利用导航经颅磁刺激对踝部肌肉皮质脊髓通路的双侧评估

摘要

本实验方案描述了使用单脉冲经颅磁刺激结合神经导航系统，在静息状态和紧张性自主激活期间对胫骨前肌和比目鱼肌的皮质运动反应进行同步双侧评估的方法。

摘要

远端下肢肌肉通过皮质脊髓束接收来自运动皮层区域的神经输入，皮质脊髓束是人类主要的运动下行通路之一，可通过经颅磁刺激（TMS）进行评估。鉴于远端下肢肌肉在直立姿势维持和动态任务（如行走）中的重要作用，过去十年中，针对与这些肌肉功能相关的皮质脊髓束的评估与调控研究日益增多。然而，既往研究中所采用的方法学参数存在较大差异，导致横断面与纵向研究结果的解释性降低。因此，采用一种专门针对下肢肌肉皮质运动反应（CMR）评估的标准化TMS方案，将有助于在不同研究和队列间直接比较结果。本文旨在介绍一种标准化实验方案，该方案利用单脉冲TMS结合神经导航系统，具备灵活性，可同时评估胫骨前肌与腓肠肌这两块主要踝关节拮抗肌的双侧皮质运动反应。本方案适用于被检肌肉处于完全放松状态，或以最大等长自主收缩力的特定百分比进行等长收缩的状态。结合每位受试者的结构磁共振成像（MRI）数据并利用神经导航系统，可确保在评估过程中将刺激线圈精准定位在下肢皮层代表区。鉴于目前皮质运动反应相关测量指标计算方法不一致，本方案还描述了采用自动化算法对这些指标进行标准化计算的方法。尽管本方案并非在直立姿势或动态任务中实施， 可用于评估神经功能正常或受损受试者双侧任意一对腿部肌肉，无论是拮抗肌还是协同肌。

引言

胫骨前肌（TA）和比目鱼肌（SOL）是位于小腿前部和后部肌室的踝关节拮抗肌。这两块肌肉均为单关节肌，其中TA和SOL的主要功能分别是使距小腿关节背屈和跖屈¹。此外，TA在肌肉大范围运动中功能更为重要，而在力量产生方面作用较小；而SOL则是一种抗重力肌，适合在肌肉小范围运动时产生较大力量²。在直立姿势维持和动态活动中（例如，行走），这两块肌肉均具有特别重要的作用^3,4。在神经控制方面，这两块肌肉的运动神经元池通过运动下行通路接收来自大脑的神经驱动^5,6，同时还接受不同程度的感觉传入驱动。

主要的运动下行通路是皮质脊髓束，它起源于初级运动区、前运动区和辅助运动区，并终止于脊髓的运动神经元池^7,8。在人类中，可利用经颅磁刺激（transcranial magnetic stimulation, TMS）——一种非侵入性脑刺激工具——对这一通路的功能状态（皮质运动反应，corticomotor response, CMR）进行可行的评估^9,10。自从TMS技术引入以来，鉴于胫骨前肌（TA）和腓肠肌（SOL）在直立姿势任务和行走过程中的功能重要性，已在不同人群和任务中对它们的CMR进行了广泛研究^{11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32}。

与上肢肌肉CMR评估相比³³，目前尚未建立用于评估下肢肌肉皮质脊髓兴奋性的通用经颅磁刺激（TMS）方案。由于缺乏标准化的方案，且既往研究在方法学上存在较大差异（例如， 线圈类型、神经导航的使用、紧张性激活水平、测试侧别与肌肉、CMR指标的使用与计算方法 等等。），在不同研究和队列间对结果进行解读可能繁琐、复杂且不准确。由于这些测量指标在多种运动任务中具有功能相关性，建立专门针对下肢皮质运动表征（CMR）评估的经颅磁刺激（TMS）方案，将有助于运动神经科学家和康复科学家在不同实验会话及各类队列中系统地评估这些肌肉的皮质运动表征。

