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方法文章

评估永生化人孕早期滋养层细胞系迁移、侵袭和增殖能力的体外实验方法

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DOI：

10.3791/58942

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2019年3月5日

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences, Yale School of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种简便易行的实验方案，利用三种体外实验方法评估人类滋养层细胞的细胞运动能力：划痕实验、Transwell侵袭实验和细胞增殖实验。

摘要

在胎盘发育和妊娠早期，滋养层细胞的运动能力是一项关键特性。滋养层细胞迁移与侵袭功能异常与子痫前期和宫内生长受限等妊娠疾病密切相关，这些疾病均表现为滋养层细胞对母体血管系统的侵入不足。然而，目前对于迁移中的滋养层细胞如何发育形成胎盘的机制仍了解有限。通过划痕实验对细胞迁移进行体外分析，是鉴定调控滋养层细胞迁移能力因素的有效工具。但仅靠该实验尚不足以明确导致细胞迁移改变的细胞学变化。本实验方案描述了三种不同的体外实验方法，可联合用于评估滋养层细胞的运动行为：划痕实验、侵袭实验和增殖实验。此处所述的实验流程亦可根据需要进行调整，适用于其他细胞系，以定量分析细胞对刺激物的运动反应。这些方法可帮助研究人员识别影响细胞运动的独立因素，并对细胞迁移表型变化背后的潜在机制进行全面探究。

引言

胎盘发育是妊娠建立过程中的关键步骤，对母体和胎儿的健康均有重要影响。然而，这一过程发生的机制基础尚未完全阐明。细胞迁移是一种重要的生物学过程，在妊娠期间胎盘的形成和功能中发挥着重要作用。在胚泡植入后，滋养外胚层分化为绒毛滋养层细胞，覆盖在绒毛膜绒毛表面，参与气体和营养物质交换；同时还分化为绒毛外滋养层细胞（EVTs），后者从绒毛中迁移出来并侵入母体蜕膜及血管系统1。EVTs的迁移对于母体螺旋动脉的重塑以及建立子宫胎盘循环以支持胎儿生长至关重要2。妊娠期间滋养层细胞侵袭不足会导致胎盘发育异常，并可能引发子痫前期、妊娠期高血压、宫内生长受限和早产等妊娠并发症3,4。因此，了解影响滋养层细胞运动能力的因素，对于明确正常胎盘形成所必需的分子通路至关重要。

滋养层细胞的迁移受到包括生长因子、细胞因子、激素和血管生成因子在内的复杂信号分子网络的调控5。由于在体内研究胎盘存在局限性，利用永生化的人滋养层细胞系进行的体外实验对于鉴定影响滋养层细胞运动能力的因素至关重要。划痕实验和侵袭实验已被广泛用于定量评估单个分子对滋养层细胞迁移的作用6,7,8。然而，尽管这两种实验联用有助于探究细胞侵袭性变化如何导致迁移能力的改变，但它们并未考虑可能影响细胞迁移速率的其他机制。例如，细胞增殖速率的降低可能导致可用于迁移的细胞数量减少。

本文介绍了利用划痕实验、细胞增殖实验和细胞侵袭实验来定量评估滋养层细胞迁移能力的体外方法。在划痕实验中，于细胞单层上制造一个均匀的伤口，通过自动化的延时成像技术测量伤口区域的大小以及伤口内细胞的密度，从而评估细胞迁移填补空隙的能力。细胞增殖实验基于计算每个时间点的细胞数量与已知初始细胞数量之间的比值。在细胞侵袭实验中，将细胞接种于包被有细胞外基质的细胞培养小室（例如Transwell）上室，随后计数在趋化因子诱导下穿过细胞外基质的细胞数量。

划痕实验是一种简单且有效的工具，可用于确定不同环境条件对细胞迁移的影响。随后可使用增殖和侵袭实验，以确定细胞增殖和侵袭性在细胞迁移总体变化中的贡献。这些实验 collectively 可提供对可能影响细胞运动性的生物学过程的可靠测量。在所述实验中使用了两种永生化的早孕期滋养层细胞系，即 Swan.71（Sw.71）和 HTR-8/SVneo9,10。然而，这些实验也可针对其他细胞类型进行优化，以鉴定调控细胞迁移和侵袭的关键因子。

