本文详细描述了从自动化微载体生物反应器收获的细胞培养液（HCCF）中纯化单克隆抗体并进行后续分析的实验方案。同时介绍了如何利用分析方法测定关键质量属性（CQAs），以及如何最大限度地利用有限的样品体积以获取关键信息。
本文内容
摘要
摘要
单克隆抗体（mAb）是目前生产最广泛且表征最充分的生物制品之一。这类抗体通常使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行生产，需优化培养条件和工艺参数，以最大化抗体滴度并达到目标质量特征。通常，该优化过程采用自动化微尺度生物反应器（15 mL）并行筛选多种工艺条件。优化标准包括细胞培养性能以及单克隆抗体（mAb）产品的关键质量属性（CQAs），这些属性可能影响其疗效与安全性。培养性能指标包括细胞生长和营养物质消耗，而关键质量属性则包括mAb的N-糖基化和聚集特征、电荷变体以及分子量。本详细实验方案描述了如何纯化并分析由自动化微型生物反应器系统产生的收获细胞培养液（HCCF）样品，以获得有价值的性能指标和结果。首先，采用自动化蛋白A快速蛋白液相色谱（FPLC）方法从收获的细胞培养样品中纯化mAb。纯化浓缩后，利用特定平台通过质谱法分析糖链谱型（参见材料表）。抗体分子量和聚集特征通过尺寸排阻色谱-多角度激光散射（SEC-MALS）测定，电荷变体则通过微芯片毛细管区带电泳（mCZE）进行分析。除了在生物反应器运行过程中采集的培养性能数据（如培养物活力、细胞计数，以及谷氨酰胺、葡萄糖、乳酸和氨等常见代谢物），还对使用后的培养基进行分析，以鉴定限制性营养成分，从而优化补料策略和整体工艺设计。因此，本文还描述了一种通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）对使用后培养基中氨基酸进行绝对定量的详细实验方案。本方案所采用的方法利用了高通量平台，适用于大量小体积样品的分析。
引言
蛋白质治疗药物正被用于治疗越来越多的疾病，包括组织移植并发症、自身免疫性疾病和癌症1。自2004年以来，美国食品药品监督管理局（USFDA）记录显示，在药品评价与研究中心（CDER）监管的所有批准中，生物制品许可申请（BLA）所占比例持续上升，2014年和2015年BLA占比已超过25%2。
鉴于这一不断扩大的市场，生物制药生产商面临着在保证质量一致的前提下快速提供更多产品的挑战。为提高产品产量，研究主要集中在CHO细胞工程和生产线筛选上，但迄今为止最显著的改进主要归功于制造过程中培养基/补料策略优化以及细胞培养环境控制方面的进展1,3,4,5。
由于单克隆抗体（mAbs）是在生物系统中生产的，因此可能存在固有的蛋白质变异。抗体的组成可能在翻译后发生改变，例如发生糖基化，或受到降解或酶促反应的影响。这些结构上的变化可能引发危险的免疫反应，或改变抗体的结合能力，从而降低甚至消除其预期的治疗功能5。因此，在生产过程中采用质量源于设计（Quality by Design, QbD）的方法，常规监测和控制单克隆抗体的关键质量属性（CQAs），包括N-糖型谱、电荷变体分布以及单体形式抗体的百分比1,6。在受监管的生产环境中，治疗性蛋白质必须符合既定的可接受标准，才能被批准作为上市药品7。本文所介绍的方法通常用于抗体的质量表征过程7,8，任何蛋白质领域的科研人员都应熟悉这些方法的应用。
在先前的研究中9，已描述了微生物反应器在上游生物加工过程中用于细胞培养条件高通量筛选的应用与操作。从不同培养基条件下获得的纯化产物通过液相色谱-质谱法（LC-MS）进行N-糖链分析。利用LC-MS技术可检测并表征治疗性蛋白质的糖基化模式10,11，并且多种糖链种类的存在已被证实与补料策略、pH值和温度等生物工艺参数相关12。通过尺寸排阻色谱-多角度激光散射法（SEC-MALS）评估不同培养基条件对产品质量的影响，该影响以单体形式IgG的百分比作为指标13,14,15。电荷变体谱型代表了一系列可能影响产品功能的修饰16。微毛细管区带电泳（mCZE）是一种相较于传统阳离子交换（CEX）色谱和用于电荷变体分析的毛细管等电聚焦（cIEF）方法具有显著更短分析时间的技术17,18。对使用后的生物反应器培养基进行分析，以追踪蛋白质生产过程中氨基酸的消耗情况，进而关联抗体识别特征的变化19,20,21,22,23。
蛋白质分析技术能够基于工艺输入与关键质量属性（CQA）变化之间的关系，识别关键工艺参数（CPP）。在生物工艺开发过程中，识别并测定关键工艺参数是证明工艺可控性的基础，同时确保产品未发生改变，这在受到严格监管的生产环境中至关重要。本文介绍了用于测定与产品质量属性最相关的一些蛋白质生化特性的分析方法，包括N-糖型谱、电荷变体和分子大小均一性。
方案
1. 抗体纯化
注意：自制抗体的平衡缓冲液为 25 mM Tris、100 mM NaCl，pH 7.5。洗脱缓冲液使用 0.1 M 乙酸。缓冲液和树脂（Protein A）的选择取决于具体纯化的抗体。柱体积相当于树脂的床高度。流动相的使用量以柱体积为单位确定。
- 启动纯化系统
- 打开与纯化系统连接的软件。根据手动操作指令，以 2 mL/min 的流速用平衡缓冲液对色谱柱进行 40 分钟的平衡。平衡完成后停止手动运行。
