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方法文章

使用免疫荧光法量化小鼠脑内突触蛋白的异质性分布

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DOI：

10.3791/58940

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2019年1月29日

 ,  , 
1Institute of Anatomy and Embryology, University Medical Center Göttingen

本文内容

摘要

本文介绍了一种定量分析方法，通过免疫荧光染色、共聚焦显微镜和计算机辅助分析，确定突触蛋白相对于标记蛋白的分布情况。

摘要

特定突触蛋白的存在、缺失或表达水平可显著影响突触传递。除了阐明某种蛋白的功能外，确定其分布情况也至关重要。本文介绍了一种结合免疫荧光、共聚焦显微镜和计算机分析的方法，用于确定突触蛋白Mover（也称为TPRGL或SVAP30）的分布。我们将Mover的分布与突触小泡蛋白突触素（synaptophysin）的分布进行比较，从而以突触小泡丰度为参照，定量地分析Mover的分布特征。值得注意的是，该方法可用于不同抗体、不同显微镜或跨研究之间蛋白分布的比较。本方法通过提供比值而非绝对荧光强度，规避了免疫荧光染色固有的变异性。此外，该方法使研究人员能够在多个层次上分析蛋白的分布：从整个脑切片，到脑区，再到单个脑区内的不同亚区，例如海马或感觉皮层的不同层次。Mover是一种与突触小泡相关的脊椎动物特异性蛋白。利用该方法，我们发现Mover在不同脑区之间呈异质性分布，在腹侧苍白球、隔核和杏仁核中表达水平较高；同时在单个脑区内也呈异质分布，例如海马的不同层次。

引言

神经元之间的通信发生在称为突触的特化接触位点。突触中含有大量不同的蛋白质，这些蛋白质协调突触传递过程。其中一些蛋白质在神经系统中的分布具有异质性，并非存在于每一个突触中1。Munc13 就是这样一个蛋白质的例子，它参与突触囊泡的启动过程。Munc13 存在多种亚型，这些亚型在脑内呈异质性分布2，特定亚型的存在或缺失可影响短时程突触可塑性和突触囊泡动力学3,4,5。因此，能够识别不同脑区中各类突触蛋白的存在情况至关重要。

目前用于突触蛋白定量的首选方法是质谱法和蛋白质印迹法，而非免疫组织化学法6,7,8,9在某些情况下，会联合使用多种方法，以相互补充，评估特定蛋白质的含量及其定位即，Wilhelm 等10）。本文所述方法无需采用任何生物化学手段，仅通过免疫荧光染色即可实现目标蛋白的定位与定量。另一优势在于，该方法可用于比其他方法更小且因而更具特异性的区域进行定量分析。然而需要注意的是，为评估目标蛋白的分布情况，必须选用一种可靠的参照蛋白。

通过免疫组织化学进行荧光染色，可使我们常规性地鉴定蛋白质在脑区之间以及不同神经元区室内的定位。为了区分不同的区室，需使用特异性标记物。通常，抗突触素（synapsin）和抗突触素蛋白（synaptophysin）11抗体可用于标记突触小泡，而抗巴松蛋白（bassoon）抗体则可标记突触前终末的活性区12。囊泡转运体，如囊泡型谷氨酸转运体（vGluT）或囊泡型γ-氨基丁酸转运体（vGAT），分别用于标记兴奋性13和抑制性14突触前终末。在突触后侧，可使用抗Homer蛋白抗体标记突触后终末，而抗突触后密度蛋白95（PSD95）15,16,17或抗gephyrin18,19,20抗体则分别用于标记兴奋性或抑制性突触后终末。通过使用针对目标蛋白的抗体以及上述类型的标记物，可确定该蛋白的定位。迄今为止，许多研究均以定性方式完成此类分析21。然而，要可靠地确定某一特定突触蛋白的差异性分布，不仅需要判断其存在与否，还需评估其相对浓度。由于突触在大小和密度上的异质性，建立突触标记物与目标蛋白之间的比值显得尤为重要。否则，突触密集区域（如海马的非锥体细胞层和小脑的分子层）将表现出较高的突触蛋白密度，但这仅是由于突触数量较多所致，而非每个突触中该蛋白的表达水平较强（例如，Wallrafen 和 Dresbach1）。另一方面，神经元胞体中的蛋白（例如，TGN3822）通常在海马锥体细胞层或海马及小脑颗粒细胞层中呈现强信号，这是由于这些区域神经元胞体高度集中所致。因此，此类结构（此处指突触）分布的非均一性可能导致对目标蛋白自身分布的错误估计。此外，免疫组织化学染色中不同样本间的染色强度存在内在变异性。本文所述方案充分考虑了这一因素，避免了此类偏差以及其他源于免疫组织化学方法的技术陷阱。

