基于湿法纺丝的明胶组织再生成型工艺

摘要

我们开发并描述了一种基于湿法纺丝概念的实验方案，用于构建以明胶为基础的生物材料，以应用于组织工程领域。

摘要

本文介绍了一种低成本的方法，可将明胶（一种天然聚合物）加工成单丝纤维或其他适宜的形态。通过湿法纺丝技术，将明胶在合适的凝固浴中平稳挤出，从而制备出明胶纤维。为了增加这些明胶纤维的功能性表面积，并增强其模拟组织特征的能力，可借鉴此概念将明胶塑造成管状结构。体外和体内实验结果表明，明胶管在组织工程应用中展现出巨大潜力。作为一种理想的填充缺损材料，明胶管可用于替代受损区域的组织（例如神经系统或心血管系统），并通过直接替代干细胞和神经回路来促进组织再生。本实验方案详细阐述了基于天然聚合物的生物材料的制备流程，其推广应用有望显著推动相关天然聚合物材料的发展，助力实现组织再生策略。

引言

组织再生领域的最新进展涉及组织工程的应用，这对改进医学治疗中的新治疗策略提出了挑战。例如，神经系统在损伤或疾病后再生能力有限，已成为全球重大的健康问题。由于与神经系统相关的病理生理过程十分复杂，传统自体移植或稳定手术虽然已被证明可在功能结局上带来一定益处，但脊柱固定手术的效果尚无强有力的证据支持^1,2。损伤区域的组织会丧失，并被增生性诱导的星形胶质细胞所取代³，最终形成致密的胶质瘢痕^4,5。这种基质会形成一种阻碍神经功能恢复的屏障^6,7，从而严重阻碍再生过程。因此，人们期望采用一种合适的填充材料来防止组织丧失，并通过维持损伤区域的完整性，以及直接替代神经细胞和神经回路以促进轴突再生，从而减少与瘢痕相关的结缔组织形成。

基于对细胞或轴突行为以及组织再生过程的调控，聚合物生物材料因其能够提供天然细胞外基质（ECM）支持，已被广泛用作组织再生治疗中的支架材料。由于具有一维结构，纤维形式通常被视为多种材料的基本构建单元⁸。纤维通常可通过熔融挤....

方案

脂肪组织来自经台北中国台湾三军总医院机构审查委员会认证的骨科手术。涉及动物实验的操作已获得中国台湾国防医学院动物护理委员会的批准。

1. 湿法纺丝过程

1. 溶液制备
   1. 将5 g明胶粉末溶于100 mL双蒸水中，得到5% (w/v) 的溶液浓度。
   2. 在60–70 °C下缓慢搅拌混合物过夜，以获得完全均匀且无气泡的分散液。
2. 湿法纺丝
   1. 纤维成型
      注意：该方法的示意图见图1A。纺丝装置配备有蠕动泵（见材料表），可提供高精度转速，控制溶液平稳输送。
      1. 将一支26 G × 1/2 英寸（0.45 mm × 12 mm）的注射器作为溶液注入器连接至透明乙烯基管路。
      2. 在玻璃烧杯中准备100 mL 99.5%的丙酮溶液，用作凝固浴。
      3. 以21 rpm（3.25 mL/min）运行蠕动泵，使明胶溶液在丙酮溶液中停留数秒后卷绕收集。
      4. 将明胶纤维从丙酮溶液中取出，浸入2.5% (w/v) 的聚己内酯/二氯甲烷（PCL/DCM）溶液中....