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方案

1. 细胞准备

  1. 将细胞在 T-75 培养瓶中，于 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度条件下，使用标准培养基进行培养。
    注意：本实验所用细胞为永生化的早孕期滋养层细胞系 Swan.71（Sw.71）和 HTR-8/SVneo9,10。Sw.71 细胞使用 DMEM/F-12 培养基培养，其中添加 10% 热灭活胎牛血清（FBS）、1.0 mM 丙酮酸钠、10 mM HEPES、0.10 mM MEM 非必需氨基酸、100 单位/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素。HTR-8/SVneo 细胞则使用添加 5% 热灭活 FBS 的 RPMI-1640 培养基进行培养。
  2. 让细胞持续增殖，直至达到 90–100% 汇合度。在无菌细胞培养超净台中，吸除培养瓶中的培养基，并用 10 mL 无菌 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
  3. 吸除 PBS，向培养瓶中加入 5 mL 1×（0.05%）胰蛋白酶-EDTA 溶液，确保细胞完全被胰蛋白酶覆盖。将培养瓶置于实验室培养箱中，在 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度条件下孵育，直至所有细胞从培养瓶底部脱落（约 5–10 分钟）。
  4. 向培养瓶中加入 10 mL 预热的生长培养基，以中和胰蛋白酶-EDTA 的活性。

2. 划痕实验

  1. 完成步骤1.4后，将适当数量的细胞接种至24孔板中，以在48小时内达到100%汇合度。
    注意：划痕实验可采用多种不同的孔板布局进行。划痕工具允许的最大孔板格式为96孔板。
  2. 次日（即划痕实验前一天），更换为不含酚红的培养基，并根据需要添加补充成分，包括经热灭活、炭吸附去除了激素的胎牛血清（charcoal dextran-stripped FBS）。
    注意：其他研究建议使用低浓度胎牛血清（例如1%）的培养基以最小化细胞增殖，该方案可作为本实验方案的替代选择11。
  3. 在进行划痕实验当天，向各孔培养基中加入所需处理因素，对细胞进行30分钟的预处理。本实验中使用的对照为溶剂对照（1×PBS）以及用1×PBS稀释的100 nM地塞米松。
  4. 为制造均一的划痕，将无菌的10 µL吸头安装在划痕工具的针脚上。将吸头缓慢插入第一排孔中，并沿划痕工具的轨道移动孔板，直至吸头到达孔的另一侧。
    1. 将孔板移回起始位置，使吸头持续接触孔板底部，以确保在孔的直径范围内形成一致的划痕。移除并更换新的无菌10 µL吸头，然后将其插入下一排孔中。
  5. 重复步骤2.4，直至所有孔均完成划痕。
    注意：若无划痕工具，也可使用10 µL吸头手动刮擦孔中央区域以形成划痕。
  6. 小心吸除培养基，并用1×PBS轻柔洗涤细胞两次。最后一次洗涤后，加入含所需处理因素或溶剂对照（按步骤2.3指示）的补充了成分的不含酚红、去除了激素或低FBS的培养基。
    注意：HTR-8/SVneo细胞应使用含酚红的培养基进行洗涤，因为使用1×PBS洗涤会导致细胞脱落。
  7. 将含有划痕的24孔板置于实验室培养箱内的自动延时成像系统中（见材料表），培养条件为37 °C、5% CO2和95%湿度。根据需要以固定时间间隔对孔进行成像，以记录细胞完成伤口愈合的全过程（例如每2小时成像一次，持续72小时）。
  8. 使用自动延时成像系统配套的软件（见材料表）计算伤口密度和宽度。为计算相对于初始伤口大小的伤口面积变化百分比，将0时间点的伤口宽度设为100%。将后续每个时间点的伤口大小除以0时间点的伤口大小，再乘以100，得到相应百分比值（图1）。

