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方法文章

利用氨基酸水平的遗传变异信噪比分析确定变异致病可能性

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DOI：

10.3791/58907

⸱

2019年1月16日

 , 
1Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, 2Department of Pediatrics, Division of Cardiology, Duke University School of Medicine

本文内容

摘要

氨基酸水平的信噪比分析可确定特定氨基酸位点遗传变异的普遍程度，该值已相对于特定人群的背景遗传变异进行标准化。这有助于识别变异 "热点" 在蛋白质序列中（信号）高于群体中罕见变异频率（噪声）的区域。

摘要

新一代基因测序技术在成本和速度方面的进步，推动了临床全外显子组和全基因组检测的迅速普及。尽管这提高了与遗传综合征相关的可能致病突变的检出率，但也显著增加了偶然发现的临床意义未明遗传变异（VUS）的数量。确定这些变异的临床意义，对科研人员和临床医生而言均构成重大挑战。一种辅助判断其致病可能性的方法是基于蛋白质序列水平的信噪比分析。本实验方案描述了一种氨基酸水平的信噪比分析方法，该方法结合已知蛋白质拓扑结构中每个氨基酸位置的变异频率，识别在初级序列中病理变异可能性显著升高（相对于人群"背景"变异）的区域。该方法可识别出具有高致病信号的氨基酸残基位置"热点"，从而有助于重新评估由新一代基因检测所发现的VUS的诊断权重。

引言

基因测序平台的快速发展已彻底改变了遗传学在医学中的可及性与作用。过去仅限于单个基因或少数几个基因的检测，随着新一代基因测序成本的降低和速度的提升，目前在临床实践中已常规开展对基因组全部编码序列（全外显子组测序，WES）乃至整个基因组（全基因组测序，WGS）的测序。WES和WGS已 在危重新生儿和儿童中，当怀疑存在遗传综合征时，该方法已被频繁使用，作为一种已证实的诊断工具，可改变临床管理方案1,2尽管这提高了与遗传综合征相关的可能致病性突变的检出率，但也显著增加了偶然发现的遗传变异或未知诊断意义的意外阳性结果（VUS）的数量。尽管其中一些变异被忽略且不予报告，但位于与潜在致命性或严重疾病相关基因上的变异通常会被报告。目前的指南建议报告在特定基因中发现的偶然变异，这些变异可能对患者具有医学意义，包括与心肌病和通道病等易导致猝死的疾病相关的基因。3尽管该建议旨在识别出易患致心律失常性猝死疾病的高危个体，但变异检测的敏感性远高于特异性。这导致意义未明的变异（VUS）及偶然发现的诊断价值不明确的变异数量不断增长，其发生频率远超过特定人群中相应疾病的患病率。4一种此类疾病——长QT综合征（LQTS）——是一种典型的由基因突变引起的心脏离子通道病，这些基因编码心脏离子通道或与通道相互作用的蛋白质，导致心肌复极延迟。5。这种延迟的复极化在静息心电图上表现为QT间期延长，会导致心室发生潜在致命性心律失常的电生理易感性，例如 尖端扭转型室性心动过速尽管已有多个基因被发现与该疾病的发生相关，但其中的突变 KCNQ1编码 IKs 钾通道（KCNQ1，Kv7.1）是1型长QT综合征的致病原因，下文将其作为示例使用6. 说明了变异解读的复杂性，即在与长QT综合征（LQTS）相关基因中存在罕见变异，所谓 "背景遗传变异" 此前已有描述7,8.

