本文介绍了一种通用的脉冲-追踪方法的实验方案，可用于在活细胞中动态分析蛋白质的折叠、转运和降解过程。
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本文内容
摘要
摘要
放射性脉冲-追踪标记是研究活细胞中靶蛋白构象成熟、转运至其功能性细胞定位以及降解过程的有力工具。通过使用短暂的（脉冲）放射性标记时间（<30 分钟）并严格控制追踪时间，可以仅标记总蛋白池中的一小部分，并追踪其折叠过程。当结合非还原/还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）以及使用（构象特异性）抗体进行免疫沉淀时，可对折叠过程进行极为详细的分析。该系统已被用于分析具有广泛不同性质蛋白的折叠，包括可溶性蛋白、单次和多次跨膜蛋白、高度N-和O-糖基化的蛋白，以及含有或不含大量二硫键的蛋白。脉冲-追踪方法是研究多种其他特征的动力学研究基础，包括共翻译和翻译后修饰、寡聚化以及聚合过程，实质上实现了对蛋白质从合成到降解全过程的分析。脉冲-追踪蛋白折叠研究与其他用于体外（in vitro）蛋白质研究的生物化学和生物物理方法互为补充，能够提供更高的时间分辨率和生理相关信息。本文所述方法可轻松适用于研究几乎任何能在哺乳动物或昆虫细胞系统中表达的蛋白质的折叠过程。
引言
即使是相对简单的蛋白质折叠也涉及多种不同的折叠酶、分子伴侣和共价修饰1这些过程的完全重建 体外 鉴于涉及的组分种类繁多，实际上难以实现。因此，研究蛋白质折叠极为重要 体内在活细胞中。放射性脉冲-追踪技术是研究蛋白质在其天然环境中合成、折叠、转运和降解的有力工具。
短脉冲期间对蛋白质进行代谢标记 35使用S标记的甲硫氨酸/半胱氨酸进行标记，随后在无放射性标记的条件下进行追踪，可在更广泛的细胞环境中特异性追踪新合成的蛋白质群体。随后可分离目标蛋白质 通过 免疫沉淀并分析 通过 SDS-PAGE 或其他技术。对于许多蛋白质而言，其在细胞内的转运过程常伴随着在 SDS-PAGE 凝胶上可见的修饰变化。例如，糖基化蛋白质从内质网（ER）向高尔基复合体转运时，通常伴随着 N-连接聚糖的修饰或 O-连接聚糖的添加。2,3这些修饰会导致表观分子质量显著增加，可通过SDS-PAGE中的迁移率变化进行观察。成熟过程还可能伴随蛋白水解切割，例如信号肽的切除或前肽的去除，从而引起表观分子质量的变化，这些变化可在SDS-PAGE凝胶上轻松追踪。4放射性标记技术相较于环己酰亚胺追踪等类似方法具有显著优势，后者通过抑制新蛋白质的合成来进行研究，但长时间处理对细胞具有毒性，且无法排除大多数半衰期长达数天的较老稳态蛋白质，从而影响分析结果。通过在非还原和还原条件下对蛋白质进行比较，可分析二硫键的形成情况，这是许多分泌蛋白折叠过程中的关键步骤。4,5,6,7.
