通常，小鼠颈部注射模型用于评估致痒原诱导的搔抓行为。然而，该模型仅能提供关于瘙痒的信息，无法反映疼痛。本文介绍一种小鼠颊部注射模型，可用于同时测量与疼痛和瘙痒相关的行为。
本文内容
摘要
摘要
瘙痒被定义为 "一种令人不适的皮肤感觉，会引发搔抓欲望，由Rothman于1941年提出。在小鼠模型中，通常通过计数搔抓发作次数来评估致痒原诱导的瘙痒。然而，先前的研究表明，在小鼠颈部注射模型（目前研究搔抓行为最常用的实验方法）中，致痛物质也能诱导搔抓行为。这一发现使得在小鼠中研究瘙痒变得困难。 相比之下，在一些颈部注射实验中，常见的致痛物辣椒素（capsaicin）反而减少了搔抓行为。因此，疼痛对搔抓行为的影响仍不明确。有必要建立一种能够同时通过行为学检测来研究瘙痒与疼痛感知的方法。本文介绍了一种面颊注射模型，可用于同步测量与疼痛和瘙痒相关的行为。在该模型中，致痒物引发搔抓行为，而致痛物则引发擦拭行为。利用该模型发现，在伴有瘙痒的胆汁淤积患者中发现的瘙痒介质溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid, LPA）仅诱发瘙痒反应，而不引起疼痛反应。然而，在小鼠模型中，LPA 既被报道为致痒物，也被报道为致痛物。在小鼠面颊注射模型中对 LPA 作用的进一步研究显示，LPA 仅引发搔抓行为，而不引发擦拭行为。这表明 LPA 在小鼠与人类中均作为致痒物发挥作用，同时也证明了面颊注射模型在瘙痒研究中的应用价值。 关键词：面颊注射模型，瘙痒，疼痛，LPA，搔抓行为，擦拭行为，致痒物，致痛物
引言
瘙痒最初被定义为一种能够引发搔抓行为的感觉，以清除皮肤表面的有害物质。然而，近年来瘙痒已成为多种疾病所引起不适感的治疗焦点，例如特应性皮炎、神经源性病变以及胆汁淤积1。在这些情况下，瘙痒是一种与疼痛类似的严重不适感，因此瘙痒成为一个重要的研究目标。在动物实验中，搔抓行为是评估瘙痒的主要指标，通过将致痒物注射到小鼠颈部皮肤可诱发其搔抓行为2,3。然而，先前的研究表明，辣椒素（一种致痛物）在颈部注射模型中也能诱发搔抓行为4，这使得在此模型中难以区分瘙痒与疼痛。 相反，另有研究发现，辣椒素在颈部注射模型中反而减少了搔抓行为，表明疼痛对搔抓行为的影响较为复杂，且依赖于实验条件。 因此，同时测量与疼痛和瘙痒相关的行为将有助于对致痒物和致痛物进行精确分析。Steven G. Shimada 和 Robert H. LaMotte 通过将注射部位从颈部改为面部颊区，成功实现了对疼痛与瘙痒相关行为的同步测量4。在颊区注射模型中，辣椒素仅诱发擦拭行为而不引起搔抓行为，而组胺（一种致痒物）则仅诱发搔抓行为。因此，该模型能够独立评估瘙痒与疼痛，使颊区注射成为瘙痒研究中一种有效的实验模型。当需要判断某种待测物质是否为致痒物和/或致痛物时，该模型所提供的信息比颈部注射模型更为丰富。本文介绍了一种实施颊区注射及记录搔抓或擦拭行为次数的实用方法，并展示了该方法在评估溶血磷脂酸（LPA）诱发的搔抓行为中的应用价值。
方案
所有涉及动物护理与使用的操作均经日本自然科学研究机构机构动物护理与使用委员会（16A074）批准，并依照生理学研究所的指南实施。
注意： 原始实验方案由 Steven G. Shimada 和 Robert H. LaMotte4 首次报道，本报告描述了对该方法的若干修改，包括增加隔板以防止动物相互看见、移除镜子、每组记录的小鼠数量、小鼠品系、笼具尺寸以及记录时间。
1. 颊部注射模型
- 实验准备
- 笼具
- 如图1所示，在摄像机下放置四个笼具。设置挡板以防止小鼠相互看见。将每只小鼠放入各自的笼具中，并加盖亚克力盖子以防止小鼠逃逸。请注意，录像应在温度、湿度和声音均受控的环境中进行。
注意：若笼具足够高，也可不加盖子进行录像。
- 如图1所示，在摄像机下放置四个笼具。设置挡板以防止小鼠相互看见。将每只小鼠放入各自的笼具中，并加盖亚克力盖子以防止小鼠逃逸。请注意，录像应在温度、湿度和声音均受控的环境中进行。
- 针头和注射器