除了已知致病性变异的大规模汇编型数据库外，目前已有多种策略可用于预测不同变异所产生的效应。其中一些方法基于算法，例如 SIFT 和 Polyphen 2，可用于筛选大量新发的非同义变异，以预测其有害性9,10尽管这些工具被广泛使用，但其特异性较低，限制了它们在以下情况下的适用性 "呼叫" 临床意义未明变异11. "信噪比" 分析是一种基于目标基因座上已知致病变异频率与人群罕见遗传变异频率进行标准化比较，从而评估某变异与疾病相关可能性的工具。若某变异位于致病突变频率相对于人群变异频率较高的基因座（即信噪比较高），则该变异更可能与疾病相关。相反，在致病突变频率相对较低而人群罕见变异频率较高的基因中偶然发现的罕见变异（即信噪比较低），则与疾病相关的可能性较小。信噪比分析在最新发布的心肌病和通道病遗传检测指南中已体现出其诊断价值；然而，目前该方法仅应用于全基因水平或特定结构域水平12近年来，随着病理变异（疾病数据库、文献中的队列研究）以及基于人群的对照变异（外显子组聚合联盟，ExAC 和基因组聚合数据库，GnomAD）的可获取性不断提高13），该方法已应用于蛋白质一级序列中的各个氨基酸位置。氨基酸水平的信噪比分析已被证明在将偶然发现的与长QT综合征（LQTS）相关基因变异分类为可能致病性方面具有实用价值 "背景" 遗传变异而非疾病相关变异。在与长QT综合征（LQTS）相关的三个主要基因中，包括 KCNQ1，这些偶然发现的变异缺乏一个 显著的信噪比，表明这些变异在单个氨基酸位点的频率反映的是罕见的群体变异，而非与疾病相关的突变。此外，当将蛋白质特异性的结构域拓扑结构与高信噪比区域叠加时，可发现致病性突变 "热点" 定位于蛋白质的关键功能区14该方法有望用于确定：1）某变异体与疾病或人群相关的可能性；2）识别与人类疾病相关的蛋白质中新的关键功能结构域。

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方案

1. 确定目标基因及特定剪接异构体

注意：此处我们演示 Ensembl 的使用方法15 以确定与目标疾病发病机制相关的感兴趣基因的共识序列（即 KCNQ1 基因突变与长QT综合征（LQTS）相关。除 Ensembl 外，还可通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）的 RefSeq 获取相关信息。16 加利福尼亚大学圣克鲁斯分校（UCSC）人类基因组浏览器17 （参见 材料表).

  1. 在 Ensembl 主页上，选择物种（即 在下拉菜单中选择“人（human）”，然后在字段中输入目标基因的缩写即 KCNQ1）。点击 "开始"
  2. 选择与目标基因对应的链接（即 "KCNQ1（人类基因）"
  3. 选择与目标转录本编号对应的链接 "转录本表格" (即 转录本ID ENST00000155840.10，NM_000218 [RNA转录本]，NP_000209 [RNA转录本的蛋白质产物]
    注意：需查阅相关文献，以确保选择正确的转录本共识序列。
  4. 记录转录本特异性的 NM 和 NP 编号以供后续参考 "RefSeq" 列的 "转录表".
  5. 点击与NP ID编号关联的链接，以打开NCBI蛋白质数据库的新网页。
  6. 向下滚动至 "起源" 获取目的基因转录本的蛋白质（一级）序列。
  7. 向上滚动到 "特点" 获取蛋白质特征（功能结构域、结合结构域、翻译后修饰位点）的列表。
    注意：此信息也可通过 NCBI 蛋白质数据库或文献中的原始来源获得。这将在步骤 5 中进一步讨论。

2. 创建实验性遗传变异数据库（即“"Signal"）

注意：此处我们演示如何创建一个与目标基因相关的疾病变异数据库，其中包含这些疾病相关变异在患有目标疾病个体中的频率。该数据库可以有多种形式，代表了 "信号" （表型阳性遗传变异），将相对于对照变异数据库进行标准化。这可以包括：1）与疾病相关的变异，用于与意义未明的变异（VUSs）进行比较 用于识别该蛋白的新功能结构域和/或2）意义未明的变异（VUSs），包括偶然发现的VUSs，将其与疾病相关变异进行比较，以评估其致病可能性。本文将以KCNQ1中的疾病相关变异为例进行说明；然而，该方法同样适用于偶然发现的VUSs或任何其他实验变异集的分析。

