利用顶空气体挥发物收集技术快速采集花卉香味挥发物用于气相色谱-质谱热脱附分析

摘要

本文介绍了一种利用非破坏性采样方法收集开花植物花香挥发物的实验方案。

摘要

已对多个科的花卉香味进行采样，并分析其挥发性成分。了解构成香味的化合物可能对濒危或受威胁花卉的保护具有重要意义。由于花香在吸引传粉者方面至关重要，该方法可用于更深入地理解甚至增强传粉过程。本文介绍了一种使用便携式活性炭空气过滤器和真空泵收集花香挥发物的实验方案，随后通过气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）进行分析。采用该方法，可利用易于携带的设备以非破坏性方式采集花香挥发物。该方法采样过程快速，将采样时间从2至3小时缩短至约10分钟。通过GC-MS分析，可根据标准品对香味化合物进行逐一鉴定。本文详细展示了从材料准备到数据采集输出的整个流程，包括香味采集及对照数据获取的各个步骤。

引言

花朵通常会产生用于吸引传粉者的香味。这些香味由多种化学化合物组成，共同形成一种花香混合物^1,2,3。如果没有这些香味，花朵通过传粉者传递其遗传信息的可能性将大大降低。许多开花植物科中均有花香的记录，其中兰科（Orchidaceae）是研究较多的常见科之一⁴。为了理解花香在传粉过程中的作用，重要的是在花朵开放的数天至数周期间，于一天中不同时间无损地收集并分析花朵释放的化学化合物，因为花香会随时间而变化⁵。

Heath 和 Manukian⁶最早为此类采样开发了一种实验方案。他们采样方法的目标是减少对被研究样本（如植物、昆虫）造成的应激。早期的研究表明，需要对植物进行破坏性操作，例如摘除正在开花的花朵，以收集其香味物质。近期，Cancino 和 Damon^7,8发表的关于花香的研究采用了类似的方法。该研究将花朵置于玻璃密闭室中，并使纯净空气流经其表面；随后，密闭室中的香味化合物被吸附到透明的巴斯德移液管内的多孔聚合物吸附剂上。在该研究中，香味采集时间至少持续两小时。Sadler 等人⁹在佛罗里达南部对一种附生兰科植物进行了花香研究，方法与早期研究¹⁰相似。同样，该研究也需要对花朵采样超过两小时，以收集挥发性香味成分，并将香味物质吸附至多孔聚合物吸附剂上。本文所介绍的是一种非破坏性方法，可实现更快速的采样，仅需10分钟。此外，本方法不再使用玻璃密闭室，而是采用烘烤袋作为密闭容器，这种袋子更便于灵活移动，且降低了对花朵造成损伤的风险。这些烘烤袋有多种尺寸可供选择，可根据样品大小灵活选用，确保样品及周围材料不会受损。本研究使用的吸附剂为 Tenax 多孔聚合物吸附剂。该吸附剂与 Porapak 不同之处在于，样品可通过热脱附直接进入气相色谱-质谱（GC-MS）分析柱，从而避免使用化学溶剂。

本研究中的方法提供了一种快速采集花朵释放的芳香挥发物的方式，也可用于采集其他样本的挥发物，例如昆虫信息素或蘑菇挥发物。由于采样时间缩短，样本所受的胁迫更小，且可在短时间内采集大量样品。例如，在Sadler等人的研究⁹中，花朵仅在夜间散发香味，因此每晚只能采集两到三个样品。而采用本文所述方法，可对同一朵花在整个夜间以15至20分钟为间隔连续采样。此外，通过使用采样袋而非玻璃采样室，更便于在野外对濒危或受威胁植物物种进行原位采样时悬置顶空挥发物。利用本方法，我们成功采集了距地面1.5至2米高的花朵样品。这些方法在实验室和野外的芳香物采集工作中均具有极高实用性，为研究人员提供了一种快速且对样本无损的采样技术。

方案

注意：在进行这些操作的任何过程中，均不得使用香水、有香味的润肤露或其他有香味的产品。

1. 花朵选择

注意：所使用的花朵可以是自然环境中生长的，也可以是在人工环境条件下培养的。采集时的温度、湿度和光照水平可能因所用的具体花卉种类以及所收集的数据类型而异。例如，为确定花香是否随一天中的时间变化，已针对同一种花卉在白天和夜间均进行了数据采集，并且数据既来自原位生长的花卉，也来自温室中栽培的花卉。

1. 选择一个初始未开放的花朵，以标准化样品采集时间。这可以控制花朵随时间变化而产生的香味改变。
2. 根据开花持续时间，如果可能，在开花后至少等待24小时再采集样品，为所有样品设定统一的采集时间。
3. 如果一株植物上有多个开花的花朵，用标记带或类似物品标记将要使用的花朵，以确保对同一朵花进行重复取样。

2. 材料准备

1. 使用烤箱袋（约 40.5 cm × 44.5 cm）和波纹状 PTFE 管。
2. 首先将烤箱袋在水中煮沸约 30 分钟，以去除残留的塑料化合物。干燥时，在 175 °C 的烤箱中烘烤。
3. 烤箱袋干燥后，在烤箱袋封闭端的每个角落安装一个聚丙烯贯通接头。这些接头可用于连接管道，以将经活性炭过滤的空气通入，并将顶空中的香气抽出。
4. 用 75% 乙醇冲洗所有袋子和管道。冲洗后，让其自然风干。
5. 烤箱袋干燥后，将袋子和管道在低温烤箱中（约 74–85 °C）烘烤 30 分钟。