- 使用连接0.5 mL注射器的29 G或30 G针头注射测试物质。如果测试物质溶液黏度较高，则需要使用更大的针头。但请注意，较大的针头可能带来额外的物理副作用。
注意：可通过聚乙烯管将针头与注射器连接后使用。
- 使用连接0.5 mL注射器的29 G或30 G针头注射测试物质。如果测试物质溶液黏度较高，则需要使用更大的针头。但请注意，较大的针头可能带来额外的物理副作用。
- 视频摄像机
- 使用具有足够高帧率（30–60 帧/秒）和相对高分辨率的视频摄像机，以准确测量搔抓发作和擦拭行为。
- 视频分析软件
- 使用视频编辑软件进行视频回放和分析。请注意，精确分析需要具备快进模式和逐帧播放模式。
- 笼具
图 1：摄像机与笼具装置示意图。 使用四个带亚克力盖子的亚克力笼子，以防止小鼠逃逸，并使用屏幕隔板防止传染性瘙痒传播。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 注射与记录
- 实验前一天，使用毛发修剪器剃除小鼠脸颊部位的毛发（视频 1）。剃毛前，不要对小鼠进行束缚。
注意：本模型中主要使用 CD-1 或 C57BL/6 小鼠4,5。本文中使用的是雄性 6–12 周龄的 C57BL/6N 小鼠。请注意，不同品系小鼠对化学物质的敏感性可能存在差异3,6,7。 - 剃毛后一天，将小鼠转移至记录笼中适应 1 小时，以适应记录环境。若采用局部给药方式，可在该适应期间给药。
注意：本报告中，在记录前 30 分钟局部给予 10 μL 含 2%（w/v）盐酸苯海拉明的生理盐水溶液。 - 在笼子上方架设视频摄像机，并在注射测试物质前开始录像。在清醒状态下，将 10 μL 测试物质溶液皮内注射至剃毛后的脸颊部位（视频 2）。注射后，将小鼠放回记录笼中。
注意：本报告中使用的测试物质包括：50 μg/10 μL 组胺、40 μg/10 μL 辣椒素或溶剂对照（生理盐水中含 7% Tween 80）。 - 盖上笼盖，持续录像 30 分钟。
注意：总记录时间取决于具体的实验条件。
- 实验前一天，使用毛发修剪器剃除小鼠脸颊部位的毛发（视频 1）。剃毛前，不要对小鼠进行束缚。
- 行为学分析
- 分别统计搔抓发作次数和擦拭行为次数。小鼠会抬起后肢朝向脸颊，在一至数秒内多次搔抓，随后放下后肢。这一系列动作为一次搔抓发作。其他部位的搔抓不应计入。小鼠使用单侧前肢进行擦拭，使用双侧前肢进行理毛行为，应区分两者。仅将擦拭行为计为与疼痛相关的行为。
注意：每种行为分别见于 图 2、视频 3、视频 4 和 视频 5。
- 分别统计搔抓发作次数和擦拭行为次数。小鼠会抬起后肢朝向脸颊，在一至数秒内多次搔抓，随后放下后肢。这一系列动作为一次搔抓发作。其他部位的搔抓不应计入。小鼠使用单侧前肢进行擦拭，使用双侧前肢进行理毛行为，应区分两者。仅将擦拭行为计为与疼痛相关的行为。
图 2：记录期间典型的小鼠活动。图 A-C 为示意图，分别表示用右前肢进行擦拭行为（A）、用右后肢进行抓挠行为（B）以及用双前肢进行理毛行为（C）。小鼠会将一只后肢抬向脸颊，并在一秒或数秒内连续抓挠数次，然后放下该后肢。这一系列动作为一次抓挠发作，应计为一次。其他部位的抓挠不应计入。小鼠使用单侧前肢进行擦拭，使用双前肢进行理毛，这些行为应加以区分。仅将擦拭行为计为与疼痛相关的行为。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 颈部注射模型
- 注射与记录
- 实验前一天，用剃毛器在小鼠颈部背侧剃毛，剃毛前先通过吸入约5%的异氟烷2-3分钟使小鼠短暂麻醉。
- 剃毛后一天，将小鼠转移至记录笼中，适应记录环境1小时。
- 在笼子上方架设视频摄像机（图1），在注射测试物质前开始视频记录。在清醒状态下，将10 μL测试物质溶液皮内注射至剃毛区域的颈部皮肤。注射后，立即将小鼠放回记录笼中。
注意：本文中使用的测试物质包括：50 μg/10 μL组胺、10 μg/10 μL或40 μg/10 μL辣椒素，或对照溶剂（生理盐水中含7%吐温80）。 - 盖上笼盖，继续视频记录30分钟。