  1. 确定一个或多个无关的先证者/索引病例队列，这些病例患有目标疾病，并且对目标基因在所有先证者中进行了全面的基因分型（即 某项研究在200名接受KCNQ1基因检测的长QT综合征（LQTS）患者中，识别出24名携带KCNQ1变异的无关先证者）。
    注意：这些队列可从文献、实验性基因分析或两者结合中确定。
    1. 排除非基于队列的研究（即 仅描述单个携带致病突变个体的病例报告）、未提供目标基因总检测人数的研究，或未对目标基因进行全面基因分析的研究（即 仅对KCNQ1外显子2-4进行"靶向"基因筛查）。这些情况无法计算变异频率。
    2. 仅纳入无关的先证者，排除亲属个体，以避免高估变异频率（即 某项研究在20名LQTS患者队列中识别出4名携带KCNQ1突变的无关个体。其中一名先证者属于一个包含5名其他携带相同突变亲属的家庭。应排除所有该家庭成员，仅纳入4名无关先证者）。
  2. 汇总在已识别队列中发现的所有实验性基因变异
    1. 采用包含野生型氨基酸、氨基酸位置和变异氨基酸的命名方式（即 第212位氨基酸丙氨酸变为缬氨酸，Ala212Val 或 A212V）。一种此类命名方式如图1所示。
    2. 确认所有实验性基因变异的命名均基于与步骤1.4中注明相同的参考基因转录本。若实验性基因变异未基于同一参考转录本注释，则需通过转录本比对将变异位置重新注释至参考转录本（见步骤1.2）。
  3. 根据研究问题排除不适用的变异。
    1. 排除定位于基因组非编码区或不改变蛋白质序列的变异，如同义变异、内含子变异、5'或3'非翻译区[UTR]及基因间区变异（即 报道的定位于KCNQ1编码区5' UTR的致病性变异将被排除，因其预测不会改变蛋白质序列）。
    2. 排除不符合研究纳入标准的变异。对于疾病相关变异，包括不再被认定为致病性的变异。
      1. 通过与ClinVar数据库交叉比对，确认每个变异当前是否被归类为致病性、可能致病性，或至少非良性（见材料表）。
      2. 在ClinVar搜索框中输入目标基因和变异（即 KCNQ1-Y111C），点击"搜索"。
      3. 在"变异/位置"列下找到目标变异。
      4. 查看"临床意义"列下的致病性共识解释（即 KCNQ1-Y111C被解释为"致病性"）。
      5. 纳入被标注为"可能致病性"或"致病性"的变异。
      6. 若研究需要，可纳入被标注为"致病性解释冲突"、"意义未明"或无记录（"未提供"）的变异。
      7. 排除被标注为"可能良性"的变异（即 KCNQ1-A62T）。
  4. 计算每个实验性变异位点的次要等位基因频率（MAF）。
    1. 计算每个相应变异的阳性等位基因数量（即 若在2名无关个体中发现KCNQ1-Y111C杂合突变，则变异阳性等位基因数为2）。
    2. 计算队列中测序的总等位基因数
      1. 记录每项队列研究中测序的总个体数（步骤2.1）
      2. 将总个体数乘以2，得到总等位基因数。
        注意：此计算假设为二倍体基因组，即每个个体携带两个等位基因。
    3. 计算每个氨基酸位置的变异阳性个体总数（步骤2.4.1中的等位基因数 / 步骤2.4.2中的等位基因总数）。例如，若在分别包含100名和200名LQTS患者的队列中，各有1名无关个体携带杂合KCNQ1-Y111C突变，则第111位氨基酸位置的实验性变异频率为2 / ((100+200)×2)（即 合并MAF为0.0033）。
    4. 对每个变异计算该值，作为其相应的实验性变异MAF。更多细节参见步骤4.2。

3. 创建对照基因变异数据库（"噪声"）

注意：此处我们演示如何创建目标基因中对照变异的数据库，并记录其在对照人群中的相应频率。该数据库代表了"噪声"（表型阴性、基于人群的遗传变异），即实验性变异数据库将据此进行标准化的背景。此类变异被称为"对照"变异。