在我们最近的研究中，我们采用该方法描述了Mover（也称为TPRGL23或SVAP3024）在16个不同脑区中的差异性表达1。Mover是一种脊椎动物特有的突触蛋白，可与突触小泡相关联，并影响神经递质的释放25,26,27。我们通过染色突触小泡标志物突触素（synaptophysin），将Mover的表达水平与突触小泡的丰度进行了关联分析。我们发现，Mover在隔核、腹侧苍白体和杏仁核中表达水平较高。在海马结构内，Mover呈现异质性分布，其中与海马内部信息计算相关的层表达水平较高，而输入层和输出层则表达水平较低。

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方案

本方案不涉及对活体动物进行的实验。为获取脑组织样本而实施安乐死的动物实验已获得当地动物保护机构（哥廷根大学医学中心动物保护委员会）的批准，批准编号为 T 10/30。

注意：本实验方案使用了3只成年雄性C57BL/6小鼠。

1. 样品制备

  1. 配制固定液和 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB；见表 1）。
  2. 按照 Gage 等人28所述方法进行经心脏灌注固定。首先用 0.9% NaCl 溶液冲洗血液，然后用 30 mL 4% 多聚甲醛（PFA）进行灌注。
  3. 用剪刀打开颅骨，使用钝边勺子小心分离脑组织，避免损伤组织。
  4. 将 50 mL 离心管中装满固定液，将脑组织置于 4% PFA 中，在 4 °C 下后固定过夜。
  5. 去除固定液，将脑组织在 50 mL 0.1 M PB 中置于摇床上洗涤 30 分钟。
  6. 洗涤后，将脑组织放入 50 mL 离心管中，浸入含 30% 蔗糖的 0.1 M PB 溶液中，于 4 °C 下孵育 48 小时或直至脑组织沉入管底，以实现冷冻保护。
  7. 用锋利刀片修整经冷冻保护的脑组织，将其置于冷冻模具中，并用最佳切割温度（OCT）包埋剂包埋。避免产生气泡。调整脑组织方向后，将冷冻模具放入 -80 °C 超低温冰箱中冷冻。
  8. 将冷冻组织安装至切片装置上。切片前，至少平衡组织至恒定的冷冻切片机温度 15 分钟。
  9. 将脑组织切成 25 µm 厚的冠状切片。使用玻璃钩轻轻接触 OCT 包埋剂，避免触碰脑组织本身。每孔收集 3 张相邻切片，置于 24 孔板中，并在 4 °C 下保存于 0.1 M PB 中，直至染色。
    注意：本方案可在此处暂停，最长不超过两周。更长时间的储存可能影响组织质量，从而影响实验结果。