因此，本实验方案的目的是描述如何使用单脉冲经颅磁刺激（TMS）和神经导航系统对胫前肌（TA）和腓肠肌（SOL）的皮质肌反应（CMR）进行双侧评估。与以往研究相比，本方案通过采用一系列方法学因素，以优化实验的有效性和持续时间，并对这两个下肢肌肉的CMR评估进行标准化，从而最大限度地提高实验操作、数据采集和数据分析的严谨性。鉴于肌肉的CMR取决于该肌肉处于完全放松状态还是部分激活状态，本方案详细说明了如何在静息状态和强直性自主激活（TVA）条件下评估TA和SOL的CMR。下文将全面描述本实验方案的具体步骤。最后，将展示并讨论代表性数据。本文所述方案源自Charalambous et al. 2018³²。

方案

本方案中所述的所有实验操作均已获得当地机构审查委员会的批准，并符合《赫尔辛基宣言》的规定。

1. 知情同意流程与安全问卷

1. 在进行任何实验之前，向每位受试者说明研究的目的、主要实验步骤以及参与研究可能涉及的潜在风险因素。在回答受试者可能提出的任何问题或疑虑后，请受试者确认已了解知情同意过程，并签署知情同意书。
2. 实施MRI³⁴和TMS³⁵安全筛查问卷，以确保受试者符合MRI和TMS测试的安全性和资格要求。任何不符合全部安全标准的受试者均应排除在MRI和TMS评估之外。

2. 磁共振成像及神经导航系统的准备

1. 在进行 TMS 评估之前先进行 MRI 评估³²。让受试者仰卧，膝下放置软垫以保持舒适体位。指导受试者在扫描过程中保持静止。
   1. 为受试者提供耳部保护，以减弱扫描仪产生的高噪声。优先使用耳塞而非耳罩，因为神经导航系统中需使用双侧耳前切迹进行受试者图像配准（见 5.2）。
   2. 获取高分辨率 T1 加权解剖脑图像（最低要求：1 mm 层厚，覆盖全脑及小脑），格式可为 NFTI 或 DICOM 文件。由于神经导航系统中需使用受试者鼻尖进行图像配准（见 5.2），需确保图像中完整包含鼻部。
2. 将 MRI 文件上传至神经导航系统。手动将每位受试者的 MRI 与前连合和后连合对齐，以便使用蒙特利尔神经学研究所图谱进行映射。
   1. 分别通过调整颅骨和脑组织周围的边界框，重建皮肤和完整的曲面脑模型。利用皮肤模型识别四个解剖标志点（鼻尖、鼻根——鼻梁交界处、左右耳的耳前切迹）（见 图 1A）。
   2. 在重建的曲面脑模型上，于每侧半球的下肢运动皮层区域上方放置矩形网格（见 图 1B）。将网格的中心行置于下肢运动皮层 gyrus 的中心上方，该区域是支配下肢运动神经元池的皮质脊髓束的起源处³⁶。将网格的内侧列平行且紧邻同侧半球的内侧壁。
   3. 采用基于皮层的方法，该方法中方向误差对刺激位点的影响可忽略不计³⁷，而非基于头皮定位的方法，后者中任何方向误差均可能改变刺激位点。使用此网格寻找热点。在运动映射中，可通过增加刺激点数量和/或增大点间距（例如，10 mm）来使用更大的网格。

