:40的比例混合而成，是血流动力学研究中常用的血液替代物。12,13,14，由于其相似的密度和黏度（即，1,080 kg/m3 和 3.5 cP 与 1,050 kg/m3 以及血液的3 - 5 cP15,16；b）在可见光范围内的透明性；c）与PDMS相似的折射率（1.38） 与 1.42（PDMS）17,18,19,20，可最大限度地减少光学畸变；d） 如有需要，可方便地引入非牛顿行为 通过 黄原胶的添加21最后，使用荧光聚苯乙烯微珠作为示踪粒子（直径10.3 µm；激发/发射波长为480 nm/501 nm）。尽管理想情况下应采用中性浮力微珠，但获取具有最优流体力学特性的示踪粒子（例如，密度、尺寸、组成）和发射波长可能具有挑战性。例如，本文所用微球的密度略低于甘油溶液（1,050 kg/m³）3 与 1,080 kg/m3）。然而，其流体动力学效应可忽略不计，因为典型实验的持续时间远短于与浮力效应相关的时间尺度（即，分别为5分钟和20分钟）。有关模拟血液溶液配制的更多细节 体外 循环系统设置详见方案的第3和第4部分。

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方案

1. 基于ABS的牺牲模具制备

  1. 使用CAD软件设计所需组织仿体的逆向模型。
  2. 使用以ABS为建造材料的3D打印机打印该模型。

2. 基于PDMS的血管仿体制造

  1. 混合
    1. 按10:1的质量比混合PDMS预聚物基础剂与固化剂；66 g的混合物足以用于制备体积达50 cm3的仿组织体模。
    2. 将混合物置于真空干燥器中60分钟以脱气并尽量减少气泡夹杂。采用循环加压/减压方式促进气泡破裂。
  2. 浇铸
    1. 使用模具腻子将打印的ABS模具固定在玻璃载片上，以密封界面。
    2. 小心地将PDMS混合物倒入模具中，尽量减少气泡夹杂。残留气泡可用针头手动刺破。
    3. 在室温（25 °C）下固化浇铸的体模至少24小时。
      注：在较高温度下，此过程可加快22。
  3. 脱模
    1. 通过将体模浸入丙酮中并超声处理至少15分钟（功率最高达70 W）来溶解ABS。
      警告：丙酮在室温下具有高蒸气压和低闪点。因此，操作时务必在通风橱内进行，并远离潜在点火源。佩戴适当的个人防护装备（例如，护目镜或面罩、实验服、耐丙酮手套）。
    2. 用异丙醇彻底冲洗体模，然后用去离子水冲洗，以去除溶剂残留物。
      注：PDMS在接触丙酮时会膨胀；然而，一旦体模充分冲洗并干燥，膨胀现象即会消退23。
  4. 使用光学显微镜确认体模保真度
    1. 使用配备相机和图像采集软件的光学显微镜，在能够使体模内关键特征在视野中最大化放大的倍率下，拍摄该特征的图像。
    2. 在相同放大倍率下拍摄适当校准刻度板的图像。
    3. 通过将两幅图像拖拽至 工具栏，将其加载到ImageJ中。
    4. 单击校准刻度板图像使其处于活动状态，然后选择直线工具。使用鼠标沿已知距离的特征画一条线，然后从ImageJ菜单中选择分析 > 设置比例尺。
      注：在设置比例尺窗口中，标为像素距离的字段应已自动填入所画线段的像素长度。
    5. 在标为已知距离的字段中输入该特征的实际长度，并在标为长度单位的字段中输入其单位。勾选标为全局的复选框，以将此校准因子应用于所有已打开的图像。
    6. 使体模关键特征的图像处于活动状态，使用直线工具沿感兴趣特征画一条线。从ImageJ菜单中选择分析 > 测量（或按下Ctrl + M），以测量该线段的长度。
    7. 将测量结果与结果窗口中标记为长度的列中的数值进行比较，以确认体模的保真度。

3. 模拟血液溶液的配制

  1. 将去离子水与甘油按60:40的体积比混合。
    注意：100 mL 体积足以满足以下需求 体外 本文所述的循环系统。
  2. 加入1 mL 2.5% w/v 荧光聚苯乙烯微球溶液（即，示踪粒子）加入模拟血液溶液中。
  3. 在磁力搅拌器上以400 rpm转速均质化混合物，持续10分钟。