- 在馏分收集器中放置 15 mL 锥形管用于收集纯化后的抗体洗脱液，放置 50 mL 锥形管用于在高盐洗涤过程中收集穿流液。确保在运行开始前通过打开并关闭馏分收集器，将其重置至起始位置。馏分收集器维持在 7 °C。
注意：可在软件的 设置 菜单下的 馏分收集器 选项卡中手动重置馏分收集器，适用于 15 mL 和 50 mL 锥形管。
- 样品进样
注意：后续步骤中使用的收获细胞培养液来自在中国仓鼠卵巢细胞中培养的自动化微型生物反应器9。- 将经 0.22 µm 滤膜过滤的收获细胞培养液加入一个喷嘴端已封帽的空 12 mL 注射器中。
- 手持注射器使喷嘴朝下，插入活塞直至其一小部分进入注射器内。确认液体无泄漏后，将注射器翻转使喷嘴朝上，并取下封帽。
- 继续保持喷嘴朝上，推动注射器筒体排出所有空气，直至细胞培养液到达喷嘴尖端。将注射器喷嘴插入纯化系统的手动进样口并旋转固定。
- 下压活塞，直至所有样品完全注入，并可在连接的 10 mL 大体积进样环中观察到样品。
- 打开已保存的方法文件。在提示时保存结果文件至指定位置并命名。在样品注入大体积进样环后，点击 运行。
- 运行纯化方法
- 选择已保存的方法，当仪器软件提示时点击运行（步骤 1.2.5）。
注意：系统已设定自动执行以下步骤。仪器运行期间用户无需进行任何操作。 - 以 2 mL/min 的流速使用三倍柱体积（CVs）的平衡缓冲液对色谱柱进行平衡。色谱柱平衡完成后，系统将通过大体积进样环以 1 mL/min 的流速将样品上样至色谱柱。
- 280 nm 处的紫外信号下降表明样品上样完成。随后以 2 mL/min 的流速用平衡缓冲液洗涤色谱柱，直至紫外信号降至 25 mAU 以下。
- 以 pH 7.5 的 25 mM Tris 缓冲液含 1 M NaCl，按 2 mL/min 的流速使用四倍柱体积（CVs）进行二次高盐洗涤。系统馏分收集器将收集盐洗过程中从柱上洗脱的任何蛋白/DNA 至 50 mL 管中。
- 以 1 mL/min 的流速施加五倍柱体积（CVs）的洗脱缓冲液，将抗体从色谱柱上洗脱。根据紫外信号收集洗脱液至 15 mL 管中：当 280 nm 紫外信号高于 35 mAU 时开始收集，信号降至 50 mAU 以下时停止收集；此过程称为峰切割。
注意：峰切割可确保洗脱曲线的标准化，并避免可能含有蛋白聚集体的洗脱峰拖尾24。 - 使用三倍柱体积（CVs）的平衡缓冲液洗涤色谱柱。洗涤步骤完成后运行结束。
- 洗脱后立即使用 1 M Tris 碱液将纯化蛋白中和至 pH ~5.5。使用微量紫外-可见分光光度计在 280 nm 和 260 nm 处测定蛋白浓度，并于 4 °C 保存。
- 使用离心浓缩装置浓缩纯化后的抗体（步骤 2）。随后对纯化抗体进行糖型分析（LC-MS），并进一步通过 SEC-MALS 分析其聚集特性（步骤 3 & 4）。
注意：纯化后的抗体若未进行缓冲液置换，不应冷冻保存，因反复冻融可能导致蛋白聚集和沉淀。
- 选择已保存的方法，当仪器软件提示时点击运行（步骤 1.2.5）。
2. 纯化抗体的浓度测定
注意：Tris-乙酸盐缓冲液是用 1 M Tris 碱将 0.1 M 乙酸中和至 pH 约为 5.5 而成。
- 将100 kDa滤膜插入离心管中。
- 用500 µL双蒸水洗涤滤膜，在室温下以14,000 x g 离心10分钟。重复此步骤两次，弃去滤过液。
- 将洗涤后的滤膜转移至新的离心管中，每管加入500 µL样品，在室温下以14,000 x g离心10分钟。
- 将滤膜倒置放入新的离心管中，以1,000 x g离心2分钟，以收集浓缩后的样品。
- 使用紫外-可见分光光度计测定样品浓度，以Tris-乙酸盐缓冲液作为空白对照。对于1%（m/v）的IgG溶液，在280 nm处采用蛋白质消光系数1.37 mL•(mg•cm)-1进行计算。
- 使用浓缩后的样品配制用于糖链分析的12.5 µL、2 mg/mL工作液，以及用于SEC-MALS分析的30 µL、3.5 mg/mL工作液。
注意：此时可暂停实验流程。样品应于4 °C冷藏保存。在2 mg/mL浓度下，样品在4 °C条件下至少可稳定保存三个月，而更高浓度的样品可能发生沉淀。
3. 使用质谱法分析N-糖链
- N-糖链标记与分离
- 以2 mg/mL的抗体浓度开始，使用适当的缓冲液，如中性磷酸钠、柠檬酸盐或HEPES缓冲液。同时制备2 mg/mL的完整单克隆抗体标准品（如NIST mAb），与实验样品一同处理，作为阳性对照。
注意：抗体应置于最终缓冲液中，缓冲液中不得含有SDS，且核亲体（如Tris、DTT、甘氨酸或组氨酸）浓度应低于0.1 mM。必须去除样品缓冲液中的SDS。若缓冲液中含有核亲体，则需将其稀释至足够低浓度或进行缓冲液置换，因其会干扰试剂盒的反应。糖链试剂盒中附有通用操作流程。 - 将7.5 µL抗体与15.3 µL试剂盒提供的LC-MS级水在1 mL离心管中混合稀释，随后加入6 µL对酶和质谱兼容的5%表面活性剂溶液，在90 °C下变性3 min。
- 将样品冷却至室温（RT）3分钟。然后加入1.2 µL PNGase F，在50 °C下孵育5分钟。
