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方法文章

基于湿法纺丝的明胶组织再生成型工艺

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DOI：

10.3791/58932

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2019年3月7日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Materials Science and Engineering, National Taiwan University of Science and Technology, 2Laboratory of Adult Stem Cell and Tissue Regeneration, National Defense Medical Center, 3School of Dentistry, National Yang-Ming University, 4Department and Graduate Institute of Biology and Anatomy, National Defense Medical Center, 5Department of Gerontological Health Care, National Taipei University of Nursing and Health Sciences, 6Division of Rheumatology/Immunology/Allergy, Department of Internal Medicine, Tri-Service General Hospital, National Defense Medical Center, 7Department of Physiology and Biophysics, Graduate Institute of Physiology, National Defense Medical Center, 8Division of Urology, Department of Surgery, Tri-Service General Hospital, National Defense Medical Center

本文内容

摘要

我们开发并描述了一种基于湿法纺丝概念的实验方案，用于构建以明胶为基础的生物材料，以应用于组织工程领域。

摘要

本文介绍了一种低成本的方法，可将明胶（一种天然聚合物）加工成单丝纤维或其他适宜的形态。通过湿法纺丝技术，将明胶在合适的凝固浴中平稳挤出，从而制备出明胶纤维。为了增加这些明胶纤维的功能性表面积，并增强其模拟组织特征的能力，可借鉴此概念将明胶塑造成管状结构。体外和体内实验结果表明，明胶管在组织工程应用中展现出巨大潜力。作为一种理想的填充缺损材料，明胶管可用于替代受损区域的组织（例如神经系统或心血管系统），并通过直接替代干细胞和神经回路来促进组织再生。本实验方案详细阐述了基于天然聚合物的生物材料的制备流程，其推广应用有望显著推动相关天然聚合物材料的发展，助力实现组织再生策略。

引言

组织再生领域的最新进展涉及组织工程的应用，这对改进医学治疗中的新治疗策略提出了挑战。例如，神经系统在损伤或疾病后再生能力有限，已成为全球重大的健康问题。由于与神经系统相关的病理生理过程十分复杂，传统自体移植或稳定手术虽然已被证明可在功能结局上带来一定益处，但脊柱固定手术的效果尚无强有力的证据支持1,2。损伤区域的组织会丧失，并被增生性诱导的星形胶质细胞所取代3，最终形成致密的胶质瘢痕4,5。这种基质会形成一种阻碍神经功能恢复的屏障6,7，从而严重阻碍再生过程。因此，人们期望采用一种合适的填充材料来防止组织丧失，并通过维持损伤区域的完整性，以及直接替代神经细胞和神经回路以促进轴突再生，从而减少与瘢痕相关的结缔组织形成。

基于对细胞或轴突行为以及组织再生过程的调控，聚合物生物材料因其能够提供天然细胞外基质（ECM）支持，已被广泛用作组织再生治疗中的支架材料。由于具有一维结构，纤维形式通常被视为多种材料的基本构建单元8。纤维通常可通过熔融挤出或湿法纺丝方法获得；然而，这些方法所用设备体积大、成本高，且操作难度较大，存在诸多挑战。此外，目前大多数关于聚合物纤维的研究主要集中在合成材料或复合材料上。作为生物材料来源，天然聚合物对人体具有更优的生物相容性。然而，与合成聚合物相比，实现天然聚合物纤维的取向排列相对更为困难9。因此，将富含蛋白质的天然聚合物转化为生物材料纤维成为一种重要策略——不仅可以直接从原材料中分离获得生物材料纤维，避免不必要的单体转化过程，而且所得蛋白质纤维还具有良好的形貌和理想的性能特征10。

在此基础上，我们介绍一种低成本的加工方法，通过湿法纺丝的基本原理来制备天然聚合物纤维，该方法可在实验室规模下用于组织工程。湿法纺丝是通过将聚合物溶液挤出并凝固于合适的非溶剂中实现的。当适当浓度的黏稠溶液进入凝固浴时，聚合物分子发生相分离。在此相变过程中，纤维丝失去溶解性，并以固态聚合物相的形式析出11。基于此原理，我们进一步通过模塑工艺将明胶扩展为管状结构，该结构被认为适用于组织再生应用。此外，从本质上讲，我们还可利用明胶纤维制备任意形状的材料（例如，由多根明胶纤维卷绕而成的明胶导管），以满足其他特定应用需求。

