Method Article

免疫荧光定量小鼠脑突触蛋白的异种分布

DOI:

10.3791/58940

⸱

January 29th, 2019

 ,  , 
1Institute of Anatomy and Embryology, University Medical Center Göttingen

In This Article

Summary

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在这里, 我们描述了一种定量的方法来确定突触蛋白相对于标记蛋白使用免疫荧光染色, 共聚焦显微镜, 和基于计算机的分析。

Abstract

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特定突触蛋白的存在、缺失或水平会严重影响突触的传播。除了阐明蛋白质的功能外, 还必须确定其分布。在这里, 我们描述了一个使用免疫荧光、共聚焦显微镜和基于计算机的分析来确定突触蛋白 mof (也称为 tprgl 或 synaptic) 的分布的协议。我们比较了切除物与突触泡蛋白突触素的分布, 从而定量地确定了运动物相对于突触囊泡丰度的分布。值得注意的是, 这种方法有可能被采用, 以便利用不同的抗体或显微镜或在不同的研究中比较蛋白质的分布。我们的方法通过产生比而不是绝对荧光水平来规避免疫荧光污渍的固有变异性。此外, 我们描述的方法使研究人员能够分析蛋白质在不同层次上的分布: 从整个大脑切片到大脑区域, 再到大脑区域的不同次区域, 如海马或感觉的不同层皮层。马剂是一种脊椎动物特有的蛋白质, 与突触囊泡有关。通过这种方法, 我们表明, 蒙特是异质分布在大脑的各个区域, 在腹侧苍白, 隔膜核, 杏仁核的高水平, 也在单个大脑区域, 如海马的不同层。

Introduction

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神经元之间的通信发生在称为突触的特殊接触点。突触包含无数不同的蛋白质, 这些蛋白质协调着突触的传递。其中一些蛋白质在整个神经系统中表现出异质分布, 并不是在每个突触1中都存在。这种蛋白质的一个例子是 munc13, 它参与了突触囊泡的启动过程。munc13 有不同的等形, 它们在整个大脑中分布不均, 而特定等形的存在或不存在会影响短期突触可塑性和突触囊动力学3,4 个,5. 因此, 能够识别大脑各区域存在不同的突触蛋白至关重要。

突触蛋白的定量选择方法--到目前为止--是质谱和西方印迹, 而不是免疫组织化学 6,7,8,9。在某些情况下, 有几种方法相互补充, 以评估特定蛋白质的数量和定位 (即wilhelm等人).10). 我们在这里描述的方法允许对感兴趣的蛋....

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Protocol

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该协议不涉及对活体动物的实验。当地动物保护当局 (Tierschutzkommission der university ätsmedizin göttingen) 根据 t 10/30 号批准了涉及动物安乐死以获得大脑样本的实验。

注: 该方案使用了3例成年雄性 c57bl6 小鼠。

1. 样品制备

  1. 制备固定剂和 0.1 m 磷酸盐缓冲液 (pb; 见表 1)。
  2. 修复动物通过经心灌注如 gage 等人所述.28. 首先用0.9% 的 nacl 溶液冲洗血液, 然后用30% 的4% 甲醛 (pfa) 冲洗血液。
  3. 用剪刀打开头骨, 用带有钝器边缘的勺子仔细隔离大脑, 以避免破坏组织。
  4. 在4°c 的情况下, 用4% 的 pfa 在4°c 下隔夜填充一个50毫升的反应管, 并将其固定在4% 的 pfa 中。
  5. 取出固定装置, 在振动台上用 0.1 m pb 的50毫升清洗大脑30分钟。
  6. 洗涤后, 将大脑在 0.1m pb 中30% 蔗糖中的50毫升反应管中孵育 48小时, 或直到在4°c 的试管中沉入试管保护。
  7. 用锋利的刀片修剪受低温保护的大脑, 将其放入低温, 并将其嵌入最佳切割温度 (oc....