本文介绍了一种利用放射性脉冲-追踪法分析完整细胞中蛋白质折叠与转运的通用方法。尽管我们力求尽可能详细地提供该方法，但本实验方案具有几乎无限的可适应性，允许针对每位读者所研究的特定蛋白质进行优化。
提供了两种替代的脉冲-追踪实验方案，一种用于贴壁细胞（本方案中的步骤1.1），另一种用于悬浮细胞（本方案中的步骤1.2）。此处提供的条件足以检测中等到高表达水平的蛋白。如果读者研究的是表达量较低的蛋白，或需进行多种后续处理（如多次免疫沉淀），则需相应增加培养皿尺寸或细胞数量。
对于悬浮液脉冲追踪实验，每个时间点的追踪样本均取自同一管细胞。脉冲后的洗涤步骤被省略；而是通过加入过量未标记的甲硫氨酸和半胱氨酸进行稀释，以阻止35S的进一步掺入。
所介绍的实验方案使用放射性 35使用S标记的半胱氨酸和甲硫氨酸来追踪细胞内的蛋白质折叠过程。所有涉及放射性试剂的操作均应采取适当的防护措施，以最大限度减少操作人员和环境暴露于放射性辐射的风险，并应在指定的实验室中进行。由于脉冲-追踪标记技术在较短的脉冲时间内效率相对较低（<15 分钟后，新合成蛋白质中掺入的放射性物质不到起始量的 1%。在目标蛋白质富集后 通过 免疫沉淀后，用于SDS-PAGE的样品所含放射性物质少于起始总量的0.05%。
尽管35S甲硫氨酸和半胱氨酸标记混合物已稳定化，但仍会发生部分分解，产生挥发性放射性化合物。为保护研究人员和设备，应采取一些预防措施。研究人员应始终遵守当地的辐射安全规定，并佩戴活性炭医用口罩，同时穿戴实验服和（双层）手套。含有35S甲硫氨酸和半胱氨酸的储备管必须始终在通风橱内或局部负压抽吸装置下开启。已知的实验室污染高发区域包括离心机、移液器、水浴锅、培养箱和摇床。通过使用带活性炭过滤膜的移液器吸头、正密封微型离心管（见材料表）、在水浴锅中放置水族用活性炭海绵、在脉冲-追踪培养皿内粘贴活性炭滤纸、在抽吸系统中安装活性炭防护装置，以及在培养箱和储存容器中放置含活性炭颗粒的培养皿，可减少这些区域的污染。
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方案
所有放射性试剂和操作均按照乌得勒支大学当地的辐射管理规定进行处理。
1. 脉冲追踪实验
- 贴壁细胞的脉冲-追踪实验
注意：此处给出的体积基于60 mm细胞培养皿。对于35 mm或100 mm培养皿，体积应分别乘以1/2或2。本方案采用10分钟的脉冲时间，以及0、15、30、60、120和240分钟的追踪时间。具体时间可根据所研究的特定蛋白进行调整（见下文讨论）。- 贴壁细胞例如，HEK 293、HeLa、CHO）在六个60 将细胞接种于 mm 细胞培养皿中，使其在脉冲-追踪实验当天达到亚汇合状态（80%–90%）。每个时间点和/或条件至少使用一个培养皿。
- 如需要，可根据制造商说明书，使用市售转染试剂对细胞进行转染；或者进行病毒转导8 在脉冲-追踪实验前一天，用适当的表达载体转染细胞。
- 用 2 mL 洗涤缓冲液（Hank's 平衡盐溶液 [HBSS]）洗涤培养皿，加入 2 mL 饥饿培养基（不含甲硫氨酸、半胱氨酸和胎牛血清 [FBS] 的正常培养基，例如 不含甲硫氨酸和半胱氨酸但含有10 mM HEPES（pH 7.4）的最低必需培养基 [MEM]，并将培养皿置于37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中2 15 分钟。
- 将培养皿转移至预热至37 °C的水浴锅中的架子上，确保培养皿与水接触但不漂浮。启动计时器。
- 在40秒时，吸除饥饿培养基，将600 µL脉冲溶液（饥饿培养基 + 每35 mm培养皿55 µCi标记物，参见步骤1.1.1前的注释）吸入移液枪，于恰好1分钟时轻轻加入培养皿中央。对剩余培养皿以1分钟为间隔重复此步骤。 从最长的追踪样本开始，以节省实验时间。