3. 挥发性物质采集

注意：整个过程中需佩戴无菌氯丁橡胶手套，因为接触滤袋或滤筒可能会污染样品。

1. 用一个经过烘烤的烤箱袋覆盖选定的花朵。在花朵下方用塑料扎带将袋子紧紧收拢，以防止外部空气进入袋内。
2. 将采集设备的出气管连接到烤箱袋上的一个贯通接头上。
3. 在另一个贯通接头上安装一个装有多孔聚合物吸附剂的玻璃过滤 cartridge（滤筒）。
4. 将第二根管子连接到采集设备的真空进气口，并将该管子的另一端连接到玻璃挥发物收集滤筒上。
5. 同时开启空气泵和真空泵，流速设定为约 0.05 L/min。此时花周围的顶空会充满空气，但不会过度膨胀。系统将通过滤筒从袋内抽气，从而捕获花朵释放的挥发性物质。
6. 让设备运行 10 分钟后，关闭空气泵和真空泵。
   注意：对于释放香味较少的花卉种类，可能需要延长采样时间。
7. 拆下管路和玻璃滤筒，将滤筒放入带螺旋盖的玻璃小瓶中。盖紧瓶盖后，再用聚四氟乙烯（PTFE）生料带密封瓶口。
8. 将样品储存于冷冻环境中，直至使用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）进行分析。
9. 使用新的干净烤箱袋和玻璃滤筒重复上述过程，但此次使用空袋进行采样，以获取空白空气样本作为对照。这有助于识别可能存在的背景挥发性物质。
   注意：重复采样应在每天大致相同的时间进行，因为某些花卉在一天中不同时间释放的香味量可能存在变化。

4. 气相色谱-质谱联用（GC-MS）

1. 从冷冻柜中取出玻璃滤芯，并将其放入气相色谱-质谱联用仪的进样口。
2. 在氦气流（流速：1.2 mL/min）中，将热捕集阱（TCT）加热至220 °C并维持8分钟，释放多孔聚合物吸附剂上收集的顶空挥发物。
3. 在 -130 °C 下使用 TCT 冷阱装置收集解吸的化合物。冷阱温度由 GC-MS 程序控制。
4. 将TCT冷阱装置闪热，以将化合物注入与其连接的气相色谱仪毛细管柱。TCT方法起始于-20 °C，终止于150 °C。
5. 将气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）程序设置为：从40 °C以15 °C/min的速率升至280 °C，并在40 °C保持5 min。

5. 数据分析

1. 进行鉴定时，将样品的质谱图与质谱图数据库（NIST 和瑞典哥德堡大学化学生态学系¹¹）中的图谱进行比对，同时比对挥发性物质的保留时间与标准品化合物的保留时间¹²。
2. 比对所收集挥发性物质的色谱图，以识别共同且重复出现的峰。
3. 在确定主要挥发性成分后，利用 Pherobase（信息化学物质与信息素的在线数据库）查询这些成分是否已在花香成分中被报道过¹⁰。

结果

GC-MS 的代表性数据以色谱图形式展示于图1中。除了色谱图外，还提供了一份结果数据文件（补充文件1）。该数据文件列出了每个峰的保留时间（RT）以及对应化合物的鉴定信息（数据库/ID）。保留时间在10:00至15:00分钟之间的峰为花香挥发物，这是基于这些化合物的分子量所确定的¹⁰。峰上方的数字表示已鉴定化合物的保留时间，这些信息可在结果数据文件中查到（补充文件1）。通过获取每种香料样品的色谱图和数据文件，可以对化合物进行比较，并识别出在各个花朵样品中重复出现的成分。本文件中的“样品”类别可用于识别采集样本，其命名方式用于表示所采集的花朵种类以及采集的时间和日期（例如：UF1 8AM 03/16/15）。该文件的第1页还列出了从样品中鉴定出的具体化合物（数据库ID）、其在图1中对应的峰保留时间（峰号#）以及每种挥发物占总香料成分的百分比（峰面积%）。在“数据库/ID”下列出的所有收集到的挥发物均可在Phe...

讨论

尽管该技术因其采样速度快和便携性强而具有极高的应用价值，但其局限性之一在于对附生植物物种的应用，即那些生长在树木上而非地面上的植物。在原始研究¹⁰中，所采集的其中一朵花即为附生植物。由于仪器过重而无法自由悬挂，因此必须搭建一个稳定的高处平台用于采样。此外，该仪器既可插入电源插座供电，也可由电池供电；因此，若需进行长时间的野外采样，则必须配备电源，以便在仪器不使用时为电池充电。

本方法可实现原位、非破坏性取样，能够快速重复取样，且采样时间显著缩短。尽管一些花卉香味研究需要对单个样品采集2至3小时的香味物质，但由于采用了玻璃滤芯中的多孔聚合物吸附剂作为采集材料，本方法可在约10分钟内准确收集挥发性成分。

这些采集方法可快速、安全地获取花朵释放的香气，且不会破坏或伤害花朵。由于许多花卉，尤其是兰科（Orchidaceae）植物，被列为受威胁或濒危物种，因此在研究其传粉生物学时，以非破坏性方式分析其释放的香气至关重要。这些研究获得的信息未来可能用于开发基于关键吸引性化学...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
隔舱接头	Cole-Palmer	UX-06390-10
FEP 管	Cole-Palmer	UX-06407-60
气相色谱仪	Hewlett Packard	6890
硅烷化玻璃棉	Sigma-Aldrich	20411
进样口衬管	Agilent	5062-3587
质谱仪	Hewlett Packard	5973
Reynolds 烤箱袋	Reynolds Consumer Products	火鸡尺寸
Tenax 多孔聚合物吸附剂	Sigma-Aldrich	11982