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Results

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图 1显示了不同标记的代表性染色模式。模式因蛋白质的分布而异。五个星冠水平的例子在 (a)-(e) 列中显示。第一行显示了具有代表性的 dapi 染色: dapi 粘附于细胞的 dna 上, 因此细胞核被染色。这将导致点状图案。具有高细胞密度的区域比细胞密度较低的区域更明亮。在第二行可以看到异质分布蛋白的一个例子。马弗染色显示了整个大脑的差异分布, 有明亮的热点区域和较暗的区域。在第三行中, 显示了分布更均匀的参考标记突触素的一个示例。这两种蛋白质 (第四行) 的叠加显示了 mof (红色) 与标记蛋白突触素 (绿色) 的差异分布。

图 2显示了协议第4步中描述的量化。显示的是整个半球不同通道 (mof,图 2

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Discussion

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这里提出的方法是量化感兴趣的蛋白质相对于已知分布的标记蛋白的丰度的分布。免疫荧光染色可显示不同切片之间染色强度的高变异性。这里描述的量化方法通过确定整个半球感兴趣的蛋白质与平均值的比率来规避这个问题。因此, 不同切片的染色强度被取消, 并允许定量描述。

与每一个免疫荧光协议一样, 定性或定量, 有几个因素会影响成功, 从而混淆分析。因此, 应特别注意议定书的关键步骤。首先, 需要正确固定组织。这种固定通常可以通过成功的心脏灌注来实现。通过洗血后不久对肝脏进行检查, 可以验证灌注的质量。一个成功灌注的第一个指标是肝脏和四肢的清除28。血块的存在可能表明灌注可能太慢, 下次应该执行得更快。有些蛋白质需要不同的固定方案, 因为与 pfa 的化学固定可能会导致表位堵塞30。在这种情况下, 应考虑使用不同的化学物质 (如甲醇) 进行冷冻固定或固定。其次, 在切片后, 尽快弄脏大脑切片是至关重要的, 最好是在相同或下一个说的情况下。pb 中储存时间较长可导致细菌感染, 在添加 nn3

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 irmgard weiss 提供的出色技术援助。提交人感谢 hermes pofantis 和 andoniya petkova 的支持。作者还感谢欧洲神经科学研究所使用 lsm800 和技术援助, 特别是 nils halbsteut 博士提供的技术援助。这项工作是由哥廷根大学医学中心资助的。jsv 感谢大脑纳米显微镜和分子生理学中心 (cnmpb) 的支持。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL 反应管Eppendorf30120094
50 mL 反应管Greiner Bio-One227261
多孔 24 孔Fisher Scientific                                                                                               087721H
塑料移液器（一次性）Sarstedt861,176
1000 mL 移液器Rainin 
2 ml 移液器Eppendorf3123000012
Vortex Genius 3 IKA3340001
Menzel 显微镜载玻片Fisher Scientific                                                                                         10144633CF
立体镜Leica
LSM800蔡司共聚焦显微镜
冷冻切片机Leica
PBS （10X）罗氏                                                                                      
PFASigma                                                                                           P6148-1kg
NaClBioFroxx1394KG001
蔗糖neoFroxx1104KG001
纸巾 Tek樱花 4583OCT
Na2HPO4BioFroxx5155KG001
NaH2PO4默克1,063,460,500
正常山羊血清默克 MilliporeS26-100ML
正常驴血清默克S30-100ML
Triton X-100默克1,086,031,000
兔抗移动突触系统RRID： AB_10804285
豚鼠抗突素突触系统RRID： AB_1210382
驴抗兔 AF647Jackson ImmunoResearchRRID： AB_2492288
山羊抗小鼠 AF488Jackson ImmunoResearchRRID： AB_2337438
Mowiol4-88钙生化学                                                                                                  
ZEN2 blue 软件蔡司显微镜软件
FIJIImageJ分析软件
Microsoft ExcelMicrosoft
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References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58(2018).
  2. Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expr....

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Synaptic Protein DistributionImmunofluorescence ProtocolConfocal MicroscopyComputer Based AnalysisMover ProteinSynaptophysin ComparisonBrain Slice AnalysisFluorescence Intensity RatioHeterogeneous DistributionHippocampal Layers

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