- 冷却至室温3分钟后，加入12 µL溶于无水二甲基甲酰胺（DMF）中的荧光标记试剂，标记裂解的N-糖链，静置5分钟。随后用358 µL乙腈（ACN）稀释标记后的N-糖链混合物。
- 将亲水相互作用色谱（HILIC）板置于带有垫片和废液盘的真空 manifold 中。样品数量较多时，使用多通道移液器。
- 用200 µL水对孔进行预处理，调节真空度使液体通过HILIC树脂的时间为15–30秒。在上样经ACN稀释的标记糖链混合物（400 µL）前，先用200 µL 85%乙腈（ACN）平衡。每次向孔中加入新液体后均施加真空。用1%甲酸（FA）/90% ACN溶液洗涤树脂两次，每次600 µL。
- 将废液盘更换为600 µL收集管。用SPE洗脱缓冲液将标记的N-糖链洗脱至收集管中（每次30 µL，共洗脱3次）。将合并的洗脱液用310 µL DMF/ACN样品稀释液稀释。将样品转移至自动进样瓶中，准备进行荧光（FLR）-质谱分析。
注意：这些样品在 -80 °C 下保存至少 1 个月时稳定。将 HILIC 板存放在原包装中，密封后置于干燥器内，以备后续使用。
- 以2 mg/mL的抗体浓度开始，使用适当的缓冲液，如中性磷酸钠、柠檬酸盐或HEPES缓冲液。同时制备2 mg/mL的完整单克隆抗体标准品（如NIST mAb），与实验样品一同处理，作为阳性对照。
- 标记N-糖链的液相色谱-质谱分析
- 在配备荧光检测器和四极杆飞行时间（Q-ToF）质谱仪的超高效液相色谱（UPLC）系统上分析标记的N-糖链洗脱样品。使用经批准用于标记糖链色谱分离的色谱柱，并在分离过程中加热至60 °C。
注意：必须用60%乙腈和40% H2使用前平衡：首次使用前需用50个柱体积（CVs）平衡，若柱子 previously 使用过，则需用20个柱体积（CVs）平衡。- 使用50 mM甲酸铵（AmF）（用流动相浓缩液配制）和100%液相色谱-质谱级乙腈（ACN）作为流动相。AmF对pH变化敏感，配制后可使用1个月。初始流速设为0.4 mL/min，液相梯度在洗脱阶段逐步增加AmF浓度。
- 将FLR检测器设置为在激发波长265 nm、发射波长425 nm条件下检测，采样频率为2 Hz。将Q-ToF设置为MS1正离子灵敏度模式，质量扫描范围为100–2,000道尔顿（Da），扫描时间为0.25秒，并采用连续模式进行数据采集。使用亮氨酸脑啡肽（2 ng/μL，溶于50% ACN/0.1% FA）作为内标质量校正参考，在 "请勿应用校正" 模式。
注意：内部质量参考校正将在后续数据处理过程中应用。 - 依次用 22.5 µL 的 H 重悬葡聚糖标准品2O、25 µL DMF 和 52.5 µL ACN。分装成每份 10 µL，于 -80 °C 保存，因为该分子量标记物在较高温度（室温、4 °C）下不稳定，保存时间不得超过 24 小时。葡聚糖分子量标记物在经历一次以上冻融循环后会发生降解。
- 将样品置于设定为10 °C的自动进样器中。在进样时，除样品外还需加载一管葡聚糖标准品，其保留时间信息将用于定性分析，质谱信息将用于验证鉴定结果。样品进样量为10 µL，葡聚糖标准品进样量为7.5 µL。每个样品重复进样三次。运行已加载的方法。
- 在配备荧光检测器和四极杆飞行时间（Q-ToF）质谱仪的超高效液相色谱（UPLC）系统上分析标记的N-糖链洗脱样品。使用经批准用于标记糖链色谱分离的色谱柱，并在分离过程中加热至60 °C。
- N-糖链的LC-MS数据鉴定
- 使用专为亲水相互作用色谱-荧光-质谱（HILIC-FLR-MS）数据优化的程序进行数据处理。
- 在程序中应用内部质量参考校正。将葡聚糖梯度注入指定为 "标准" 在 样本信息. 在 分析方法将分离化合物的保留时间设置为运行过程中检测到的梯形化合物的保留时间。
- 为确保返回已鉴定聚糖的面积百分比（Area %），请修改分析方法：在 处理 标签，点击 定量设置 - 校准并设置 "校准曲线拟合类型" 到 "相对反应率 (%)".
4. 使用 SEC-MALS 分析抗体聚集
- 样品制备
- 将3.5 mg/mL（步骤2）稀释后的蛋白转移至带有150 µL玻璃内插管的样品瓶中。使用加样枪头将溶液移至内插管底部，避免产生气泡。
- 用隔垫盖紧小瓶，并立即进行分析。若需稍后分析，则在4 °C下保存。
- SEC-MALS 配置与平衡
注意：使用配备多角度激光散射检测器（MALS 检测器）和折射率检测器的超高压液相色谱系统（UHPLC）进行尺寸排阻色谱-多角度激光散射（SEC-MALS）分析，检测器由 MALS 软件控制。- 在UHPLC软件中配置方法文件以控制UHPLC系统，设定流速为0.4 mL/min，流动相为1×磷酸盐缓冲液（PBS）（由10×稀释而成），进样体积为5 µL，柱温为25 °C，二极管阵列检测器（DAD）监测波长设为280 nm。运行时间设为20 min。在进行任何样品分析前，系统需至少平衡4 h。
- 超高效液相色谱（UHPLC）与多角度光散射-折射率（MALS-RI）检测器之间的连接需使用二极管阵列检测器（DAD）的模拟输出。在DAD方法文件中，将DAD衰减设置为1,000 mAU，AU/UV设置为1紫外仪器>通道>通道 1).