3. 受试者准备与安置

1. 使用总共 4 个表面肌电图（EMG）电极，通过单脉冲经颅磁刺激（TMS）测量电生理反应。电极的准备和放置请遵循已发表的指南^38,39，并在受试者站立位时完成电极放置。
   1. 使用剃刀刮除电极放置区域的毛发，并用酒精棉片轻轻去除死皮细胞和油脂，以准备皮肤。
      注意：对于正在服用抗凝药物的受试者（例如，中风后患者），在皮肤准备过程中需谨慎操作，因为存在出血的潜在 风险。
   2. 在胫前肌（TA）双侧放置电极。受试者保持站立位，要求其将脚趾向上抬起，然后将电极置于腓骨头与内踝之间连线的上三分之一处（即，胫骨嵴外侧的肌腹位置）。
   3. 在腓肠肌（SOL）双侧放置电极。受试者保持站立位，要求其进行提踵动作，然后将电极置于股骨外侧髁与外踝之间连线的下三分之一处。
   4. 将接地参考电极放置于髌骨或外踝。根据肌电采集设备的要求，将接地电极置于双侧或单侧。
2. 测试电极的放置位置及信号质量。
   1. 通过要求受试者在直立姿势下进行踝关节背屈或跖屈动作，并在计算机屏幕上显示所有测试肌肉的原始 EMG 信号，来检查电极的放置位置（例如，是否存在清晰可辨的 EMG 爆发信号）。若发现电极位置不当，应移除并重新放置，直至出现清晰可辨的 EMG 爆发信号且背景噪声最小。足够的信噪比对于检测运动反应至关重要（> 50 µV）。
   2. 通过将 TMS 线圈远离静坐的受试者并让肌肉处于静息状态时，多次放电 TMS 设备，以测试信号质量（例如，基线噪声水平）。检查每个 EMG 通道的基线信号是否接近零（即，峰-峰值幅度应小于 50 µV，且无基线噪声，如 50 或 60 Hz 的电源干扰）。若某一通道存在基线噪声，应移除相应电极并重复皮肤准备步骤。若噪声仍然存在（即，峰-峰值幅度 > 50 µV），则调整参考电极的位置并更换导电膏。
3. 使用轻质泡沫预包扎带固定所有电极。在整个实验过程中定期检查，确保电极牢固附着且信号质量良好。
4. 让受试者坐在椅子上。为确保不同受试者脚部位置的一致性，将双脚固定在步行靴（即，踝足矫形器）中，该装置可将踝关节活动范围（ROM）调节至特定位置，并在 TVA 测试期间提供阻力。调整髋关节和膝关节角度，以避免受试者不适。指示受试者在整个实验过程中保持静止。如有条件，可使用固定在椅子上的前额支架，以在应用 TMS 时保持受试者头部稳定。

4. TVA 检测

1. 双侧测定每块肌肉的最大自主等长收缩力（MVIC）。针对每个动作（即， 背屈和跖屈），指导受试者最大程度地收缩对侧被检肌肉（例如， 右侧胫骨前肌（right TA）进行4次收缩（每次收缩约5秒，收缩间休息60秒），受试者保持上述坐姿。
2. 计算每次最大自主等长收缩（MVIC）期间的最大肌肉活动值即， 以最后三次试验中整流并平滑后EMG最大值为中心的100毫秒时间窗内的平均值、这三个值的平均值，以及每块肌肉平均最大自主等长收缩（MVIC）值的15 ± 5%。
   注意：可以使用更大的最大自主等长收缩百分比（% MVIC），但在临床队列中可能难以实现例如， 卒中后人群。

5. 神经导航系统中的注册

1. 将带有反射标记的受试者追踪装置（头带或眼镜）佩戴于受试者头部，位于受刺激半球对侧，以确保在对每个网格位点进行刺激时，追踪装置不会妨碍线圈的定位。
   注意：如果使用头带，应确保其紧贴受试者头部，但不可过紧，以免长时间佩戴后引起头痛。
2. 通过将受试者追踪器、探针和线圈追踪器放置在捕捉范围空间内，验证动作捕捉相机的正确位置。通过将探针尖端置于4个解剖标志点上，执行受试者-图像配准（参见 图1A).
3. 当所有解剖标志点采集完毕后，通过将探针尖端放置在受试者颅骨上的多个位置，验证配准是否准确即， 验证阶段）。若指针尖端与重建皮肤之间的距离小于3 mm，则进行TMS实验；否则，重复受试者-图像配准，直至达到预期的误差值。实验过程中，若受试者追踪器意外移动，需重新进行配准。