注意：总记录时间可根据具体实验条件进行调整。
- 行为学分析
- 统计搔抓发作行为。小鼠会将后肢抬向颈部，持续搔抓数秒（一次或多次），随后放下该后肢。这一系列动作为一次搔抓发作。搔抓其他部位的行为不应计入。
注意：搔抓动作与颊部注射模型中的行为相似，区别在于搔抓部位转移至颈部。
- 统计搔抓发作行为。小鼠会将后肢抬向颈部，持续搔抓数秒（一次或多次），随后放下该后肢。这一系列动作为一次搔抓发作。搔抓其他部位的行为不应计入。
结果
在颈部注射模型中，组胺诱导了强烈的搔抓行为（图3）。溶剂对照（生理盐水中含7%吐温80）也诱导了搔抓行为。先前有报道称，洗涤剂可通过角质形成细胞产生组胺来诱导瘙痒8。吐温80可能通过类似机制诱导瘙痒，而辣椒素则减少了溶剂对照诱导的搔抓行为，这与之前的一项报道相反4。小鼠品系的差异可能是导致这些不同结果的原因。这些发现表明，疼痛对搔抓行为的影响较为复杂。因此，同时测量与疼痛和瘙痒相关的行为可能有助于对致痒物和致痛物进行精确分析。在面部注射模型中，辣椒素未诱导搔抓行为，仅诱导了擦拭行为，后者被认为与疼痛相关9,10,11（图4）。辣椒素注射还增加了理毛行为（数据未显示）。在面部注射后，组胺主要诱导搔抓行为，仅伴有微弱的擦拭行为。使用抗组胺试剂苯海拉明可抑制搔抓行为。该结果提示，组胺诱导的搔抓行为是由组胺作用于组胺受体所引起的。此处以溶血磷脂酸（LPA）在面部注射模型中的作用为例进行说明（图5）。LPA是在伴有瘙痒的胆汁淤积患者中发现的一种瘙痒介质。然而，在小鼠模型中，LPA曾被报道既可作为致痒物，也可作为致痛物12,13,14,15。因此，本研究在面部注射模型中考察了LPA的作用，结果显示LPA可诱导搔抓行为，但不诱导擦拭行为。这表明，在小鼠中LPA是一种致痒物，而非致痛物，与其在人体中的作用相似。
图 3：组胺和辣椒素在颈部注射模型中的效应。（A）通过颈部注射给予溶剂（生理盐水中含7% Tween 80，空心方块）、组胺（每部位50 μg/10 μL，实心圆点）或辣椒素（每部位10 μg/10 μL，空心三角形；每部位40 μg/10 μL，实心三角形）后，每5分钟评估一次诱导的搔抓行为，持续30分钟。（B）对A图中30分钟期间搔抓行为的定量分析。∗∗P < 0.01，采用单因素方差分析（ANOVA）并进行Bonferroni校正。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示（n = 6–8）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：瘙痒原和致痛原在颊部注射模型中的作用。 向小鼠右侧颊部注射溶剂（生理盐水中含7%吐温80，空心方块）、组胺（50 μg/10 μL 每位点，实心圆）或辣椒素（40 μg/10 μL 每位点，实心三角）后，每5分钟记录一次擦拭（A）和搔抓（B）行为，持续30分钟。空心圆所示组在注射组胺（50 μg/10 μL 每位点）前30分钟，经皮给予10 μL 2% (w/v) 盐酸苯海拉明（DHHCL）；DHHCl溶于生理盐水中。对A和B图中30分钟内的擦拭（C）和搔抓（D）行为进行定量分析；每组n = 8只动物。∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，采用单因素方差分析（ANOVA）并进行Bonferroni校正。数据表示为均值 ± 标准误（SEM）。 请点击此处查看本图的放大版本。
图5：LPA在小鼠面部注射模型中诱导抓挠行为，但不诱导擦拭行为。 向小鼠右侧面部注射溶剂对照（生理盐水，空心方块）或LPA（100 nmol/10 μL 每位点，实心圆点）后，每5分钟记录一次抓挠（A）和擦拭（B）行为，持续30分钟。对A和B图中30分钟内的抓挠（C）和擦拭（D）行为进行定量分析；溶剂组n = 17，LPA组n = 20。∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，采用Welch's t 检验。数据以均值 ± 标准误表示。该图改编自Kittaka等人的研究5。 请点击此处查看此图的放大版本。