3. 侵袭实验

  1. 完成步骤1.4后，将适当数量的细胞接种至6孔板中，使细胞在48小时内达到90%融合度。将细胞置于实验室培养箱中培养，条件为37 °C、5% CO2和95%湿度。
  2. 次日，更换为无酚红培养基，并根据需要添加补充成分，包括经热灭活、炭吸附去除的胎牛血清（charcoal dextran-stripped FBS）。
    注意：可根据实验设计在此时对细胞进行预处理。
  3. 此时，将10 mg/mL细胞外基质（见材料表）小瓶置于冰上，并在冰箱中过夜缓慢解冻。
  4. 次日，在开始操作前至少2小时，将24孔板、细胞培养小室、微量离心管和移液器吸头放入冰箱（4 °C）进行预冷，以便后续与细胞外基质操作时使用。
  5. 在组织培养超净台中使用预冷的器材，用无酚红、无血清培养基按1:1比例稀释10 mg/mL细胞外基质，得到终浓度为5 mg/mL的溶液。
    注意：储存液及稀释后的细胞外基质应始终置于冰上。可根据所用细胞系的特性调整细胞外基质与培养基的比例。
  6. 在组织培养超净台中使用预冷的器材，向已放入24孔板中的小室（见材料表）内加入100 μL稀释后的细胞外基质。确保基质分布均匀且无气泡。将含有基质包被小室的24孔板置于37 °C培养箱中，使基质凝固。
  7. 为准备侵袭实验用细胞，每孔加入1 mL 1× PBS洗涤细胞，吸除PBS后，每孔加入500 µL 1×胰蛋白酶-EDTA。将6孔板置于维持在37 °C、5% CO2和95%湿度的实验室培养箱中，直至所有细胞从孔底脱落。
  8. 细胞脱落后，向每孔胰酶处理的细胞中加入500 µL无酚红、无血清培养基。
  9. 将1,000 µL脱落的细胞转移至微量离心管中，在4 °C下以400 × g离心5分钟。
  10. 吸除上清液，用无酚红、无血清培养基重悬细胞（体积根据细胞浓度确定）。使用自动细胞计数仪（见材料表）计数细胞，并调整细胞悬液体积，使终浓度为每毫升5 × 105个细胞。
    注意：也可使用血细胞计数板和显微镜进行细胞计数。
  11. 向用于侵袭实验的24孔板各孔中加入600 μL完全生长培养基。
    注意：可在孔中（下室）的完全生长培养基中添加额外的趋化因子或其他处理因素。本实验方案中，下室添加了溶剂对照（1× PBS）或用1× PBS稀释的100 nM地塞米松。
  12. 将已预包被的细胞培养小室放入含完全生长培养基的24孔板各孔中，然后在每个预包被的小室（上室）顶部加入200 μL细胞悬液，使每孔细胞总数为1 × 105个。
    注意：作为该实验的阴性对照，可在上室加入等体积的无酚红、无血清培养基（不含细胞）。
  13. 将24孔板置于维持在37 °C、5% CO2和95%湿度的实验室培养箱中培养24小时。
    注意：24小时的培养时间是针对永生化的早孕期滋养层细胞优化的，其他细胞系可能需要进一步测试以确定合适的培养时间。
  14. 过夜培养后，小心吸除上室和下室中剩余的培养基，避免扰动细胞外基质。然后用棉签轻轻擦除小室上部的细胞外基质及未侵袭的细胞，反复擦拭直至完全清除基质。
  15. 每孔小室用1× PBS洗涤3次，每次向小室的上室和下室均加入PBS，每次洗涤后吸除PBS。
  16. 将小室置于4 °C的100%冰冷甲醇中固定30分钟，以固定附着在小室上的细胞。随后用1× PBS洗涤3次，最后一次洗涤后吸除PBS。用含20%乙醇的0.2%结晶紫溶液对附着在小室上的细胞染色10分钟。
  17. 用去离子水冲洗3次，最后一次冲洗后吸除去离子水。
  18. 将小室在室温下空气干燥1小时。使用镊子和刀片小心切下小室的底部膜，并将其底部朝上固定于载玻片上。让封片介质在室温下自然干燥。
  19. 使用配备20倍物镜的光学显微镜，对每个样本至少采集4个不同视野的侵袭细胞图像。统计每张图像中的细胞总数，并将细胞数相对于对照组样本进行归一化处理，绘制数据图（图2）。

4. 增殖实验

  1. 在完成步骤1.4后，使用自动细胞计数器对来自培养瓶的胰酶消化细胞进行计数，并以每孔2 × 105个细胞的密度将细胞接种至6孔板中，使用标准生长培养基。
  2. 将细胞置于实验室培养箱中，维持37 °C、5% CO2和95%湿度，培养4小时或直至细胞贴壁。
  3. 更换为无酚红培养基，根据需要添加补充成分，包括经热灭活、炭吸附去除了激素的胎牛血清（charcoal dextran-stripped FBS），并加入所需的处理因素。本实验中所描述的处理方式为加入溶剂对照（1× PBS）或用1× PBS稀释的100 nM地塞米松。将6孔板置于维持37 °C、5% CO2和95%湿度的实验室培养箱中。
  4. 每隔48小时更换一次培养基及处理因素。
  5. 经过24、48或72小时处理后，用1 mL的1× PBS洗涤细胞，每孔加入500 µL胰酶-EDTA溶液。将6孔板放入培养箱中，直至细胞从培养板表面脱落。
  6. 待细胞完全脱落后，向每孔加入500 µL含补充成分的无酚红培养基以终止胰酶消化作用。
  7. 取5 µL胰酶消化后的细胞悬液与5 µL台盼蓝溶液加入另一离心管中，通过移液器吹打混匀。
  8. 使用自动细胞计数器对每个孔的细胞进行重复计数。
  9. 计算每个时间点每孔细胞数的平均值，并以时间为自变量绘制曲线图（图3）。