6. 经颅磁刺激（TMS）

1. 在静息状态和TVA期间使用相同的实验参数。
   1. 在最佳位点施加单脉冲刺激（即， 热点；有关更多细节，请参见下一段。每5-10秒随机施加一次刺激，以避免受试者预判刺激时机，并尽量减少前一次脉冲对后续脉冲的累积效应⁴⁰.
   2. 若同时使用两台经颅磁刺激（TMS）设备，请将设备设置为标准模式或同步模式⁴¹标准模式施加的脉冲弱于单个单位，而同步模式施加的脉冲强于单个单位。选择其中任意一种模式可依据实验方案的需求和刺激总数而定。
   3. 使用双锥形线圈诱导颅内从后向前的电流。如有必要，在每次刺激前使用神经导航系统手动控制线圈，并校正其相对于目标刺激位点的位置。
   4. 在不同测试会话和受试者之间，应随机化检测的肌肉和半脑顺序。为避免对静息状态下的测试产生干扰，TVAS 条件始终应在休息条件之后进行。例如， 由于TVA测试导致的下行通路疲劳。
2. 双侧确定两块肌肉的热点。
   1. 找到阈上强度，该强度将在热点定位过程中使用，方法是在靠近半球间裂隙的中心位置施加单次刺激（参见蓝色和红色方框） 图1B）。使用该位点，因为它位于腿部运动区的中枢位置^36,42.
   2. 从低强度开始（例如， 30% 最大刺激器输出（MSO），并以5%的增幅逐步增加经颅磁刺激强度，直至达到在对侧所有被检肌肉中连续3次刺激均能引出峰-峰波幅大于50 µV的运动诱发电位（MEP）的刺激强度。
   3. 每次刺激后，立即根据所有被检肌肉的原始波形及峰-峰振幅（搜索时间窗：TMS开始后20-60 ms）判断是否诱发出运动诱发电位（MEP）。
   4. 在网格的每个点上施加一次TMS脉冲（共36次刺激）。完成热点定位方案后，将所有对侧肌肉每个点的波幅和潜伏期数值导入电子表格，按波幅从高到低、潜伏期从低到高进行排序。将对侧TA和SOL的热点确定为网格中波幅最大且潜伏期最短的位置。⁴³.
      注意：如果最大振幅和最短潜伏期不在同一位置，则应以最大振幅的位置定义为热点。
3. 双侧分别测定每块肌肉的静息运动阈值（RMT）。
   1. 选择神经导航系统中与被检肌肉的热点相对应的网格点。
   2. 采用自适应阈值搜索法测定所检肌肉的RMT⁴⁴将初始强度和步长分别设置为45和6% MSO³²对每块肌肉重复进行两次RMT检测，并取平均值用于后续的CMR评估。
4. 在静息状态下双侧评估胫骨前肌（TA）和腓肠肌（SOL）的CMR。
   1. 在神经导航系统中选择与被检肌肉热点相对应的网格点。以被检肌肉1.2倍静息运动阈值（RMT）的强度施加10次单脉冲经颅磁刺激（TMS）。
   2. 每次刺激前，指导受试者保持静止，并双侧放松待检测的肌肉，同时通过计算机屏幕上的实时视觉反馈监测所有肌肉的活动。若在经颅磁刺激（TMS）前或后发现任何肌肉处于激活状态，则舍弃该次试验，并额外施加一次单脉冲刺激。重复此过程，直至在静息状态下为每侧对侧检测肌肉均采集到10个有效波形。
5. 在TVA期间双侧评估胫骨前肌（TA）和腓肠肌（SOL）的CMR。
   1. 选择神经导航系统中与被检肌肉的热点相对应的网格点。
   2. 要求受试者以15 ± 5%最大自主等长收缩力（MVIC）收缩被检肌肉，并施加10次单脉冲经颅磁刺激（TMS），刺激强度为1.2倍静息运动阈值（RMT）。指导受试者将被检肌肉（胫前肌或腓肠肌）的平滑移动线（0.165秒的均方根振幅）保持在两条水平游标线之间（MVIC范围：15 ± 5%），并在此水平持续收缩数秒。
   3. 当检测肌肉为胫骨前肌（TA）时，要求受试者用对侧腿的足部轻微向上拉紧绑带即， 被检肌肉所在腿部与受刺激半球对侧）。当被检肌肉为腓肠肌（SOL）时，要求受试者轻微向下蹬对侧腿的足靴。
   4. 使用计算机屏幕上的实时视觉反馈显示，监测被检主动肌肉以及其余静息肌肉的肌电活动。如果被检肌肉的活动水平低于或高于预设范围，或任何其他肌肉被激活，则舍弃该次刺激，并再次施加一次额外的单脉冲刺激。在被检肌肉的活动维持于预设范围内的条件下，采集10次有效试验。