2. 免疫荧光

  1. 配制溶液，包括封闭缓冲液、抗体缓冲液、洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2（参见 表1).
  2. 用PB冲洗切片一次，以去除多余的OCT。
    1. 用塑料移液管吸除溶液，注意不要吸入脑切片。用1000 µL移液器加入250 µL新鲜PB。
      注意：切片不可干燥，因此应逐孔移除和添加液体。
  3. 用塑料移液管移除 PB，每孔使用 1000 µL 移液器加入 250 µL 封闭缓冲液。在摇床中室温（RT）孵育 3 小时。
  4. 孵育期间，在反应管中用抗体缓冲液稀释一抗。每孔使用 250 µL 抗体缓冲液，并加入适量的一抗（参见 表2用2 µL移液器将溶液直接移入其中，轻轻吹打数次以混匀。随后短暂涡旋，确保充分混合。
    注意：为了确定背景荧光，应进行不添加一抗的染色实验。具体操作为：按照实验方案，将切片在不含一抗的抗体溶液中孵育。
  5. 孵育结束后，用塑料移液管吸除封闭液，每孔加入250 µL含一抗的抗体溶液。将切片置于摇床上，4 °C孵育过夜。
  6. 次日，在摇床上用洗涤缓冲液1于室温下洗涤切片，每次10分钟，共洗涤3次。
    1. 用塑料移液管吸除培养基，每孔加入 300 µL 洗涤缓冲液 1。室温孵育 10 分钟。重复 3 次。
  7. 在洗涤步骤期间，于反应管中用抗体缓冲液稀释荧光标记的二抗。每孔使用 250 µL 抗体缓冲液，并加入适量抗体（参见 表 2使用2 µL移液器将溶液直接移入样品中，轻轻反复吹打数次以混匀，随后短暂涡旋振荡，确保充分混匀。
    注意：由于抗体对光敏感，从这一步开始的所有操作均需在避光条件下进行。
  8. 洗涤步骤后，用塑料移液管吸除洗涤缓冲液，每孔加入含二抗的抗体溶液250 µL。将切片置于避光条件下，室温孵育90分钟。
  9. 用洗涤缓冲液2在室温下洗涤切片，每次10分钟，共洗3次。
  10. 在洗涤步骤中，将4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）用0.1 M PB以1:2000的比例稀释。
  11. 用塑料移液管吸除洗涤缓冲液2，每孔加入250 µL DAPI溶液。在摇床中室温孵育5分钟。
  12. 用塑料移液管吸除DAPI溶液，再用1000 µL移液器向每孔加入500 µL的0.1 M PB。
  13. 将切片置于显微镜载玻片上。
    1. 将载玻片置于体视显微镜下。用细毛刷在载玻片上分别添加三滴0.1 M PB溶液。每滴溶液中各放置一片组织切片。
    2. 使用细毛刷将切片在显微镜载玻片上压平并调整方向。
    3. 当所有切片位置正确后，用纸巾吸去多余的磷酸盐缓冲液，并小心地将载玻片晾干。
      注意：避免脑切片完全干燥。
    4. 向载玻片上加入80 µL封片介质。小心地将盖玻片盖在载玻片上，从而封埋脑切片。
    5. 将载玻片置于通风橱中干燥1-2小时（需覆盖以避免光照），随后存放于显微镜载玻片盒中，4 °C保存。
      注意：此处可暂停本实验方案。

3. 成像

  1. 包埋介质完全硬化后，将载玻片置于共聚焦显微镜下。
    注意：使用落射荧光显微镜结合去卷积软件应可获得相似的图像质量。
  2. 通过增加或减少每个通道的激光强度来调整激光设置，使极少像素过曝，以确保灰度值的最大分布。
  3. 采集整个脑切片不同通道的虚拟组织图像。
    1. 在成像软件中（参见材料表），选择拼图（Tiles）选项，并使用拼图区域设置（Tile Region Setup）手动勾画脑切片区域。
    2. 在拼图区域内分布多个支持点，并通过点击验证拼图区域/位置…（Verify Tile Regions/Positions…）来调整各支持点的焦距。
    3. 根据所需分辨率和最终图像文件大小，在采集模式（Acquisition Mode）中调整设置，然后开始扫描。
  4. 扫描完成后，使用图像拼接（Stitching）功能处理虚拟组织图像，并通过图像导出（Image Export）功能将文件导出为 .tif 格式。

4. 基于计算机的分析

  1. 通过点击 文件| 打开，将一幅图像的所有单通道加载到 FIJI29 中。
  2. 使用 自由手选择 工具，在 DAPI 通道中勾勒出一个半脑区域。通过点击 编辑| 选择| 创建掩膜，生成该选区的掩膜。
  3. 通过点击 分析| 测量，确定各单通道（Mover 和突触素）的平均荧光强度。
    注意：请确保选择不同的通道，以分别测定每个通道的平均荧光强度值。
  4. 将各单通道的平均荧光强度值复制到电子表格中。
  5. 通过使用 自由手选择 工具勾勒目标区域，测定该区域内各单通道的平均荧光强度。可参考小鼠脑图谱作为定位依据。
  6. 对所有半脑及所有目标区域重复执行步骤 4.1–4.5。
    注意：应分别测定每个半脑的数值，以便后续将目标区域的数值与同侧半脑的数值进行比较（见步骤 5.2）。

5. 数据处理

  1. 如果背景荧光较高（参见讨论部分），则可能需要进行背景扣除。为此，确定未使用针对参考蛋白（此处为突触素，synaptophysin）的一抗处理的切片的平均荧光强度，并将该值从所有脑区和半脑获得的数值中减去。
  2. 当每个半脑及每个感兴趣区域的单通道平均荧光强度确定后（参见表3），通过将Mover的数值除以突触素（synaptophysin）的数值来计算Mover与突触素的比值（表3中黄色标注部分）。对每个半脑和每个感兴趣区域分别进行此计算。
  3. 将某一感兴趣区域所得比值除以对应半脑的比值（表3中橙色标注部分），以确定该感兴趣区域与半脑的比值。
  4. 为确定Mover的相对丰度，将步骤5.2中获得的比值转换为百分比形式，即计算其与1的偏差程度（表3中红色标注部分）。例如，比值为1.25时，表示Mover的相对丰度高于平均水平25%；比值为0.75时，表示Mover的相对丰度低于平均水平25%。