4. 体外 循环系统装置设置

  1. 泵的设置
    1. 使用剥线工具从交流转直流适配器电源上剪下直流端插头。
    2. 剥去电源线和接地线的绝缘层，并将其连接到脉宽调制（PWM）电压调节器的输入端子。
    3. 将泵的直流电机的电源线和接地线连接到PWM电压调节器的输出端子。
      注：PWM的七段数码管显示输出占空比（0% - 100%），用于向直流电机提供可变电压。
  2. 泵的校准
    1. 准备200 mL模拟血液溶液（见第3节）。
    2. 将泵入口管路放入盛有模拟血液溶液的烧杯中。
    3. 将泵出口管路放入一个空烧杯中。
    4. 选择一个期望的占空比设定值（0% - 100%）。按下开启按钮并启动计时器。
    5. 当泵完全转移完模拟血液溶液时停止计时。利用该时间计算体积流量。
    6. 对至少五个不同的占空比设定值重复步骤4.2.1 - 4.2.5，以建立最小二乘回归曲线。
      注：建议每个占空比设定值至少进行三次重复测量。该关系可用于将期望的流量与所需的PWM占空比相关联。

5. 视频采集

  1. 图像校准
    1. 确定视频成像的校准比率（参见第2节）。
  2. 仪器装置设置
    1. 将PDMS仿体置于荧光显微镜的载物台上。
    2. 将模型连接至齿轮泵，并注入模拟血液溶液。
      注意：可选择先用乙醇预填充模型，以促进充分润湿；随后用模拟血液溶液冲洗并填满模型。对于具有较细血管和/或盲端结构的模型，此步骤可能尤为有益。
    3. 根据泵的校准曲线设置泵电机控制器以达到所需的流速。
    4. 实验前运行泵 1 - 5 分钟，以确保达到稳态条件。
    5. 打开外部光源以照亮视野。根据荧光微球的激发波长选择合适的滤光片。
    6. 调整成像焦平面至血管中平面。
      注意：可通过使用使成像血管横截面最大化的焦距来实现这一点（例如（在使用具有圆形血管横截面的模体时）；和/或利用模体上专为便于识别血管中平面而设计的特征进行定位。
  3. 视频记录
    1. 选择视频录制参数以优化信噪比（SNR）。关键参数包括曝光时间、帧率和增益。
      注意：在本实验方案中，我们采用 2,000 fps 的帧率和 1.0 的增益。然而，这些参数可能因具体应用而异（详见讨论部分）。
    2. 采集视频并将其保存为 AVI 格式。
  4. 假体清理
    1. 若实验后观察到珠子粘附现象，使用功率高达70 W的水基洗涤剂溶液对模体进行超声处理。

6. 图像处理与数据分析

  1. 图像预处理
    1. 将保存的 AVI 文件拖放到 ImageJ 窗口中以导入。选中标记的框 转换为灰度图像.
    2. 从 ImageJ 菜单，选择 分析 > 生成直方图 （或按） Ctrl + H) 生成图像像素强度的直方图。记录未处理图像的平均值和标准差。
      注意：在高帧率下，分布严重偏向零值是常见现象即，无信号）。
    3. 从 ImageJ 菜单，选择 图像 > 调节 > 亮度与对比度 （或按） Shift + Ctrl + H) 应用亮度/对比度滤镜。
    4. 在 亮度与对比度 菜单，按下 设置 按钮以定义图像范围。将最小值设置为平均值加一个标准差，最大值设置为图像的最大强度值（两者均基于步骤 6.1.2 中获得的统计结果）。
      注意：这通常会消除除像素强度最高的10%以外的所有像素。可根据期望的像素强度分布调整标准差的数值。用于执行强度截断操作的自定义宏脚本见附录 补充材料.
    5. 从 ImageJ 菜单，选择 过程 > 噪声 > 去斑 以减少饱和像素的数量。
      注意：此操作是必要的，因为优化亮度和对比度时会增加像素饱和的可能性，这可能在后续的互相关分析中产生虚假的矢量。
    6. 从 ImageJ 菜单，选择 过程 > 筛选器 > 高斯模糊 半径为1.5，以减少先前去斑操作在3×3邻域中偶尔移除被照亮像素所引起的伪影。
    7. 点击 多边形 工具，然后单击图像以勾画出感兴趣区域（ROI）。
    8. 从 ImageJ 菜单，选择 编辑 > 清除外部 在无信号预期区域去除传感器噪声（例如，血管壁边界以外的区域），这可能会降低整体信噪比。
  2. PIV 计算
    注意：本实验方案部分采用 ImageJ 的第三方 PIV 插件，该插件依赖高斯峰拟合，以实现亚像素精度的位移估算。
    1. 从 ImageJ 菜单，选择 插件 > 宏 > 运行…并导航至已保存的宏 补充代码 2.ijjm 对连续的图像对进行互相关分析。
      注意：该宏的执行步骤如下。1）首先对连续图像中的强度场进行互相关分析，以确定被对流的示踪粒子的局部位移（即第一组图像由第一幅和第二幅图像组成，第二组图像由第二幅和第三幅图像组成， 等等。）。2）随后进行两步多遍评估，初始和最终的查询窗口大小分别为256 × 256像素和128 × 128像素。最后，3）该宏执行时间平均，以进一步减少虚假矢量的出现。
  3. 标准化中位数检验（NMT）
    1. 从 ImageJ 菜单，选择 插件 > 宏 > 运行…并导航至已保存的宏 补充代码 3.ijjm 验证速度场 通过 归一化中位数检验
      注意：该宏的执行过程如下：1）首先将瞬时矢量场中的每个矢量与其八个最近邻的矢量进行比较，计算出中位数值；2）然后计算残差误差数组，即每个相邻矢量与所计算出的中位数值之间的差值；3）将待分析矢量与相邻矢量中位数值之间的差值，除以残差的中位数进行归一化；4）然后将该值与一个阈值（通常为0.2像素）进行比较，该阈值可根据具体情况调整 先验的 在图像采集过程中了解噪声情况。最后，5）对所有经过验证的瞬时矢量场进行时间平均，以生成复合场，因为已有研究表明这种方法能够提高矢量场的质量24.