  1. 确定一组或多组健康的非相关先证者，或利用大规模基于人群的研究，在特定人群中识别罕见变异。
    注意：该数据库的来源多样，包括：1）接受桑格测序的健康个体和/或表型正常的个体，或针对所研究疾病在人群中频率极低的公共人群数据库，例如 2）千人基因组计划（N = 1,094 名受试者）183）国家心肺血液研究所GO外显子组测序项目（ESP，N = 5,379名受试者）19，4）外显子组聚合联盟（Exome Aggregation Consortium，ExAC，N = 60,706 名受试者）13，和/或 5) 基因组聚类数据库（GnomAD，N = 138,632 名个体）13 （参见 材料表）。GnomAD 数据库将被用作示例。
    1. 在 GnomAD 主页的搜索框中输入目标基因即 KCNQ1
    2. 确认浏览器已选择正确的基因和目标转录本（步骤 1.4）。
    3. 通过审阅确认测序对位点的覆盖度适当 "平均覆盖度" 和 "覆盖度图"
    4. 通过选择编码序列的遗传变异进行筛选 "错义 + 功能丧失"
    5. 选择 "将表格导出为 CSV" 将生成一个名为 "未知。"
    6. 重新命名文件并添加新的扩展名 "*.csv" (即 "KCNQ1 对照变异.csv").
    7. 使用适用于分析 *.csv 文件的软件程序打开该文件（参见 材料表).
  2. 鉴定标注列中蛋白质的遗传变异变化 "蛋白质效应"
  3. 对这些对照遗传变异应用与实验遗传变异相同的排除标准（步骤2.3.1）。
  4. 确定每个对照变异体的等位基因频率（MAF）。
    1. 定位 "等位基因计数" 表示发现携带该变异等位基因的数量的列。
    2. 定位 "等位基因数量" 表示在此特定氨基酸位置测序的等位基因总数的列。
      注意：测序获得的等位基因总数将根据该位点的测序深度而有所不同。在高覆盖度区域，等位基因总数接近GnomAD中个体总数的两倍（例如，对于138,632个个体，完全覆盖时包含总共277,264个基因分型的等位基因）。  相反，覆盖度较低的区域将具有减少的 等位基因总数
    3. 定位预先计算好的变异MAF "等位基因频率" 柱并代表 "等位基因计数" 除以 "等位基因数量"
      注意：人类基因组中每种等位基因有两个拷贝（即 在10人中发现1名受试者携带杂合变异，其等位基因频率（MAF）为1/20
    4. 记录每个变异位点的次要等位基因频率（MAF），作为各对照变异位点相应的MAF。
      注意：GnomAD 中包含的每个种族/族裔组的变异特异性 MAF 可在右侧各列中查看 "等位基因频率"
  5. 对罕见变异应用次要等位基因频率（MAF）阈值，高于该阈值的对照变异将被排除 "常见"
    1. 将MAF阈值设为能够包含在对照数据库中观察到的所有真实疾病相关变异位点（见步骤2）的最大值  (即在所有在GnomAD中发现的与疾病相关的KCNQ1变异中，最高常见变异的等位基因频率（MAF）为0.009，因此所有在GnomAD中频率超过0.01阈值的变异均应被排除。
  6. 确保实验组变异命名与对照组一致（参见步骤 2.2）。
  7. 保存文件。在某些情况下，这可能需要更改文件类型/扩展名。