- 分析开始前30分钟打开DAD灯，并将波长设置为280 nm。同时，对折光率（RI）参比池吹扫15分钟或直至基线稳定，然后关闭参比池。
- 配置 SEC-MALS 软件序列，设置收集时间为 12 min，进样体积为 5 µL，dn/dc 值为 0.185 mL/g，A280 消光系数若已通过实验预先测定则使用实测值，否则设为 1.37 mL·(mg·cm)⁻¹-1，以及样品的浓度。点击 运行 并等待 "等待注射" 对话框将显示在屏幕上。
注意：A280 消光系数具有蛋白质特异性，应通过实验确定。 - 在UHPLC软件中按照与MALS-RI软件相同的顺序配置样品列表并提交。
注意：每次运行前后均需进行系统适用性检查。通常使用牛血清白蛋白（BSA）检测峰展宽现象，该现象提示尺寸排阻色谱柱可能需要清洗或更换。同一次BSA标准品进样可用于确定信号对齐、峰展宽及检测器归一化。
- 使用 MALS 软件进行聚集体分析
- 点击标记的标签页 实验步骤指定所需的最小去尖峰水平；通常无需去尖峰即可。
- 验证LS1、LS2、LS3、RI和UV通道的基线是否绘制正确，必要时进行调整。设定目标峰面积。
- 检查分子质量分布，以确认所识别的峰包含大小相似的颗粒。
5. 电荷变体分析
- 样品制备与标记
- 取 80 µL 浓度为 3.5 mg/mL 的抗体溶液。使用 0.5 mL 脱盐柱（7k MWCO）对样品进行脱盐。准备脱盐柱时，先折断底部塞子，再松开顶部塞子，并将其放入 1.7 mL 微量离心管中。以 1,500 × g 离心 1 分钟。
注意：在柱子外壁标记一个点，以便在后续步骤中保持原始方向。 - 将脱盐柱转移至新的微量离心管中。将 80 µL 稀释后的蛋白加至柱子顶部。确保柱子保持原始方向。以 1,500 × g 离心 2 分钟。从离心机中取出样品，弃去脱盐柱，并充分混匀样品。
注意：仅当样品基质中含有伯胺、会影响样品电泳的辅料或其他不相容物质时，才需要进行脱盐。 - 将样品稀释至最终浓度为 2 mg/mL，总体积为 25 µL，并在 96 孔板中加入 5 µL 标记缓冲液（参见材料表：电荷变体试剂盒）。通过将适量标记试剂（参见材料表：电荷变体试剂盒）用二甲基甲酰胺按 1:30 稀释来配制标记试剂。室温避光孵育 10 分钟。
注意：该试剂需解冻后立即使用，并在与 DMF 混合后 10 分钟内用完。 - 孵育结束后，加入 60 µL 试剂级水，并用移液器充分混匀。用封板膜覆盖 96 孔板，以 1,000 × g 离心 1 分钟。
- 取 80 µL 浓度为 3.5 mg/mL 的抗体溶液。使用 0.5 mL 脱盐柱（7k MWCO）对样品进行脱盐。准备脱盐柱时，先折断底部塞子，再松开顶部塞子，并将其放入 1.7 mL 微量离心管中。以 1,500 × g 离心 1 分钟。
- 准备电荷变体芯片
- 取出储存液，用去离子水清洗电荷变体芯片的 1、3、4、7、8 和 10 号孔，完成芯片的准备工作。然后将水替换为 pH 7.2 运行缓冲液（参见材料表：电荷变体试剂盒）。
- 向缓冲液管中加入 750 µL pH 7.2 运行缓冲液，并将缓冲液管放置在样品托盘左上角指定位置。取下 96 孔板的封板膜，点击仪器用户界面上的卸载板按钮，然后将 96 孔板插入 GXII 样品托盘中。
注意：本分析使用 pH 7.2 缓冲液。可根据蛋白质等电点选择使用 pH 5.6–7.2 的缓冲液。使用较低 pH 缓冲液时，可能需要更长的样品运行时间。 - 点击用户界面上的卸载芯片按钮。确保电极无任何颗粒残留，如有则用无尘棉签清洁。插入芯片时，确保芯片中心窗口无颗粒或污迹。如有需要，用无尘软布擦拭清洁。
注意：在操作毛细管电泳芯片时，应通过真空抽吸去除缓冲液，随后立即加入下一种溶液，以防止孔内干燥。为尽量减少气泡引入，请采用反向移液技术。操作芯片时请注意底部伸出的脆弱毛细管，避免其因粗暴操作而断裂或干燥。 - 关闭芯片室盖，选择HT 蛋白电荷变体检测程序。点击运行按钮。根据提示选择样品孔、板类型、检测时间（68、90 或 100 秒）和文件名。在提示结束时点击开始。
- 芯片清洗需用去离子水对每个孔清洗两次，然后加入储存缓冲液（参见材料表：电荷变体试剂盒）。加入储存缓冲液后，将芯片重新放入仪器中，当系统提示时，选择 HT 蛋白电荷变体检测程序。在主界面选择“清洗”选项。清洗完成后，取出芯片，用水和无尘棉签擦拭电极，并将芯片储存在 4 °C。
- 电荷变体分析
- 打开仪器分析软件。通过点击文件>导入数据文件…，选择所需的 *.gxd 文件以导入运行数据。仅文件名会被导入软件，因此建议重命名样品孔（工具 > 样品名称编辑器）。按住 Shift 键选择要导出的文件。点击文件>导出…，勾选原始数据框，然后选择AIA 格式框。
- 在分析软件中打开“浏览项目”选项卡。点击数据库>导入数据…，选择已导出的 *.CDF 文件。
- 导入后，进入进样选项卡，选择待分析的文件，右键点击并选择处理…。在弹出窗口中，勾选处理复选框，选择"使用指定的处理方法"单选按钮，并从下拉菜单中选择所需的处理方法。在下方标注为"如何："的下拉框中选择“校准并定量”。处理完成后，进入“结果”选项卡，检查色谱图的积分情况。
注意：每种方法均需验证其处理方法。作为起点，当前处理方法所用参数详见补充文件。
注意：数据导出可生成报告形式，也可仅导出峰定量结果。这些操作可在处理过程中或从结果窗口中完成。
6. 氨基酸分析
- 通过液相色谱-质谱法（LC-MS）建立绝对氨基酸定量的标准曲线
- 通过将59.45 mg的Asn、59.00 mg的Hyp、65.77 mg的Gln和91.95 mg的Trp溶解于25 mL的0.1 N HCl中，制备扩展氨基酸（EAA）混合物。EAA混合物中每种氨基酸的终浓度为18 nmol/µL。
- 通过将58.58 mg的Nva和44.54 mg的Sar溶解于50 mL的HCl中，制备内标（ISTD）储备液。
- 将每种浓度均为1 nmol/µL的Ala、Asp、Arg、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Ty r、Val的氨基酸储备液与EAA混合物混合，得到终浓度分别为900、225、90、22.5和9 pmol/µL的完整氨基酸标准品。向氨基酸标准品中加入已制备的ISTD储备液，使其终浓度分别为90 pmol/µL或900 pmol/µL，以建立"低浓度"和"高浓度"内标，作为方法的阳性对照。
- 将样品瓶中的氨基酸浓度置于UPLC自动进样器中。根据氨基酸标准品浓度，使用以下说明在仪器软件中生成校准曲线（9至900 pmol/µL）。
- 采用配备UPLC的Q-ToF质谱仪，在电喷雾电离（ESI）正离子灵敏度模式下进行完整氨基酸分析。色谱分离使用专用于氨基酸分离的正相色谱柱。使用质谱级试剂配制以下缓冲液：A = 乙腈 + 0.1% 甲酸，B = 100 mM 甲酸铵。设置LC流速为0.6 mL/min，柱温为40 °C。
- 采用以下15分钟梯度条件进行氨基酸分离：14% B（0–3 min）、14–100% B（3–10 min）、100% B（10–13 min）、100–8% B（13–14 min）、8% B（14–15 min）。
- 在质谱采集程序中，使用"样品类型"和"浓度A"列设置，基于氨基酸标准品浓度在定量程序中创建校准曲线，用于后续对粗制生物反应器培养基的分析。要使这些列出现在采集程序中，请在顶部菜单栏上右键单击，选择自定义显示…命令。