明胶是一种由变性且水解的胶原蛋白形成的可生物降解天然聚合物，包括胶原蛋白的任何半结晶态、非晶态或三重螺旋结构12众所周知，胶原蛋白是脊椎动物和无脊椎动物所有结缔组织中的基本结构蛋白13,14，其蛋白质结构类似于主要细胞外基质（ECM）中促进神经生长的成分，同时能够替代脊髓损伤过程中大量分泌的糖胺聚糖。因此，明胶作为来源在任何医用载体中都是极佳的选择。除了成本低廉外，明胶还具有可生物降解性、细胞相容性，并已在临床上被证实可作为临时性缺损填充材料15形成管状, 本文所述的体外和体内实验表明，明胶具有优异的生物相容性，适用于未来的组织工程应用。将人脂肪源性干细胞在明胶管中培养，可通过巢蛋白（nestin）阳性染色作为神经细胞标志物，促进细胞向神经前体细胞分化。此外，本研究所建立方法制备的明胶作为填充缺损材料，预期具有良好的可操作性和安全性，将极大有益于正在开发相关天然聚合物以增强组织再生策略的组织工程研究人员。 关键词：明胶，生物相容性，组织工程，人脂肪源性干细胞，神经前体细胞，巢蛋白，体外实验，体内实验

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方案

脂肪组织来自经台北中国台湾三军总医院机构审查委员会认证的骨科手术。涉及动物实验的操作已获得中国台湾国防医学院动物护理委员会的批准。

1. 湿法纺丝过程

  1. 溶液制备
    1. 将5 g明胶粉末溶于100 mL双蒸水中，得到5% (w/v) 的溶液浓度。
    2. 在60–70 °C下缓慢搅拌混合物过夜，以获得完全均匀且无气泡的分散液。
  2. 湿法纺丝
    1. 纤维成型
      注意：该方法的示意图见图1A。纺丝装置配备有蠕动泵（见材料表），可提供高精度转速，控制溶液平稳输送。
      1. 将一支26 G × 1/2 英寸（0.45 mm × 12 mm）的注射器作为溶液注入器连接至透明乙烯基管路。
      2. 在玻璃烧杯中准备100 mL 99.5%的丙酮溶液，用作凝固浴。
      3. 以21 rpm（3.25 mL/min）运行蠕动泵，使明胶溶液在丙酮溶液中停留数秒后卷绕收集。
      4. 将明胶纤维从丙酮溶液中取出，浸入2.5% (w/v) 的聚己内酯/二氯甲烷（PCL/DCM）溶液中（质量比1:20）。
      5. 将含明胶纤维的PCL/DCM溶液置于通风橱中室温下过夜干燥。
    2. 管状结构成型
      注意：该方法的示意图见图1B。
      1. 使用24 G × 3/4 英寸（0.7 mm × 19 mm）的外周静脉导管作为管状模具。
      2. 将导管浸入明胶溶液中，保持3秒。
      3. 将导管浸入丙酮溶液中，保持1分钟。
      4. 再次将导管浸入明胶溶液中，保持3秒。
      5. 重复上述交替步骤20次。
      6. 将导管从丙酮溶液中取出，使成型的管状物在室温下干燥5分钟。
      7. 使用止血钳轻轻将明胶管从导管上剥离，并小心转移至含有2.5% (w/v) PCL/DCM溶液的玻璃巴斯德吸管中。
      8. 将含有明胶管和PCL/DCM溶液的巴斯德吸管置于通风橱中室温下过夜干燥。

2. 明胶管的形态学

  1. 将干燥的明胶管片段固定在碳载台上。
  2. 将样品放入离子溅射镀膜仪（见材料表）中，以金镀膜60秒；然后通过扫描电子显微镜观察其形态（见材料表）。

3. 人脂肪干细胞的培养

  1. 将临床手术获取的脂肪组织置于含有10 mL转移溶液的培养皿中，转移溶液由0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）、1%青霉素/链霉素和0.1%葡萄糖组成。
  2. 用手术刀片将组织切成小块（小于1 mm2）。
  3. 将组织转移至15 mL塑料离心管中，在500 × g 条件下离心5分钟。
  4. 弃去上清液，将沉淀物置于含有10 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM，含4 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠和15 mg/L酚红）的塑料管中，加入0.1%胶原酶，在37 °C、含95%空气和5% CO2的湿润环境中孵育1天。
  5. 在500 × g 条件下离心塑料管5分钟，小心弃去上清液（勿扰动沉淀物），然后轻轻加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基10 mL重悬沉淀物，并在37 °C、含95%空气和5% CO2的湿润环境中静置1天。
  6. 在500 × g 条件下离心塑料管5分钟，小心弃去上清液；然后加入1 mL干细胞培养基（由角质形成细胞无血清培养基（K-SFM）、5% FBS、N-乙酰-L-半胱氨酸、抗坏血酸-2-磷酸、链霉素和两性霉素组成）重悬沉淀物，将其转移至含有4 mL干细胞培养基的T25培养瓶中，在37 °C、含95%空气和5% CO2的湿润环境中静置3天。
  7. 弃去上清液，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），在37 °C、含95%空气和5% CO2的湿润环境中孵育3.5分钟，使细胞从培养瓶底部脱落。
  8. 加入1 mL FBS，混悬细胞，然后转移至微量离心管中。
  9. 在500 × g 条件下离心悬液3.5分钟，用1 mL干细胞培养基重悬沉淀物，并转移至含有5 mL干细胞培养基的培养瓶中；随后在37 °C、含95%空气和5% CO2的湿润环境中继续培养。
  10. 每3天更换一次干细胞培养基，维持继代培养。

