评估永生化人孕早期滋养层细胞系迁移、侵袭和增殖能力的体外实验方法

摘要

本文介绍了一种简便易行的实验方案，利用三种体外实验方法评估人类滋养层细胞的细胞运动能力：划痕实验、Transwell侵袭实验和细胞增殖实验。

摘要

在胎盘发育和妊娠早期，滋养层细胞的运动能力是一项关键特性。滋养层细胞迁移与侵袭功能异常与子痫前期和宫内生长受限等妊娠疾病密切相关，这些疾病均表现为滋养层细胞对母体血管系统的侵入不足。然而，目前对于迁移中的滋养层细胞如何发育形成胎盘的机制仍了解有限。通过划痕实验对细胞迁移进行体外分析，是鉴定调控滋养层细胞迁移能力因素的有效工具。但仅靠该实验尚不足以明确导致细胞迁移改变的细胞学变化。本实验方案描述了三种不同的体外实验方法，可联合用于评估滋养层细胞的运动行为：划痕实验、侵袭实验和增殖实验。此处所述的实验流程亦可根据需要进行调整，适用于其他细胞系，以定量分析细胞对刺激物的运动反应。这些方法可帮助研究人员识别影响细胞运动的独立因素，并对细胞迁移表型变化背后的潜在机制进行全面探究。

引言

胎盘发育是妊娠建立过程中的关键步骤，对母体和胎儿的健康均有重要影响。然而，这一过程发生的机制基础尚未完全阐明。细胞迁移是一种重要的生物学过程，在妊娠期间胎盘的形成和功能中发挥着重要作用。在胚泡植入后，滋养外胚层分化为绒毛滋养层细胞，覆盖在绒毛膜绒毛表面，参与气体和营养物质交换；同时还分化为绒毛外滋养层细胞（EVTs），后者从绒毛中迁移出来并侵入母体蜕膜及血管系统¹。EVTs的迁移对于母体螺旋动脉的重塑以及建立子宫胎盘循环以支持胎儿生长至关重要²。妊娠期间滋养层细胞侵袭不足会导致胎盘发育异常，并可能引发子痫前期、妊娠期高血压、宫内生长受限和早产等妊娠并发症^3,4。因此，了解影响滋养层细胞运动能力的因素，对于明确正常胎盘形成所必需的分子通路至关重要。

滋养层细胞的迁移受到包括生长因子、细胞因子、激素和血管生成因子在内的复杂信号分子网络的调控⁵。由于在体内研究胎盘存在局限性，利用永生化的人滋养层细胞系进行的体外实验对于鉴定影响滋养层细胞运动能力的因素至关重要。划痕实验和侵袭实验已被广泛用于定量评估单个分子对滋养层细胞迁移的作用^6,

方案

1. 细胞准备

1. 将细胞在 T-75 培养瓶中，于 37 °C、5% CO₂ 和 95% 湿度条件下，使用标准培养基进行培养。
   注意：本实验所用细胞为永生化的早孕期滋养层细胞系 Swan.71（Sw.71）和 HTR-8/SVneo^9,10。Sw.71 细胞使用 DMEM/F-12 培养基培养，其中添加 10% 热灭活胎牛血清（FBS）、1.0 mM 丙酮酸钠、10 mM HEPES、0.10 mM MEM 非必需氨基酸、100 单位/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素。HTR-8/SVneo 细胞则使用添加 5% 热灭活 FBS 的 RPMI-1640 培养基进行培养。
2. 让细胞持续增殖，直至达到 90–100% 汇合度。在无菌细胞培养超净台中，吸除培养瓶中的培养基，并用 10 mL 无菌 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
3. 吸除 PBS，向培养瓶中加入 5 mL 1×（0.05%）胰蛋白酶-EDTA 溶液，确保细胞完全被胰蛋白酶覆盖。将培养瓶置于实验室培养箱中，在 37 °C、5% CO₂ 和 95% 湿度条件下孵育，直至所有细胞从培养瓶底部脱落（约 5–10 分钟）。
4. 向培养瓶中加入 10 mL 预热的生长培养基，以中和胰蛋白酶....