- 氨基酸标准品的样品类型为"标准品"，而培养基样品为"待测物"。在"浓度A"列中填入标准品在所需单位下的数值浓度（例如：pmol/µL）。
- 至少重复运行两次已制备的氨基酸标准品浓度。通过检查内标峰验证UPLC仪器和质谱仪是否正常工作。
- 在定量应用程序中使用"编辑方法"选项创建定量方法（*.mdb文件）。在定量应用程序中定义所有目标氨基酸，包括化合物名称、m/z值和预期保留时间。在此处调整方法的积分参数。
- 使用所创建的氨基酸方法对标准样品进行分析，以生成校准曲线。该曲线可通过导出>校准…命令导出为*.cdb文件，供后续分析培养基样品时使用。
- 在定量应用程序中，使用"另存布局为…”将所需的布局保存为*.qlt文件，以便应用于未来的数据集。名称（进样名称）、峰面积和浓度是最关键的输出列。
- 通过液相色谱-质谱法（LC-MS）分析粗制生物反应器培养基中的氨基酸
- 将粗制生物反应器培养基在1,962 × g条件下离心5分钟，并通过0.22 µm滤膜过滤。
- 随后进行高氯酸净化以去除蛋白质和颗粒物：将过滤后的生物反应器培养基与0.4 N HClO4按1:1比例混合，在室温下以14,700 × g离心5分钟。收集澄清的培养基至自动进样瓶中。
注：根据需要调整进样体积，使氨基酸浓度落在校准范围之内。根据仪器不同，进样体积可在0.1 µL至10 µL之间调整。 - 通过LC-MS对培养基样品进行三重复进样分析。在定量程序中使用"处理样品"功能，并加载方法文件（*.mdb）和校准文件（*.cdb）。定量应用程序将在所有进样完成后，自动将方法和校准曲线应用于粗制培养基样品。
- 若需将数据导出至其他程序（如电子表格）进行分析，请使用"打印"命令生成*.xps或*.pdf文件。
结果
采用快速蛋白液相色谱法（FPLC）对自动微尺度生物反应器收获的细胞培养液进行纯化，如图1所示，并通过多种下游分析方法对纯化后蛋白质的关键质量属性（CQAs）进行表征。这是自动微生物反应器系统的一个关键优势；可在广泛的不同条件下快速评估CQAs的差异。由中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达并经质谱处理的单克隆抗体（mAbs）的N-糖链数据应呈现如图2所示的色谱图形态。该图展示了两张色谱图的对比，显示其中一个样品的甘露糖5峰（M5）显著降低。若观察到的仅为噪声基线而无明显峰形，则可能表明色谱系统设置存在问题或实验操作未成功。通过使用对照品可简化故障排查过程。首先，评估葡聚糖分子量标准品（dextran ladder）产生的FLR峰；这些峰的存在表明色谱系统运行正常。随后，将实验获得的峰图谱与经处理的完整单克隆抗体标准品所得图谱进行比较。若标准品的峰清晰可见，但样品中未检测到相应峰，则说明mAb样品未被正确处理。这可能是由于缓冲液中存在SDS或亲核试剂，干扰了N-糖链的标记与纯化过程所致。
SEC-MALS 可用于评估另外两个关键质量属性（CQA）：抗体的聚集谱和分子量。一个典型的 SEC-MALS 色谱图与图3中所示相似。使用配套软件，结合消光系数 1.37 mL*(mg*cm)-1 和 dn/dc 值 0.185 mL/g，测定分子质量分布和绝对分子量。由于软件中的峰识别和基线设定需手动完成，不同操作者之间的结果可能略有差异。图3中单体 IgG1 的绝对分子量为 1.504 × 105 Da ± 0.38%（蓝色），高阶复合物为 7.799 × 105 Da ± 3.0%（红色）。聚集体的多分散性远高于单体，如峰1的红色摩尔质量分布曲线所示（图3）。由于该方法所需样品量少，且聚集状态作为关键质量属性的重要性突出，因此该技术是自动化微型生物反应器系统的极具价值的补充分析工具。
mCZE 的结果是一张电泳图谱，如图4所示，展示了单克隆抗体的电荷变体谱型。该谱型是所研究蛋白质的独特特征，且对操作pH值高度敏感。在电荷变体谱型左侧还可观察到一个游离染料峰。在确定操作pH值时，操作者可在分辨率与信号强度之间进行权衡；此外，操作者必须确保电荷变体与在约30秒处迁移的游离染料峰之间具有良好的分离度。样品在标记后可进行脱盐处理以消除该峰，但这会导致信号显著降低。一旦确定了操作pH值，即可对样品谱型进行比较。尽管谱型通常具有一致性，但标记效率的变化或辅料成分的差异仍可能导致样品迁移行为及电荷变体谱型出现微小差异，从而难以直接比较电泳图谱。因此，通常采用碱性、主峰和酸性组分的百分比来进行比较。在此情况下，使用mCZE可检测到低至1-2%的相对差异。
可通过监测氨基酸消耗情况，以确定其耗竭是否引起关键质量属性（CQAs）的变化。质谱仪的色谱图输出可用于评估在粗制生物反应器培养基样品中实现氨基酸绝对定量的校准曲线是否成功建立。图5展示了在此过程中两个总离子色谱图（TIC）和一个提取离子色谱图（XIC）的代表性结果。在图5A中，所示TIC显示了仅注入纯水空白样时缓冲系统的背景信号。图5B展示了一张氨基酸标准品的代表性TIC，与纯水空白样相比，可观察到对应于各个氨基酸组分的小峰（例如在7.96分钟处的赖氨酸）。为实现峰面积的积分并促进定量分析（从而推算浓度），需使用提取离子色谱图（XIC），其中仅显示特定“色谱质量窗口”内的信号。根据仪器的灵敏度和色谱分离的质量，用户需自行确定最佳的质量窗口。在本示例中（图5C），展示了赖氨酸（m/z = 147.1144）在10 ppm质量窗口下的XIC，其中氨基酸标准品中的赖氨酸在8.03分钟时从色谱柱中洗脱。
图 1。采用快速蛋白液相层析（FPLC）技术的纯化方案代表性层析图谱。 横轴标注了对应于体积（mL）的纯化方法各阶段。在整个纯化过程中监测280 nm处的紫外吸光度（mAU，纵轴实线）。在高盐洗涤阶段，通过增加电导率（mS/cm，纵轴虚线）去除非特异性结合的杂质。当pH降低至4时（未显示），通过引入洗脱缓冲液（B组分，点线）从Protein A柱上洗脱抗体。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2。由标记并经质谱验证的聚糖获得的代表性荧光色谱图。 横轴为保留时间（分钟），纵轴为信号强度。14.94 分钟处的峰代表甘露糖 5（M5）聚糖，可观察到叠加的两个样品之间 M5 信号强度存在显著差异。请点击此处查看该图的放大版本。
图3. IgG1单克隆抗体的分子量分布。 在1×PBS（pH 7.4）中通过尺寸排阻色谱分离的完整IgG1单克隆抗体的色谱图。在280 nm处监测吸光度（黑色；左侧纵轴），并使用光散射和折射率检测器计算每个峰的绝对分子量（红色和蓝色；右侧纵轴）。高分子量物质由标注为“HMW”的峰指示。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4．IgG1 单克隆抗体的电荷变体谱型。 该电泳图谱在 mCZE 平台上生成。游离染料峰迁移至约 30 秒处，并与 IgG1 实现良好分离。用于定量分析时，使用仪器配套的数据分析软件将峰划分为碱性、主峰和酸性组分。红线标示了积分峰面积。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5. 基于质谱的粗生物反应器培养基中氨基酸分析的典型离子色谱结果。 横轴为时间（分钟），纵轴为信号强度（A）水空白作为阴性对照，显示了液相色谱梯度过程中观察到的背景信号（B）此处使用 225 pmol/µL 氨基酸标准品作为阳性对照，该总离子色谱图中出现的各个峰代表标准混合物中不同氨基酸在色谱上的分离情况（C）m/z 147.1144 的代表性提取离子色谱图，即赖氨酸。B 中 7.96 分钟的峰对应于 C 中赖氨酸的 8.03 分钟峰。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