4. 明胶管上细胞的培养

  1. 用紫外光对明胶管灭菌 2 小时；然后将其浸入 75% (v/v) 乙醇中，并用干细胞培养基洗涤 2 次，以去除残留的乙醇。
  2. 从培养瓶中收集人脂肪源性干细胞（hASCs）。
    1. 移除培养瓶中的培养基。
    2. 加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C、含 95% 空气和 5% CO2 的湿润环境中孵育 3.5 分钟，使 hASCs 从培养瓶底部脱落。
    3. 加入 1 mL 胎牛血清（FBS），混悬细胞，转移至微量离心管中。
    4. 将微量离心管在 500 × g 条件下离心 3.5 分钟；小心弃去上清液，用 1 mL 干细胞培养基重悬沉淀。
  3. 将明胶管置于含有 3 mL 干细胞培养基的 6 孔板中，在管内接种 4 × 104 个 hASCs；于 37 °C、含 95% 空气和 5% CO2 的湿润环境中培养 2 周。
  4. 每 3 天更换一次干细胞培养基，为细胞生长提供充足的营养。

5. 免疫细胞化学

  1. 移除干细胞培养基，并用 PBS 洗涤孔板。
  2. 用 0.1% 冰醋酸固定细胞，室温孵育 30 分钟。
  3. 用 PBS 洗涤孔板 2 次。
  4. 加入去垢剂（NP-40，0.05%），室温孵育 10 分钟。
  5. 用 PBS 洗涤孔板 3 次。
  6. 加入 2% 正常山羊血清，室温孵育 30 分钟。
  7. 倾去溶液，加入一抗 nestin（神经前体细胞标志物），4 °C 过夜孵育。
  8. 用 PBS 洗涤孔板 3 次。
  9. 加入二抗驴抗小鼠-异硫氰酸荧光素（FITC），避光孵育 2 小时。
  10. 用 PBS 洗涤孔板 3 次。
  11. 加入 1 mL Hoechst 33342 染色细胞核，室温孵育 10 分钟。
  12. 轻轻洗涤孔板，并在荧光显微镜下观察。

6. 体内生物相容性测试

注意：已使用本方案成功测试体重在 201 - 225 g 之间的大鼠。

  1. 麻醉
    1. 诱导并维持麻醉；建议使用大鼠（8周龄雌性Sprague Dawley大鼠）进行麻醉 通过 肌肉注射替来他明和唑拉西泮（分别为25 mg/kg + 25 mg/kg）以及赛拉嗪（5 mg/kg）。通过按压大鼠脚趾进行疼痛刺激试验，以确认麻醉效果。
  2. 手术部位的消毒
    1. 剃除大鼠斜方肌区域（颈部背部）的毛发，清洁皮肤，并用聚维酮碘溶液（100 mg/mL）擦拭，以达到皮肤的无菌准备条件。
    2. 用无菌手术巾覆盖大鼠，以减少细菌传播及手术部位的后续污染。
  3. 明胶管的植入
    1. 用手术剪轻轻剪开大鼠斜方肌区域的皮肤。
    2. 制造一个2 cm的伤口，将明胶管直接放置在筋膜与肌肉之间的层面上。
  4. 植入后手术
    1. 用尼龙缝线缝合伤口，并以聚维酮碘溶液（100 mg/mL）擦拭。
    2. 通过肌肉注射给予大鼠酮洛芬（2.5 mg/kg）和头孢唑林（15 mg/kg）进行诱导。
    3. 将大鼠置于无菌条件下饲养7天。
  5. 安乐死
    1. 大鼠通过 CO2 根据美国兽医协会（AVMA）安乐死指南实施窒息处死。通过脚趾和尾部夹捏确认大鼠无反应，随后触碰胸部以确认心跳停止。
    2. 用手术刀轻轻切开大鼠，取出植入的组织，并拍照以供观察。