7. 数据分析

1. 对于除RMT外的所有CMR指标，需根据每个MEP扫描中各肌肉的测量值（总时长应至少为500 ms，其中刺激前至少100 ms）进行计算，然后将这10个值取平均，得到单一数值即， 平均值³²振幅和皮质静息期（CSP）是皮质脊髓反应（CMR）兴奋性的间接测量指标，而潜伏期则是CMR连接性的间接测量指标。在静息状态和胫前肌（TVA）检测中，均应根据每位受试者的身高对潜伏期进行标准化校正，因为潜伏期受至被检肌肉距离的影响。⁴⁵.
2. 计算静息状态下的运动诱发电位（MEP）振幅和潜伏期。
   1. 根据原始肌电图（EMG）计算振幅（µV），方法为取正向波峰与负向波峰之间的最大差值（即， MEP 的峰峰值。对于这两个特定肌肉，在 TMS 开始后的 20–60 ms 时间窗内搜索峰峰值。
      警告：尽管20-60毫秒的MEP搜索时间窗可能适用于神经系统完整的受试者和中风后患者，但对于某些个体可能需要更宽的MEP搜索时间窗（例如， 20-75 毫秒）可能适用于其他神经学人群（例如， 多发性硬化症
   2. 根据经颅磁刺激（TMS）开始至运动诱发电位（MEP）起始之间的时间，从整流后的肌电图（EMG）计算潜伏期（ms）（即， 校正后肌电图信号首次越过预设阈值的时间点——即刺激前100毫秒肌电图信号均值加三个标准差^32,46.
3. 在TVA期间计算MEP振幅、潜伏期和CSP。
   1. 根据原始肌电图（EMG）计算振幅（µV），方法为取正向波峰与负向波峰之间的最大差值（即， MEP 的峰峰值。对于这两个特定肌肉，在 TMS 开始后的 20–60 ms 时间窗内搜索峰峰值。
   2. 根据整流后的肌电图（EMG），从经颅磁刺激（TMS）开始至运动诱发电位（MEP）出现之间的时间计算潜伏期（ms）。
      1. 在TVA中的MEP起始时间计算方式与静息状态不同。通过确定整流后EMG信号轨迹穿过预设阈值的两个时间点来计算MEP的起始和终止时间，该阈值设定为刺激前100 ms期间平均EMG水平。然后，在这两个时间点之间寻找至少高于刺激前EMG均值加三个标准差的峰值。接着，从第一个峰值开始向前搜索至该峰值前50个数据点（采样率为5000 Hz）范围内，查找整流后EMG信号轨迹首次穿过刺激前EMG均值阈值的时间点。将该时间点定义为MEP起始时间。³².
   3. 根据整流后的肌电图（EMG）计算CSP（毫秒），即从运动诱发电位（MEP）消失到肌电活动恢复之间的时间间隔即， 绝对CSP：排除MEP持续时间⁴⁷从最后一个峰开始，向后搜索该峰之后200个数据点（采样率为5000 Hz）内，整流后的EMG信号最后一次穿过刺激前EMG均值阈值的时间点；将该时间点定义为MEP终止时间。随后，计算基线EMG的恢复时间，即整流后的EMG信号最后一次穿过刺激前EMG均值25%的时间点。³².