HCCF 含有碎片和大颗粒，可能会堵塞并损坏昂贵的仪器，因此在进行后续下游处理之前需要对培养液进行澄清。离心通常是将细胞和其他不溶性颗粒与蛋白质分离的第一步，随后进行过滤。经过滤的 HCCF 随后通过快速蛋白液相色谱（FPLC）进行纯化。从自动化微型生物反应器中纯化 HCCF 以获得目标产物，是下游处理中的关键步骤。本实验采用台式 FPLC 系统结合蛋白 A 柱，从 HCCF 中获取单克隆抗体。上游工艺的分析可为细胞行为提供有价值的见解，并指导生物工艺设计，有助于获得质量一致且可靠的产品。分析技术还可帮助我们将关键质量属性（CQAs）与上游及下游工艺相关联。本文介绍了四种常用于单克隆抗体表征的检测方法。这些技术具有良好的稳健性、可靠性，可便捷地用于来自多种上游来源的工艺和产品分析，即使样品仅经过部分纯化且仍含有残留水平的 DNA 和 HCP，亦可适用。
在为分析处理样品时，必须在制备出足够纯净的样品以供分析的同时，保留生物反应器中存在的变异性的两者之间取得重要平衡。影响产品的两种最常见污染物是DNA和HCP，可通过测定260/280 nm处的吸光度比值以及通过SDS-PAGE或µCE-SDS进行检测。此处介绍的检测方法对低水平的DNA含量不敏感。根据µCE-SDS测定结果，产品的纯度>95%。
采用微毛细管电泳系统进行电荷变体分析，可提供一种高通量的方法来鉴定电荷变体，其芯片和试剂易于操作实施。该技术本身及标记试剂的化学性质均对辅料和其他伯胺类物质敏感，因此大多数样品基质需要进行脱盐步骤。根据经验，低水平的DNA会与标记反应中的游离染料共迁移，但不会影响结果质量。尽管碱性、主峰和酸性峰的定量变异性通常<1%，但较高水平的DNA及其他污染物可能增加检测的变异性。在蛋白质标记过程中保持操作一致性至关重要，并应在从瓶中取出后立即使用DMF与染料混合。建议使用赖氨酸和/或组氨酸标准品作为标记对照。随着时间推移，并取决于样品质量，芯片可能发生污染或微流控通道涂层脱落，导致背景噪声增大、出现鬼峰以及样品间变异增大。为识别此类情况，应定期在分析样品的同时平行分析空白样品和系统适用性标准品（如NISTmAb）。当出现芯片问题时，可用储存液清洗芯片或直接更换芯片。
用于治疗性糖蛋白糖链分析的方法主要涉及液相色谱（LC）和/或质谱（MS），而凝集素微阵列分析作为第三种选择正逐渐受到关注25。本文所述方法结合了液相色谱与质谱技术，具有各自的优缺点。质谱分析方法的优势在于能够对所分析的糖链进行质量验证，而基于液相色谱的荧光检测方法或凝集素微阵列则无法实现这一点。本方法采用液相色谱结合荧光检测，通过将洗脱时间与葡聚糖梯度标准品进行比对，从而确定糖链的结构。荧光检测因其灵敏度高且易于检测，有助于提高检测灵敏度和定量能力；相比之下，质谱单独使用时可能难以对丰度较低的组分进行定量，原因在于寡糖的离子化效率较低。本方法中质谱提供的质量信息用于确认糖链结构，但数据处理软件并不将质量信息作为结构指认的主要依据。因此，若色谱重复性不佳或峰难以分辨，则该方法在糖链结构指认方面可能受到影响。幸运的是，即使在色谱条件不理想的情况下（例如保留时间偏移导致糖链结构难以重复指认），质谱提供的质量信息仍有助于糖链的鉴定。如果该方法在不使用质谱的情况下单独运行，则色谱性能必须达到最高水平，因为无法利用质谱信息来校正保留时间的漂移。
本文所述的氨基酸分析方法利用液相色谱-质谱法（LC-MS）对粗制细胞培养基中的未衍生化氨基酸进行快速定量。其他氨基酸分析方法则需要使用氨基酸衍生化试剂以实现紫外检测26。与液相色谱-紫外检测法（LC-UV）相比，LC-MS 方法具有重要优势：它可根据保留时间和离子质量进行鉴定，而 LC-UV 方法因缺乏质荷比表征能力而受限。此外，LC-MS 方法在时间和重现性方面也更具优势，因为 LC-UV 方法需要耗时的衍生化反应，该过程可能引入样品间的变异性27。然而，在 LC-MS 方法中直接进样粗制细胞培养基可能导致离子喷雾毛细管污染，从而对质谱信号产生不利影响。因此，需频繁进样校准梯度样品以进行系统适用性检查，并对样品进样顺序进行随机化处理，以避免数据偏差。
使用微生化反应器进行抗体生产的细胞培养过程此前已有描述9。本研究详细阐述了单克隆抗体表征方法的操作流程，旨在从有限的样品体积中获取最大程度的数据信息。收获的细胞培养液体量有限时，可能限制所获得的产品信息，因此选择合适的分析方法以获取产品质量数据至关重要。分析检测对于关联上游工艺参数与产品质量变化具有重要意义。本文为使用微生化反应器的研究人员提供了表征单克隆抗体（mAbs）的操作指南。
披露
本文内容仅代表作者观点，不应被解读为反映美国食品药品监督管理局（FDA）的观点或政策。
致谢
作者谨此感谢 Scott Lute 提供的分析支持。本研究的部分内部资金和支持由 CDER 关键路径计划（合同编号：CA #1-13）提供。本项目部分得益于美国食品药品监督管理局生物技术产品办公室的实习/研究参与计划的资助，该计划由橡树岭科学与教育研究所通过美国能源部与食品药品监督管理局之间的机构间协议管理。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CHO DG44 细胞系 | Invitrogen | A1100001 | |
| Akta Avant 25 | 通用电气生命科学 | 28930842 | |
| Pro Sep vA Ultra 层析树脂 | Millipore Sigma | 115115830 | 纯化固定相 |
| Omnifit 10 cm 柱 | Diba 流体智能 | 006EZ-06-10-AA | 固定相外壳 |
| Tris 碱 | 菲舍尔科技 | BP154-1 | |
| 10 mL Superloop | GE 医疗 | 18-1113-81 | |
| µDawn 多角度光散射检测器 | Wyatt | WUDAWN-01 | |
| 0.22 µm Millex GV 滤器单元 PVDF 膜 | 默克密理博 | SLGV033RB | |
| 10X 磷酸盐缓冲液 | 康宁 | 46-013-CM | |
| 12 mL 注射器 | Covidien | 8881512878 | |
| 1290 Infinity 二元泵 | 安捷伦科技 | G4220A | |
| 1290 Infinity DAD | 安捷伦科技 | G4212A | |
| 1290 Infinity 进样器 | 安捷伦科技 | G4226A | |
| 1290 Infinity 恒温器 | 安捷伦科技 | G1330B | |
| 1290 Infinity 恒温柱温箱 | 安捷伦科技 | G1316C | |
| 15 mL Falcon 管 | 康宁公司 | 352097 | |
| 150 µL 带聚合物底脚的玻璃内衬管 | 安捷伦科技 | 5183-2088 | |
| 50 mL Falcon 管 | 康宁公司 | 352070 | |
| 96 孔板 | Bio-Rad | 127737 | |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | 695072 | |
| 乙腈 | 菲舍尔化学 | BPA996-4 | |
| ACQUITY I-Class UPLC BSM | 沃特世公司 | 18601504612 | |
