本文介绍了一种定量分析方法，通过免疫荧光染色、共聚焦显微镜和计算机辅助分析，确定突触蛋白相对于标记蛋白的分布情况。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
特定突触蛋白的存在、缺失或表达水平可显著影响突触传递。除了阐明某种蛋白的功能外，确定其分布情况也至关重要。本文介绍了一种结合免疫荧光、共聚焦显微镜和计算机分析的方法，用于确定突触蛋白Mover（也称为TPRGL或SVAP30）的分布。我们将Mover的分布与突触小泡蛋白突触素（synaptophysin）的分布进行比较，从而以突触小泡丰度为参照，定量地分析Mover的分布特征。值得注意的是，该方法可用于不同抗体、不同显微镜或跨研究之间蛋白分布的比较。本方法通过提供比值而非绝对荧光强度，规避了免疫荧光染色固有的变异性。此外，该方法使研究人员能够在多个层次上分析蛋白的分布：从整个脑切片，到脑区，再到单个脑区内的不同亚区，例如海马或感觉皮层的不同层次。Mover是一种与突触小泡相关的脊椎动物特异性蛋白。利用该方法，我们发现Mover在不同脑区之间呈异质性分布，在腹侧苍白球、隔核和杏仁核中表达水平较高；同时在单个脑区内也呈异质分布，例如海马的不同层次。
引言
神经元之间的通信发生在称为突触的特化接触位点。突触中含有大量不同的蛋白质，这些蛋白质协调突触传递过程。其中一些蛋白质在神经系统中的分布具有异质性，并非存在于每一个突触中1。Munc13 就是这样一个蛋白质的例子，它参与突触囊泡的启动过程。Munc13 存在多种亚型，这些亚型在脑内呈异质性分布2，特定亚型的存在或缺失可影响短时程突触可塑性和突触囊泡动力学3,4,5。因此，能够识别不同脑区中各类突触蛋白的存在情况至关重要。
目前用于突触蛋白定量的首选方法是质谱法和蛋白质印迹法，而非免疫组织化学法6,7,8,9在某些情况下，会联合使用多种方法，以相互补充，评估特定蛋白质的含量及其定位即，Wilhelm 等10）。本文所述方法无需采用任何生物化学手段，仅通过免疫荧光染色....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本方案不涉及对活体动物进行的实验。为获取脑组织样本而实施安乐死的动物实验已获得当地动物保护机构（哥廷根大学医学中心动物保护委员会）的批准，批准编号为 T 10/30。
注意：本实验方案使用了3只成年雄性C57BL/6小鼠。
1. 样品制备
- 配制固定液和 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB；见表 1）。
- 按照 Gage 等人28所述方法进行经心脏灌注固定。首先用 0.9% NaCl 溶液冲洗血液，然后用 30 mL 4% 多聚甲醛（PFA）进行灌注。
- 用剪刀打开颅骨，使用钝边勺子小心分离脑组织，避免损伤组织。
- 将 50 mL 离心管中装满固定液，将脑组织置于 4% PFA 中，在 4 °C 下后固定过夜。
- 去除固定液，将脑组织在 50 mL 0.1 M PB 中置于摇床上洗涤 30 分钟。
- 洗涤后，将脑组织放入 50 mL 离心管中，浸入含 30% 蔗糖的 0.1 M PB 溶液中，于 4 °C 下孵育 48 小时或直至脑组织沉入管底，以实现冷冻保护。
- 用锋利刀片修整经冷冻保护的脑组织，将其置于冷冻模具中，并用最佳切割温度（OCT）包埋剂包埋。避免产生气泡。调整脑组织方向后，将冷冻模具放....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
不同标记物的代表性染色模式如图1所示。染色模式因蛋白质分布情况而异。图中各列（A）-（E）展示了五个前后（头尾）方向的脑切片水平。第一行显示了典型的DAPI染色结果：DAPI可结合细胞的DNA，从而标记细胞核，呈现点状染色模式。细胞密度较高的区域比细胞密度较低的区域染色更亮。第二行展示了分布不均一的蛋白质示例，Mover蛋白的染色显示其在脑组织中呈差异性分布，存在明亮的热点区域和较暗的区域。第三行展示了分布较为均一的参考标记物突触素（synaptophysin）的染色示例。第四行为两种蛋白的叠加图像，显示Mover（红色）与标记蛋白突触素（绿色）相比具有差异性分布特征。
图2展示了本实验方案第4步中所述的定量结果。图中显示了不同通道在半球范围内的平均荧光强度值（Mov.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述方法旨在通过将目标蛋白的分布与已知分布的标记蛋白的丰度进行比较，从而量化目标蛋白的分布情况。免疫荧光染色在不同切片之间可能会表现出染色强度的高度变异性。此处描述的定量方法通过计算目标蛋白与半脑平均信号强度的比值，规避了这一问题。因此，不同切片间的染色强度差异得以消除，从而实现对蛋白分布的定量描述。
与所有免疫荧光实验方案（无论是定性还是定量）一样，多个因素可能影响实验的成功，从而干扰分析结果。因此，应特别关注方案中的关键步骤。首先，必须对组织进行适当的固定。这种固定通常可通过成功的经心灌注实现。灌注质量可在血液冲洗后通过快速检查肝脏来验证。灌注成功的初步指标是肝脏及四肢变得苍白透明28。若发现血凝块，可能提示灌注速度过慢，下次操作时应加快灌注速度。某些蛋白质需要采用不同的固定方案，因为PFA的化学固定可能导致抗原表位被封闭30。在此情况下，应考虑采用冷冻固定或使用其他化学固定剂（如甲醇）进行固定。第二，切片完成后，应尽快对脑切片进行染色，最好在当天或次日完成。在磷酸盐缓冲液（PB.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Irmgard Weiss提供的出色技术协助。作者感谢Hermes Pofantis和Andoniya Petkova的支持。作者还感谢欧洲神经科学研究所提供LSM800显微镜的使用权限及相关技术协助，特别是Nils Halbsgut博士的帮助。本工作由哥廷根大学医学中心资助。JSV感谢脑部纳米级显微成像与分子生理学中心（CNMPB）的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 离心管 | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL 离心管 | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 多孔板 24 孔 | Fisher Scientific | 087721H | |
| 塑料移液管（一次性） | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL 移液管 | Rainin | 17014382 | |
| 2 mL 移液管 | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| 体视显微镜 | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | 共聚焦显微镜 | |
| 冷冻切片机 | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| 蔗糖 | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| 正常山羊血清 | Merck Millipore | S26-100ML | |
| 正常驴血清 | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| 兔抗 Mover 抗体 | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| 豚鼠抗突触素抗体 | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| 驴抗兔 AF647 抗体 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| 羊抗小鼠 AF488 抗体 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue 软件 | Zeiss | 显微成像软件 | |
| FIJI | ImageJ | 分析软件 | |
| Microsoft Excel | Microsoft |
参考文献
- Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58(2018).
- Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expr....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