4. 氨基酸水平信噪比计算与映射

  1. 计算每个具有对照变异的氨基酸位点的MAF（参见 图1 包含 KCNQ1 GnomAD 变异示例。
    1. 在具备绘图功能的电子表格中，创建一列包含所有实验变异体位置的数据。
    2. 移除变异文本，仅保留变异位点。
      注意：可使用多种函数/公式在单元格内自动删除这些文本元素 (图1，C列；参见 材料表).
    3. 将变异按升序排列，以确定哪些位点关联了超过1个变异图1，E 列； 即 第10位氨基酸在E列中被列出两次，表示该位置存在2个不同的变异。
    4. 将与特定位置相关的每个变异的MAF通过计算该位置所有MAF的总和进行合并（图1，G列和H列）。
  2. 计算每个含有实验变异的氨基酸位点的 MAF（参见 图2 包含模拟的 KCNQ1 病理变异体。
    1. 与4.1.1类似，创建一列包含实验性变异的氨基酸位置图2，B列）。
    2. 对于每个变异位点，根据步骤 2.4 中与该位点相关的所有变异计算其等位基因频率（MAF）图2，柱 C-G）。
  3. 对实验组和对照组的MAF创建滚动平均值。
    1. 展开在 4.1 和 4.2 中创建的列，以包含无变异的氨基酸位点，其 MAF = 0。图3).
      1. 创建一列，包含目标基因中的所有氨基酸位置（即 1 到 676 对应 KCNQ1， 图3，C列和I列）。
      2. 为对照组和实验组数据集中所有无变异的位点添加一个 MAF 值为 0。
        注意：这可以通过利用 "VLOOKUP" 在一种常用软件程序中的功能图3，D 列和 J 列，参见 材料表).
    2. 为每个实验组和对照组的患病率列创建移动平均值。
      注意：这可用于推断相邻位置的致病性，可根据研究需求进行修改，甚至排除。 
      1. 创建一列表示对照组和实验组数据集中 MAF 的滚动平均值图3，柱 E 和 K）。
      2. 在滚动平均列中，填入给定位置N端5个变异位点和C端5个变异位点各自MAF的平均值。
        注意：这将生成正负5范围内的滑动平均值。对于滑动平均位置之前或之后少于5个氨基酸残基的位置（即 N端或C端）时，滚动平均值将仅考虑存在的残基即 氨基酸位置3的滑动平均值将是氨基酸位置1至8的MAF的平均值，计算方法为求和 这些MAFs除以8的结果。
  4. 通过将最低的滚动MAF除以2来计算最小控制频率。
    1. 将控制组MAF为0的任何细胞更改为最小频率，以避免在计算信噪比时出现除以0的情况。
  5. 计算氨基酸水平的信噪比（图4).
    1. 将每个氨基酸位点的实验滚动平均值除以相应的对照滚动平均值。
    2. 将该比值绘制成图（Y轴） 与 氨基酸位置（X轴）

5. 蛋白质结构域拓扑叠加

  1. 确定目标蛋白的功能结构域/特征或翻译后修饰位点的保守氨基酸位置（步骤 1.7）。
    注意：可利用多种资源来鉴定这些结构域。这些资源以及用于鉴定新蛋白质中假定结构域的资源在文献中已有充分综述。20本方案将介绍通过NCBI提供的蛋白质数据库，该数据库应用广泛且功能强大（参见 材料表).
  2. 确定与蛋白质结构域/特征相关的氨基酸位点。
    1. 打开 NCBI 网页。
    2. 在搜索框中输入目标蛋白的NP编号。
    3. 识别已知的蛋白质结构域和特征并进行编目 "特点。"
    4. 识别并记录结构域名称/类型及氨基酸位置。
    5. 选择与该特征对应的链接，以在目标蛋白的初级序列上可视化相应区域。
  3. 创建一个包含结构域/特征边界的列。
    1. 在信噪比列旁边创建一列，以便引用氨基酸位置列（图5A，第C列）。
    2. 确定每个结构域/特征的N端或C端对应的细胞，并在每个细胞中填入1即 如果KCNQ1的S1跨膜结构域的N端位于第122位氨基酸，C端位于第142位氨基酸，则在第122位和第142位氨基酸对应的行中填入1。
    3. 对于重叠的结构域/特征，通过将数字1更改为其他数值来显示多个结构域（即 1.5、2、2.5）；这有助于区分不同区域。
  4. 创建一个以这些边界作为 Y 轴、氨基酸位置作为 X 轴的图形（图5B).
  5. 将此图与步骤 4.4 中生成的信噪比图叠加。
  6. 识别已知蛋白质结构域/特征与信噪比分析之间的相关性。