结果

本研究中，我们通过简便的湿法纺丝方法成功将明胶制备成纤维（图2A）和管状结构（图2B,C）。这些基于明胶的材料可根据其形状用作各种医疗工具。鉴于此类材料的功能表面和结构框架更适用于组织再生，我们通过体外和体内实验评估了明胶管的生物相容性。

为了获得明胶管的整体形貌，首先我们通过扫描电子显微镜进行了形态学观察（图3）。结果显示，明胶管的表面并不十分光滑（图3A），其内径超过200 µm（图3B），管壁厚度约为20 µm（

讨论

我们介绍了一种利用简单湿法纺丝技术制备明胶基生物材料的方法，该技术可用于天然聚合物在组织再生研究中的应用。本工作展示了仅以明胶作为优质蛋白质来源进行材料制备的可能性，旨在优化明胶自身的性能。明胶基生物材料的开发全过程均在室温（22 - 26 °C）下完成。温和的溶液配制是该方案中的关键步骤，必须精确控制溶液浓度，并轻柔搅拌以避免产生气泡。若溶液中出现气泡，尤其是在装入注射器后，将会影响明胶在凝固介质中的形态。

通过将明胶溶液在合适的凝固介质中发生相变，可获得基于明胶的生物材料，该过程可导致聚合物分子脱溶剂化，并使明胶溶液沉淀为固态聚合物相¹¹。基于湿法纺丝方法的这一基本原理，我们利用模具工艺将明胶塑造成管状结构，以增加其表面功能并模拟人体组织的特征。在此过程中，精确控制加载、保持和重复操作的时间对于形成准确的管状结构至关重要。本方案中，由于管状结构从底部到顶部的相变过程存在不同步性，因此无法控制其形状的均一性。此外，由于该材料含有蛋白质成分，其保存和灭菌方法也受到限制。

通过体外.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
溶液制备：
明胶B型（猪源）	Ferak	产品编号 10733	500 g 瓶装
湿法纺丝过程：
蠕动泵	Gilson	Model M312	Minipuls*3
塑料管连接器	World Precision Instruments	14011	1 盒
注射器	斯特里坎	5A06258541	26Gx1/2"(0.45 x 12 mm)
丙酮	Ferak	产品编号 00010	2.5 L 瓶
聚己内酯 CAPA 6500	Perstorp	24980-41-4	-
二氯甲烷	Scharlau	CL03421000	1 L 小瓶
玻璃巴斯德吸管	Fisher Scientific	13-678-20A	-
止血剂	Shinetec 仪器	ST-B021	-
外周静脉导管（Introcan Certo）	B. Braun	1B03258241	24Gx3/4"(0.7 × 19 mm)
明胶管的形态：
离子溅射镀膜仪	日立	e1010	-
扫描电子显微镜	日立	S-3000N	-
在明胶管上培养细胞：
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	488625	100 mL 小瓶
胎牛血清	Gibco	923119	500 mL 小瓶
Dulbecco 改良 Eagle 培养基	Gibco	31600-034	粉末
角质形成细胞-SFM 培养基	Gibco	10744-019	500 mL 药瓶
T25 培养瓶	TPP	90025	VENT型
6孔板	Falcon	1209938	-
免疫细胞化学：
磷酸盐缓冲液	Gibco	654471	500 mL 小瓶
冰醋酸	Ferak	产品编号 00697	500 mL 药瓶
NP-40 表面活性剂（Tergitol 溶液）	Sigma	056K0151	500 mL 药瓶
正常山羊血清	Vector Laboratories	S-1000-20	20 mL 小瓶，浓缩液
Nestin（一抗）	Santa Cruz Biotechnology	SC-23927	-
驴抗小鼠-异硫氰酸荧光素（二抗）	Santa Cruz Biotechnology	SC-2099	-
Hoechst 33342	Anaspec	AS-83218	5 mL 小瓶
体内 生物相容性测试：
替来他明+唑拉西泮	Virbac	BC91	5 mL 小瓶
赛拉嗪	拜耳韩国	KR03227	10 mL 小瓶
酮洛芬	Astar	1406232	2 mL 小瓶
聚维酮碘溶液	Everstar	HA161202	4 L 桶
头孢唑林	中国化学 &药物与制药	18P909	1 g 小瓶
手术刀片	Shinetec 仪器	ST-B021	-
手术剪	Shinetec 仪器	ST-B021	-