| ACQUITY I-Class UPLC 样品管理器 | 沃特世公司 | 186015000 | |
| ACQUITY UPLC 荧光检测器 | 沃特世公司 | 176015029 | |
| Amicon Ultra-4 100 kDa 离心滤器 | 默克密理博 | UFC810096 | |
| 氨基酸标准品，1 nmol/µL | 安捷伦科技 | 5061-3330 | |
| 氨基酸补充剂 | 安捷伦科技 | 5062-2478 | |
| 甲酸铵溶液 - 糖链分析 | 沃特世公司 | 186007081 | |
| 蓝色带隔垫螺帽 | 安捷伦科技 | 5182-0717 | |
| CD OptiCHO AGT 培养基 | 赛默飞世尔科技 | A1122205 | |
| 离心管 | Eppendorf | 22363352 | |
| 电荷变体芯片 | 珀金埃尔默 | 760435 | |
| 电荷变体试剂盒 | 珀金埃尔默 | CLS760670 | |
| 层析用水（质谱级） | 菲舍尔化学 | W6-4 | |
| 二甲基甲酰胺 | 赛默飞科技 | 20673 | |
| Oasis 96 孔板用萃取板真空 manifold | 沃特世公司 | 186001831 | |
| 甲酸 | 菲舍尔化学 | A117-50 | |
| GlycoWorks RapiFlour-MS N-糖链起始试剂盒 - 24 样本 | 沃特世公司 | 176003712 | |
| GXII 缓冲液管 | E&K Scientific | 697075- NC | |
| GXII 检测窗清洁布 | VWR | 21912-046 | |
| GXII HT Touch | 珀金埃尔默 | CLS138160 | |
| GXII 梯状管 | Genemate | C-3258-1 | |
| GXII 无尘棉签 | ITW Texwipe | TX758B | |
| 盐酸 | 菲舍尔科技 | A144-500 | |
| 完整单克隆抗体质量校准标准品 | 沃特世公司 | 186006552 | |
| Intrada 氨基酸柱 150 x 2 mm | Imtakt | WAA25 | |
| NanoDrop One 微量紫外-可见分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | 840274100 | |
| Optilab UT-rEX 差示折光检测器 | Wyatt | WTREX-11 | |
| 高氯酸 | Aldrich 化学 | 311421 | |
| 用于上样凝胶的带微毛细管吸头 | Labcon | 1034-960-008 | |
| 聚丙烯 96 孔微孔板，F 型底，烟囱式，黑色 | Greiner Bio-One | 655209 | |
| RapiFlour-MS 葡聚糖校准梯 | 沃特世公司 | 186007982 | |
| 2 mL 螺口透明小瓶 | 安捷伦科技 | 5182-0715 | |
| 氯化钠 | 菲舍尔科技 | S271-1 | |
| 碘化钠 | Sigma Aldrich | 383112 | |
| TSKgel UP-SW3000 4.6 mm 内径 x 30 cm 长度 | 东曹生物科学 | 003449 | |
| UNIFI 科学信息系统 | 沃特世公司 | 667005138 | |
| 真空 manifold 垫片 | 沃特世公司 | 186007986 | |
| 真空泵 | 沃特世公司 | 725000604 | |
| Xevo G2 Q-ToF | 沃特世公司 | 186005597 | |
| Zeba Spin 脱盐柱，0.5 mL | 赛默飞科技 | 89883 |
参考文献
- Pharmaceutical cGMPs for the 21st Century: A Risk-Based Approach. , (2004).
- New Molecular Entity (NME) Drug and New Biologic Approvals. FDA. , Available from: https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm (2015).
- Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127, 2222-2230 (2013).
- Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
- Hmiel, L., Brorson, K., Boyne, M. Post-translational structural modifications of immunoglobulin G and their effect on biological activity. Analytical & Bioanalytical Chemistry. 407 (1), 79-94 (2015).
- Rathore, A. S. Roadmap for implementation of quality by design (QbD) for biotechnology products. Trends in Biotechnology. 27 (9), 546-553 (2009).
- International Council for Harminisation of Techinical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. ICH. , ed specifications: test procedures and acceptance criteria for biotechnological/biological products Q6B (1999).
- Berkowitz, S. A., Engen, J. R., Mazzeo, J. R., Jones, G. B. Analytical tools for characterizing biopharmaceuticals and the implications for biosimilars. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (7), 527-540 (2012).
- Velugula-Yellela, S. R., et al. Use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model IgG1 in CHO cells. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Largy, E., Cantais, F., Van Vyncht, G., Beck, A., Delobel, A. Orthogonal liquid chromatography-mass spectrometry methods for the comprehensive characterization of therapeutic glycoproteins, from released glycans to intact protein level. Journal of Chromatography A. 1498, 128-146 (2017).