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结果

图2 展示了PDMS组织仿体的制备过程。本文设计的仿体旨在用于研究理想化的宽颈囊状颅内动脉瘤以及近端分支穿支动脉中的血流情况。其他重要的设计特征包括：1）所有血管均汇入一个共用的储液腔，以确保液体顺畅流出仿体——否则，在较细血管的出口处可能会形成液滴；2）设置气泡捕获结构，便于去除气泡；3）设置外层腔壁，以确保血管与水平面保持平行，并精确定义最终仿体板的高度、长度和宽度；4）由于打印机无法以足够的保真度成型穿支动脉的微小结构，故采用21 G的皮下注射针针杆（标称外径为820 µm）作为穿支动脉的成型模具。所有设计特征均得到了准确再现。

采用本方案进行基于PIV的流动表征所获得的代表性结果如下所示 图3 和 图4这些研究采用100 mL/min的模拟入口流速、2,000 fps...

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讨论

本文所述方案概述了一种简化的方法，用于开展粒子图像测速（PIV）研究，以在生理相关的尺度和流动条件下可视化神经血管内的血流。 体外从而补充了其他研究者所报道的实验方案，这些方案同样聚焦于简化矢量场的量化，但针对的是需要考虑更大空间尺度的截然不同的情境。25 或更低的流速26,27 (例如，大气或微循环流动），因此依赖于与当前应用不兼容的方法。

成功实施粒子图像测速（PIV）最重要的考虑因素在于最大限度地减少流场伪影并最大化图像质量。在组织仿体的制备过程中，多个步骤对实现这两个目标至关重要。例如，充分脱气十分关键，因为在混合过程中混入PDMS中的空气可能导致最终仿体内部形成气泡，从而对结构保真度和光学清晰度产生不利影响。此外，应尽量降低ABS模具的表面粗糙度，因为PDMS浇铸过程会忠实地复制出即使是最微小的表面缺陷。例如，构建线、表面孔隙、划痕），从而导致最终模型表面...

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

作者感谢加州大学河滨分校研究与经济发展办公室提供的协作种子基金对该项目的部分资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Solidworks 2015Dassault SystemsN/ACAD 软件 
Dow Corning Sylgard 184 KitEllsworth Adhesive184 SIL ELAST KIT 3.9KGPDMS 试剂盒
Stratasys Dimension EliteStratasys9180-001053D 打印机
P430 模型材料盒Stratasys340-21202ABS 成型材料 
P400 SR 可溶性支撑材料盒Stratasys340-30200支撑材料
CleanStation DT3PM3 Technologies00-00300R基础浴槽
Lindberg Blue M LGO 箱式炉 Thermo ScientificLB305745M烘箱
21G BD PrecisionGlide 针头Betcon DickensonBD 305167分支穿孔器模具段
干燥器（真空）Polylab55205干燥器
Branson 1800 超声波清洗器BransonCPX-952-116R超声仪
丙酮Fisher ChemicalA9494丙酮
异丙醇Fisher ChemicalA4514异丙醇
甘油Fisher ChemicalGW33500甘油
10 µm 聚苯乙烯黄绿色荧光微粒MagspherePSF-010UM荧光微珠
Phantom Miro Vision ResearchMiro M310高速相机
微型泵Cole-Parmer81101循环泵
Leica DM2000Leica MicrosystemsDM2000荧光显微镜
Leica 10X 物镜Leica Microsystems506259穿孔器用物镜
Leica 2.5X 物镜Leica Microsystems11506083动脉瘤囊用物镜
Leica 蓝色滤光立方 L5Leica Microsystems513840蓝色滤光立方
Leica EL6000Leica Microsystems11504115光源
AlconoxAlconox Inc1104-1洗涤剂
ImageJNIHN/A开源图像分析软件
https://imagej.nih.gov/ij/
粒子图像测速 PIV 插件Qingson TsengN/Ahttps://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv

参考文献

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