结果

图2-4展示了一名具有代表性的神经系统完整、身高和体重分别为178 cm和83 kg的31岁男性受试者的数据。

图2展示了每侧踝部肌肉的双侧热点位置及静息运动阈值（RMT）。通过使用位于每个半球腿部区域中心的位点（见图1B中的方框），以45%最大输出强度（MSO）在双侧进行热点定位。各肌肉的热点位置在两个半球之间有所不同，但如预期所示，所有四个热点均位于下肢运动皮质区域。该结果表明，胫骨前肌（TA）与腓肠肌（SOL）可能并不共享相同的热点；因此，每块肌肉的皮质映射反应（CMR）评估应使用其各自肌肉的热点，而非对两块肌肉使用同一热点。采用自适应阈值搜索法，分别测定每块肌肉的双侧RMT。用于RMT测定的刺激次数为6至22次。每块肌肉两侧RMT值之间的差异介于1%至3% MSO之间。综合这些结果提示，采用自适应阈值搜索法是一种高效且变异性较低的踝部肌肉RMT测定方法。此外，所有RMT值均低于用于热点定位的刺激强度（图2中的虚线）...

讨论

鉴于人们日益关注运动皮层在不同人群执行动态任务时对腿部肌肉运动控制的贡献，亟需一种标准化的经颅磁刺激（TMS）方案，以全面评估这些肌肉的功能。因此，本方案首次提供了利用单脉冲TMS结合神经导航技术，在两种肌肉状态（静息态和持续性自主收缩态）下对双侧踝部拮抗肌——腓肠肌（SOL）和胫骨前肌（TA）——进行评估的标准化方法学流程。

代表性结果部分所述的发现指出了几个需要考虑的关键步骤。首先，对这些肌肉以及其他腿部肌肉进行心脏磁共振（CMR）评估时，应使用神经导航系统，该系统需基于每位受试者的磁共振成像（MRI）数据，并确定每块肌肉的热点区域。神经导航可引导经颅磁刺激（TMS）精准作用于目标运动区域，当使用受试者个体化的MRI数据时，能够准确刺激目标运动区。^56,57先前的研究探讨了在使用经颅磁刺激（TMS）评估上肢肌肉时应用神经导航的影响。^58,59

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 台 Magstim 刺激器（Bistim 模块）	The Magstim Company Limited；英国惠特兰		用于诱发胫骨前肌和比目鱼肌的双侧运动诱发电位。
经颅磁刺激自适应参数估计序贯测试法（PEST）	http://www.clinicalresearcher.org/software.htm		用于确定运动阈值。
放大器	Motion Lab Systems；美国路易斯安那州巴吞鲁日	MA-300	用于放大肌电图（EMG）数据。
数据采集单元	Motion Lab Systems；美国路易斯安那州巴吞鲁日	Micro 1401	用于采集肌电图（EMG）数据。
双锥形线圈	The Magstim Company Limited；英国惠特兰	货号：9902AP	用于诱发胫骨前肌和比目鱼肌的双侧运动诱发电位。
Polaris	Northern Digital Inc.；加拿大安大略省滑铁卢		用于追踪位于受试者跟踪器和线圈跟踪器上的反光标记。
Signal 软件	Cambridge Electronics Design Limited；英国剑桥	版本 6	用于在静息状态和 TVA 期间采集运动诱发电位。
单个双差分表面肌电电极	Motion Lab Systems；美国路易斯安那州巴吞鲁日	MA-411	用于记录肌电信号。
无框架立体定向经颅磁刺激神经导航系统	Brainsight 3，Rouge Research， 加拿大蒙特利尔		用于在经颅磁刺激评估过程中引导线圈定位。
步行靴（Walker boot）	Mountainside Medical Equipment，纽约州马西		用于稳定踝关节。