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结果

本研究中，我们通过简便的湿法纺丝方法成功将明胶制备成纤维（图2A）和管状结构（图2B,C）。这些基于明胶的材料可根据其形状用作各种医疗工具。鉴于此类材料的功能表面和结构框架更适用于组织再生，我们通过体外和体内实验评估了明胶管的生物相容性。

为了获得明胶管的整体形貌，首先我们通过扫描电子显微镜进行了形态学观察（图3）。结果显示，明胶管的表面并不十分光滑（图3A），其内径超过200 µm（图3B），管壁厚度约为20 µm（

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讨论

我们介绍了一种利用简单湿法纺丝技术制备明胶基生物材料的方法，该技术可用于天然聚合物在组织再生研究中的应用。本工作展示了仅以明胶作为优质蛋白质来源进行材料制备的可能性，旨在优化明胶自身的性能。明胶基生物材料的开发全过程均在室温（22 - 26 °C）下完成。温和的溶液配制是该方案中的关键步骤，必须精确控制溶液浓度，并轻柔搅拌以避免产生气泡。若溶液中出现气泡，尤其是在装入注射器后，将会影响明胶在凝固介质中的形态。

通过将明胶溶液在合适的凝固介质中发生相变，可获得基于明胶的生物材料，该过程可导致聚合物分子脱溶剂化，并使明胶溶液沉淀为固态聚合物相11。基于湿法纺丝方法的这一基本原理，我们利用模具工艺将明胶塑造成管状结构，以增加其表面功能并模拟人体组织的特征。在此过程中，精确控制加载、保持和重复操作的时间对于形成准确的管状结构至关重要。本方案中，由于管状结构从底部到顶部的相变过程存在不同步性，因此无法控制其形状的均一性。此外，由于该材料含有蛋白质成分，其保存和灭菌方法也受到限制。

通过体外...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由台湾地区国防部门（MAB-105-070；MAB-106-077；MAB-107-032；MAB-107-065）、科技部门（MOST 107-2320-B016-016）、三军总医院、中国台湾国防医学院（TSGH-C106-046；TSGH-C106-115；TSGH-C107-041）以及振兴医院与中国台湾国防医学院合作项目（CH-NDMC-107-8）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
溶液制备：
明胶B型（猪源）Ferak产品编号 10733500 g 瓶装
湿法纺丝过程：
蠕动泵GilsonModel M312Minipuls*3
塑料管连接器World Precision Instruments140111 盒
注射器斯特里坎5A0625854126Gx1/2"(0.45 x 12 mm)
丙酮Ferak产品编号 000102.5 L 瓶
聚己内酯 CAPA 6500Perstorp24980-41-4-
二氯甲烷 ScharlauCL034210001 L 小瓶
玻璃巴斯德吸管Fisher Scientific13-678-20A-
止血剂Shinetec 仪器ST-B021-
外周静脉导管（Introcan Certo）B. Braun1B0325824124Gx3/4"(0.7 × 19 mm)
明胶管的形态：
离子溅射镀膜仪 日立e1010-
扫描电子显微镜日立S-3000N-
在明胶管上培养细胞：
胰蛋白酶-EDTAGibco488625100 mL 小瓶
胎牛血清Gibco923119500 mL 小瓶
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 Gibco31600-034粉末
角质形成细胞-SFM 培养基Gibco10744-019500 mL 药瓶
T25 培养瓶TPP90025VENT型
6孔板Falcon1209938-
免疫细胞化学：
磷酸盐缓冲液Gibco654471500 mL 小瓶
冰醋酸Ferak产品编号 00697500 mL 药瓶
NP-40 表面活性剂（Tergitol 溶液）Sigma056K0151500 mL 药瓶
正常山羊血清Vector LaboratoriesS-1000-2020 mL 小瓶，浓缩液
Nestin（一抗）Santa Cruz BiotechnologySC-23927-
驴抗小鼠-异硫氰酸荧光素（二抗）Santa Cruz BiotechnologySC-2099-
Hoechst 33342AnaspecAS-832185 mL 小瓶
体内 生物相容性测试：
替来他明+唑拉西泮 VirbacBC915 mL 小瓶
赛拉嗪拜耳韩国KR0322710 mL 小瓶
酮洛芬Astar14062322 mL 小瓶
聚维酮碘溶液EverstarHA1612024 L 桶
头孢唑林中国化学 &药物与制药18P9091 g 小瓶
手术刀片Shinetec 仪器ST-B021-
手术剪Shinetec 仪器ST-B021-

参考文献

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