- Yang, J. -M., et al. Investigation of the correlation between charge and glycosylation of IgG1 variants by liquid chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 448, 82-91 (2014).
- Agarabi, C. D., et al. Bioreactor Process Parameter Screening Utilizing a Plackett-Burman Design for a Model Monoclonal Antibody. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (6), 1919-1928 (2015).
- Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-Exclusion Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbance, and Refractive Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions. Analytical Biochemistry. 240 (2), 155-166 (1996).
- Veurink, M., Stella, C., Tabatabay, C., Pournaras, C. J., Gurny, R. Association of ranibizumab (Lucentis) or bevacizumab (Avastin) with dexamethasone and triamcinolone acetonide: An in vitro stability assessment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 78 (2), 271-277 (2011).
- Li, Y., Weiss, W. F., Roberts, C. J. Characterization of high-molecular-weight nonnative aggregates and aggregation kinetics by size exclusion chromatography with inline multi-angle laser light scattering. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (11), 3997-4016 (2009).
- Espinosa-de la Garza, C. E., et al. Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).
- Han, H., Livingston, E., Chen, X. High throughput profiling of charge heterogeneity in antibodies by microchip electrophoresis. Analytical Chemistry. 83 (21), 8184-8191 (2011).
- Wheeler, T. D., et al. Microchip zone electrophoresis for high-throughput analysis of monoclonal antibody charge variants. Analytical Chemistry. 86 (11), 5416-5424 (2014).
- Carrillo-Cocom, L., et al. Amino acid consumption in naive and recombinant CHO cell cultures: producers of a monoclonal antibody. Cytotechnology. 67 (5), 809-820 (2015).
- Chen, P., Harcum, S. W. Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHO cells. Journal of Biotechnology. 117 (3), 277-286 (2005).
- Xing, Z., et al. Optimizing amino acid composition of CHO cell culture media for a fusion protein production. Process Biochemistry. 46 (7), 1423-1429 (2011).
- Fan, Y., et al. Amino acid and glucose metabolism in fed-batch CHO cell culture affects antibody production and glycosylation. Biotechnology and Bioengineering. 112 (3), 521-535 (2015).
- Read, E. K., et al. Fermentanomics informed amino acid supplementation of an antibody producing mammalian cell culture. Biotechnology Progress. 29 (3), 745-753 (2013).
- Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O'Hara, J., Bracewell, D. G. Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold. Journal of Chromatography. A. 1415, 83-90 (2015).
- Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. Glycan analysis of therapeutic glycoproteins. MAbs. 8 (2), 205-215 (2016).
- Wahl, O., Holzgrabe, U. Amino acid analysis for pharmacopoeial purposes. Talanta. 154, 150-163 (2016).
- Le, A., Ng, A., Kwan, T., Cusmano-Ozog, K., Cowan, T. M. A rapid, sensitive method for quantitative analysis of underivatized amino acids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Journal of Chromatography B. 944, 166-174 (2014).
重印与许可
标签