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结果

不同标记物的代表性染色模式如图1所示。染色模式因蛋白质分布情况而异。图中各列（A）-（E）展示了五个前后（头尾）方向的脑切片水平。第一行显示了典型的DAPI染色结果：DAPI可结合细胞的DNA，从而标记细胞核，呈现点状染色模式。细胞密度较高的区域比细胞密度较低的区域染色更亮。第二行展示了分布不均一的蛋白质示例，Mover蛋白的染色显示其在脑组织中呈差异性分布，存在明亮的热点区域和较暗的区域。第三行展示了分布较为均一的参考标记物突触素（synaptophysin）的染色示例。第四行为两种蛋白的叠加图像，显示Mover（红色）与标记蛋白突触素（绿色）相比具有差异性分布特征。

图2展示了本实验方案第4步中所述的定量结果。图中显示了不同通道在半球范围内的平均荧光强度值（Mov...

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讨论

本文所述方法旨在通过将目标蛋白的分布与已知分布的标记蛋白的丰度进行比较，从而量化目标蛋白的分布情况。免疫荧光染色在不同切片之间可能会表现出染色强度的高度变异性。此处描述的定量方法通过计算目标蛋白与半脑平均信号强度的比值，规避了这一问题。因此，不同切片间的染色强度差异得以消除，从而实现对蛋白分布的定量描述。

与所有免疫荧光实验方案（无论是定性还是定量）一样，多个因素可能影响实验的成功，从而干扰分析结果。因此，应特别关注方案中的关键步骤。首先，必须对组织进行适当的固定。这种固定通常可通过成功的经心灌注实现。灌注质量可在血液冲洗后通过快速检查肝脏来验证。灌注成功的初步指标是肝脏及四肢变得苍白透明28。若发现血凝块，可能提示灌注速度过慢，下次操作时应加快灌注速度。某些蛋白质需要采用不同的固定方案，因为PFA的化学固定可能导致抗原表位被封闭30。在此情况下，应考虑采用冷冻固定或使用其他化学固定剂（如甲醇）进行固定。第二，切片完成后，应尽快对脑切片进行染色，最好在当天或次日完成。在磷酸盐缓冲液（PB...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Irmgard Weiss提供的出色技术协助。作者感谢Hermes Pofantis和Andoniya Petkova的支持。作者还感谢欧洲神经科学研究所提供LSM800显微镜的使用权限及相关技术协助，特别是Nils Halbsgut博士的帮助。本工作由哥廷根大学医学中心资助。JSV感谢脑部纳米级显微成像与分子生理学中心（CNMPB）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 离心管Eppendorf30120094
50 mL 离心管Greiner Bio-One227261
多孔板 24 孔Fisher Scientific                                                                                                087721H
塑料移液管（一次性）Sarstedt861,176
1000 mL 移液管Rainin 17014382
2 mL 移液管Eppendorf3123000012
Vortex Genius 3 IKA3340001
Menzel 显微镜载玻片Fisher Scientific                                                                                          10144633CF
体视显微镜Leica
LSM800Zeiss共聚焦显微镜
冷冻切片机Leica
PBS (10X)Roche                                                                                       11666789001
PFASigma                                                                                            P6148-1kg
NaClBioFroxx1394KG001
蔗糖neoFroxx1104KG001
Tissue TekSakura 4583OCT
Na2HPO4BioFroxx5155KG001
NaH2PO4Merck1,063,460,500
正常山羊血清Merck MilliporeS26-100ML
正常驴血清MerckS30-100ML
Triton X-100Merck1,086,031,000
兔抗 Mover 抗体Synaptic SystemsRRID: AB_10804285
豚鼠抗突触素抗体Synaptic SystemsRRID: AB_1210382
驴抗兔 AF647 抗体Jackson ImmunoResearchRRID: AB_2492288
羊抗小鼠 AF488 抗体Jackson ImmunoResearchRRID: AB_2337438
Mowiol4-88Calbiochem                                                                                                   475904
ZEN2 blue 软件Zeiss显微成像软件
FIJIImageJ分析软件
Microsoft ExcelMicrosoft

参考文献

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