结果

在这些实验中，使用了永生化的人类早孕期滋养层细胞系 Sw.71 和 HTR-8/SVneo，以确定糖皮质激素在滋养层细胞迁移中的作用¹²。由于最近的研究表明糖皮质激素可改变滋养层细胞功能，因此在本实验中使用了糖皮质激素，但也可采用其他替代处理方式¹²。所有实验中，两个细胞系均分别用载体（1× PBS）或 100 nM 合成糖皮质激素地塞米松（Dex）处理。使用自动化的延时成像系统，每 2 小时测量一次划痕密度和大小，持续 72 小时。图 1 展示了在不同时间点从划痕实验中获得的图像及结果示例。已提供两种处理条件下 0、8 和 18 小时时间点的代表性图像（图 1A）。图中显示了经载体对照（Veh）或 100 nM Dex 处理的样本随时间变化的划痕密度和划痕大小曲线（图 1B）。地塞米松处理降低了划痕.......

讨论

本实验方法在迁移和侵袭实验的基础上，引入细胞增殖速率作为影响滋养层细胞运动差异的潜在因素。这些体外实验方法联合使用时，操作简便且效果可靠，可用于鉴定调控滋养层细胞迁移的细胞信号通路。如上所述，可通过激素、细胞因子、生长因子或其他分子处理滋养层细胞，以评估其对细胞迁移的影响。 Alternatively，也可通过耗竭特定靶蛋白来阐明其在滋养层细胞运动中的功能作用。鉴定滋养层细胞迁移的关键调控因子，有助于更深入理解由胎盘发育缺陷引起的妊娠并发症的基本机制，这些并发症包括子痫前期、宫内生长受限以及早产。

本实验方案中有多个关键步骤，对于获得准确结果至关重要。由于酚红在细胞培养基中的使用浓度下具有雌激素活性¹³，因此在实验终点检测时必须使用不含酚红的培养基，以防止细胞中雌激素受体发生非预期激活。在进行Transwell侵袭实验时，需确保细胞外基质均匀、水平，并使用低温试剂以防止基质过早聚合。在进行细胞增殖和侵袭实验时，应立即对样本进行计数，以避免细胞重新黏附至组织培养板。还应考虑到，实验处理引起的细胞死亡可能会影响三项实验的结果。因此，在评估.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.4% 台盼蓝染液	赛默飞世尔科技	15250-061
0.5% 胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	15400-054
1.0 M HEPES	AmericanBio	AB06021-00100
10 mM MEM 非必需氨基酸	Life Technologies	11140-050
100 mM 丙酮酸钠	Life Technologies	11360-070
24孔板小室插件	康宁	3422	包含孔径为8的聚碳酸酯滤膜 μm 孔径大小
活性炭-葡聚糖处理的胎牛血清	Gemini Bio-Products	100-119
Countess II 自动细胞计数仪	赛默飞世尔科技	AMQAX1000
结晶紫	Sigma Aldrich	C0775
Cytoseal 60	赛默飞世尔科技	8310-4
地塞米松（Dex；1, 4-孕二烯-9α-氟-16α-甲基-11β，17,21-二羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮； ≥98% TLC	Steraloids	P0500-000
DMEM/Ham’s F12	Life Technologies	11330-032
胎牛血清	Sigma Aldrich	F2442
IncuCyte 24孔ImageLock培养板	Essen BioScience	4365	若使用 IncuCyte Zoom 成像系统，需将细胞接种至 IncuCyte ImageLock 培养板中。该培养板底部设有定位标记，可作为参考点，用于在固定视野范围内进行重复成像。
IncuCyte 软件	Essen BioScience	2010A 版2
IncuCyte ZOOM 系统	Essen BioScience	N/A	划痕实验图像采用预设程序进行采集和分析 “划痕伤口” IncuCyte ZOOM 系统中的参数。其他延时显微镜也可使用。
Matrigel 基底膜基质	Becton Dickinson	356231	生长因子减少、无酚红
微型载玻片	VWR International, LLC	48311-7003
显微镜盖玻片	Fisher Scientific	12-545-E
奥林巴斯IX71倒置显微镜	奥林巴斯	IX71
青霉素（10,000 单位/mL）/链霉素（10,000 µg/mL	Life Technologies	151-40-122
无酚红DMEM/Ham's F12	Life Technologies	11039-021
半自动伤口制作工具	Essen BioScience	N/A