视频 1：演示如何剃除小鼠颊部毛发的视频。 请点击此处观看视频。（右键可下载。）
视频 2：展示对小鼠颊部进行注射的视频。 请点击此处观看视频。（右键可下载。）
视频 3：展示典型擦拭行为的视频。 本视频以 25% 的速度播放。请点击此处观看视频。（右键单击可下载。）
视频 4： 典型抓挠行为的视频。 请点击此处观看该视频。（右键单击可下载。）
视频 5：典型理毛行为的视频。 本视频以25%的速度播放。请点击此处观看该视频。（右键可下载。）
讨论
本文介绍了一种颊部注射模型，并证明其可用于分析与疼痛和瘙痒相关的行为。
先前有报道称，致痛物质在小鼠颈部注射模型中可诱导抓挠行为4。相比之下，辣椒素在其他颈部注射实验中却减少了抓挠行为（图3）。因此，疼痛对抓挠行为的影响仍不明确。因此，有必要开发一种可通过行为学测试同时研究疼痛与瘙痒的方法。通过使用颊部注射模型，可评估一种物质对疼痛和瘙痒的双重作用。
先前已有报道称，细胞内LPA可直接激活TRPV1和TRPA1，作为LPA诱导瘙痒的一种机制5。因此，LPA诱导的瘙痒可能是组胺非依赖性的。之前一项研究还表明，面部颊部注射模型可用于评估组胺非依赖性瘙痒16。因此，该模型既可用于组胺依赖性瘙痒，也可用于组胺非依赖性瘙痒的研究。
本实验的关键步骤之一是注射。由于这是急性行为学测试，注射步骤中不能使用麻醉，因为麻醉可能会影响这些行为。因此，需要牢固地固定小鼠，以确保注射的准确性。当固定不牢时，尤其是在注射强效致痛物质时，小鼠可能会挣扎，导致注射体积和深度不准确，进而影响实验结果的解读。在操作小鼠时，应用拇指和食指捏住其颈背部皮肤，以限制小鼠的活动。
另一个关键步骤是行为学分析。由于搔抓动作非常迅速，需要仔细观看视频。此外，擦拭行为可能难以与理毛行为区分。因此，建议在首次实验中使用辣椒素等阳性对照化学物质。录制和回放条件也可能影响两种行为的计数。如果难以清晰观察行为表现，可在笼具周围使用镜子以扩大观察角度4。
需要注意的是，与颈部注射模型相比，脸颊注射模型对受试化学物质的定量准确性可能有所降低。如图3和图4所示，相同剂量的组胺在颈部模型中诱发的搔抓行为多于脸颊模型，且颈部注射模型的结果变异较小。当通过脸颊注射模型已证实某种受试物质具有致痒性且致痛效应较弱时，建议采用颈部注射模型进行进一步的定量分析。尽管存在这些局限性，脸颊注射模型仍适用于对受试物质进行精确评估，尤其在瘙痒研究领域具有重要价值。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢耶鲁大学医学院（康涅狄格州）的Steven G. Shimada博士和Robert H. LaMotte博士，本技术借鉴了他们的方法（参考文献4）。我们还感谢宫原健太郎先生绘制了小鼠示意图。本研究得到了日本文部科学省科学研究费补助金（No. 15H02501 和 No. 15H05928，授予M.T.；No. 16K21691，授予H.K.）以及上原纪念基金会（授予H.K.）的资助。 我们感谢LaMotte教授在耶鲁大学对颊部注射方法的介绍。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 辣椒素 | Sigma | M2028 | |
| 盐酸苯海拉明 | Wako | 044-19772 | |
| 组胺 | Sigma | H7125 | |
| iMovie | Apple | ||
| 溶血磷脂酸 | Avanti Polar Lipids | 325465-93-8 | |
| Myjector | Terumo | ss-05M2913 | |
| 吐温-80 | Sigma | P4780 | |
| 摄像机 | Panasonic | VX985M |
参考文献
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