6. 变异位点叠加

  1. 绘制各个变异位点的位置，以叠加步骤 4.4 和 5.4 中生成的图形。
    1. 在结构域/特征列旁创建一列，使该列中的每一行对应一个氨基酸位置（图 5A，D 列）。
    2. 在新增列中，对应于含有特定变异位点的位置的每个单元格中填入数字 1。
    3. 以该列为 Y 轴，氨基酸位置为 X 轴，绘制图形（图 5C）。
  2. 将此图形与步骤 4.4 中生成的信噪比图以及步骤 5.4 中生成的结构域图进行叠加。

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结果

KCNQ1 基因的氨基酸水平信噪比分析代表性结果如图6所示。本示例展示了在 GnomAD 队列（对照队列）中发现的罕见变异、偶然发现的全外显子组测序（WES）变异（实验队列#1），以及被认为可能与疾病相关的长QT综合征（LQTS）病例相关变异（实验队列#2）。此外，还展示了将 WES 队列和 LQTS 队列的变异频率相对于 GnomAD 队列变异频率进行归一化后的信噪比分析结果。与 LQTS 相关的变异在对应离子通道孔道区、选择性滤过区以及 KCNE1 结合区的结构域中表现出较高的信噪比。相比之下，WES 队列中偶然发现的变异并未明显表现出特定区域的信噪比显著升高，提示这些变异可能反映了背景遗传变异。本示例未如上所述使用变异的次要等位基因频率（MAF）；然而，其仍体现了前述所有相同原理。

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讨论

在过去的十年中，高通量基因检测在应用范围和可及性方面取得了显著进展。然而，对于许多遗传基础明确的疾病（如心肌病），扩大检测范围并未提高诊断检出率21。此外，许多已发现变异的诊断价值仍存在显著不确定性。这部分是由于全外显子组测序（WES）和全基因组测序（WGS）中偶然发现的罕见变异数量不断增加，可能导致误诊22。基于氨基酸水平的信噪比分析方法，建立在已广泛认可的变异致病性预测策略基础上，其优势在于可利用大规模人群基因组研究数据，进一步优化对变异的解读。

因此，该方案中最关键的步骤之一是对照组和实验组队列的选择。目前许多公开的大型基因组研究可通过综合数据库（如 GnomAD）获取，这些数据库可为本方案提供具有代表性的对照队列，其样本量目前最多可达 138,632 人。尽管这些综合队列中的所有受试者并非显然健康，但在罕见病研究背景下，庞大的样本量使该资源极具价值，并允许设定严格的次要等位基因频率（MAF）排除阈值。排除常见变异是必要的，因为它们不太可能导致高外显率的孟德尔遗传病。根据以往研究，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

APL 受美国国立卫生研究院 K08-HL136839 项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1000基因组计划N/Awww.internationalgenome.org
ClinVarN/Awww.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar
Ensembl基因组浏览器N/Auswest.ensembl.org/index.html
ExcelMicrosoftoffice.microsoft.com/excel/用于所有示例公式和函数
外显子聚合联盟 N/Awww.exac.broadinstitute.org
基因组聚合数据库 N/Awww.gnomad.broadinstitute.org
美国国家生物技术信息中心结构域与结构数据库N/Awww.ncbi.nlm.nih.gov/guide/domains-structures/
美国国家生物技术信息中心基因数据库N/Awww.ncbi.nlm.nih.gov/gene/
美国国家生物技术信息中心蛋白质数据库N/Awww.ncbi.nlm.nih.gov/protein/
美国国家心肺血液研究所GO外显子组测序项目N/Awww.evs.gs.washington.edu/EVS/
SnapGeneGSL Biotech LCCwww.snapgene.com
加州大学圣克鲁兹分校人类基因组浏览器N/Awww.genome.ucsc.edu

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