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结果

在这些实验中，使用了永生化的人类早孕期滋养层细胞系 Sw.71 和 HTR-8/SVneo，以确定糖皮质激素在滋养层细胞迁移中的作用12。由于最近的研究表明糖皮质激素可改变滋养层细胞功能，因此在本实验中使用了糖皮质激素，但也可采用其他替代处理方式12。所有实验中，两个细胞系均分别用载体（1× PBS）或 100 nM 合成糖皮质激素地塞米松（Dex）处理。使用自动化的延时成像系统，每 2 小时测量一次划痕密度和大小，持续 72 小时。图 1 展示了在不同时间点从划痕实验中获得的图像及结果示例。已提供两种处理条件下 0、8 和 18 小时时间点的代表性图像（图 1A）。图中显示了经载体对照（Veh）或 100 nM Dex 处理的样本随时间变化的划痕密度和划痕大小曲线（图 1B）。地塞米松处理降低了划痕...

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讨论

本实验方法在迁移和侵袭实验的基础上，引入细胞增殖速率作为影响滋养层细胞运动差异的潜在因素。这些体外实验方法联合使用时，操作简便且效果可靠，可用于鉴定调控滋养层细胞迁移的细胞信号通路。如上所述，可通过激素、细胞因子、生长因子或其他分子处理滋养层细胞，以评估其对细胞迁移的影响。 Alternatively，也可通过耗竭特定靶蛋白来阐明其在滋养层细胞运动中的功能作用。鉴定滋养层细胞迁移的关键调控因子，有助于更深入理解由胎盘发育缺陷引起的妊娠并发症的基本机制，这些并发症包括子痫前期、宫内生长受限以及早产。

本实验方案中有多个关键步骤，对于获得准确结果至关重要。由于酚红在细胞培养基中的使用浓度下具有雌激素活性13，因此在实验终点检测时必须使用不含酚红的培养基，以防止细胞中雌激素受体发生非预期激活。在进行Transwell侵袭实验时，需确保细胞外基质均匀、水平，并使用低温试剂以防止基质过早聚合。在进行细胞增殖和侵袭实验时，应立即对样本进行计数，以避免细胞重新黏附至组织培养板。还应考虑到，实验处理引起的细胞死亡可能会影响三项实验的结果。因此，在评估...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Gil Mor 博士提供了 Sw.71 细胞。本研究得到了 S.W. 获得的 Albert McKern 学者奖的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.4% 台盼蓝染液赛默飞世尔科技15250-061
0.5% 胰蛋白酶-EDTALife Technologies15400-054
1.0 M HEPESAmericanBioAB06021-00100
10 mM MEM 非必需氨基酸Life Technologies11140-050
100 mM 丙酮酸钠Life Technologies11360-070
24孔板小室插件康宁3422包含孔径为8的聚碳酸酯滤膜 μm 孔径大小
活性炭-葡聚糖处理的胎牛血清Gemini Bio-Products100-119
Countess II 自动细胞计数仪赛默飞世尔科技AMQAX1000
结晶紫Sigma AldrichC0775
Cytoseal 60赛默飞世尔科技8310-4
地塞米松（Dex；1, 4-孕二烯-9α-氟-16α-甲基-11β，17,21-二羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮； ≥98% TLCSteraloidsP0500-000
DMEM/Ham’s F12Life Technologies11330-032
胎牛血清Sigma AldrichF2442
IncuCyte 24孔ImageLock培养板Essen BioScience4365若使用 IncuCyte Zoom 成像系统，需将细胞接种至 IncuCyte ImageLock 培养板中。该培养板底部设有定位标记，可作为参考点，用于在固定视野范围内进行重复成像。
IncuCyte 软件Essen BioScience2010A 版2
IncuCyte ZOOM 系统Essen BioScienceN/A划痕实验图像采用预设程序进行采集和分析 “划痕伤口” IncuCyte ZOOM 系统中的参数。其他延时显微镜也可使用。
Matrigel 基底膜基质Becton Dickinson356231生长因子减少、无酚红
微型载玻片VWR International, LLC48311-7003
显微镜盖玻片Fisher Scientific12-545-E
奥林巴斯IX71倒置显微镜奥林巴斯IX71
青霉素（10,000 单位/mL）/链霉素（10,000 µg/mLLife Technologies151-40-122
无酚红DMEM/Ham's F12Life Technologies11039-021
半自动伤口制作工具Essen BioScienceN/A

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