注意：操作放射性物质时，必须遵循适当的预防措施以及当地法规，以防止意外暴露和/或污染。 - 在第11分钟时，对除0分钟chase样本外的所有后续培养皿，直接加入2 mL chase培养基，吸除，再重新加入2 mL chase培养基。对剩余培养皿每隔1分钟重复此步骤。将所有培养皿转移至37 °C培养箱中。
- 在恰好16分钟时，将2 mL追踪培养基（正常培养基 + 10 mM HEPES [pH 7.4]、5 mM半胱氨酸和5 mM甲硫氨酸）直接加入0分钟样本的培养皿中，覆盖在脉冲培养基上方以终止标记；随后立即吸除液体，将培养皿转移至预冷的铝块上，并加入2 mL冰冻终止缓冲液（HBSS + 20 mM） N-乙基马来酰亚胺 [NEM]
注意：此为0分钟追迹样品。对于该样品，直接进行步骤1.1.9。 - 每次追逐时间前2分钟，将每个追逐培养皿放回水浴中例如，15分钟脉冲追踪实验的精确追踪时间为24分钟）且在确切的追踪时间点（例如，15分钟脉冲追踪实验需26分钟），吸除追踪培养基（若需追踪蛋白质分泌，可将其转移至微量离心管中），将培养皿转移至预冷的铝制冷却板上，加入2 mL预冷的终止缓冲液。
- 将所有培养皿置于冰上，用终止缓冲液孵育 ≥5 分钟；然后吸除终止液，加入 2 mL 冰冷的终止缓冲液洗涤。吸除洗涤液后，每皿加入 600 µL 裂解缓冲液（磷酸盐缓冲盐水 [PBS] + 非变性去污剂 [参见 材料表] + 蛋白酶抑制剂 + 20 mM NEM）。使用细胞刮确保培养皿中的细胞完全裂解。
- 将裂解液转移至1.5 mL微量离心管中，在15,000 - 20,000 x g条件下离心10分钟 g 并在 4 °C 下离心以沉淀细胞核。
- 悬浮细胞的脉冲-追踪实验
注意：为了确保高效的标记效果，细胞应以 3 x 10 的浓度进行脉冲处理6 至 5 × 106 细胞/mL，追踪体积应为脉冲体积的4倍。在以下示例中，我们使用了5 × 106 1 mL 体积的细胞离心 10 分钟，获得五个终末时间点（0、15、30、60 和 120 分钟）的 1 mL 样品，每份含 1 × 106 每个时间点的细胞数。所有溶液均与第1.1节相同。- 培养悬浮细胞（例如，3T3，Jurkat）按照先前发表的方案进行9 以确保实验时有足够数量的细胞，至少 1 x 106 每个时间点和/或条件下细胞数
- 如需转染，可根据制造商说明书，使用市售转染试剂对细胞进行转染，或进行病毒转导8 在脉冲-追踪实验前一天，用适当的表达载体转染细胞。
- 5 × 10 的沉淀6 每种条件下，将细胞在50 mL离心管中以250 × g离心5分钟 g 在室温下，用5 mL饥饿培养基洗涤1次，再次离心收集菌体，并重悬于1 mL饥饿培养基中。
- 将细胞转移至37 °C水浴中孵育10 - 25分钟。每10 - 15分钟摇动试管一次，以防止细胞沉降至管底。
- 启动计时器。在恰好1分钟时，加入275 µCi（55 µCi/1 x 106 将未稀释的标记物直接加入含细胞的试管中，轻轻旋转混匀。
注意：操作放射性物质时，必须遵循适当的预防措施以及当地法规，以防止意外暴露和/或污染。 - 在第11分钟时，加入4 mL追踪培养基终止标记。混匀样品后，立即取1 mL转移至预置冰上、含有9 mL冰浴终止液的15 mL离心管中。
注意：此为0分钟追踪样本。 - 对每个后续时间点重复上述步骤。所有时间点收集完毕后，以250 x g离心5分钟，沉淀细胞 g 4 °C下，吸除培养基（若需检测蛋白分泌，可将其转移至新的15 mL离心管中）。用5 mL终止液洗涤细胞，于250 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。 g 在 4 °C 条件下。
- 吸弃终止液，加入300 µL预冷的裂解缓冲液，充分裂解细胞，并在冰上孵育20分钟以确保裂解完全。将裂解液转移至1.5 mL微量离心管中，在15,000 - 20,000 x g 在 4 °C 下离心以沉淀细胞核。
2. 免疫沉淀
- 将抗体（参见讨论部分）与50 µL免疫沉淀磁珠（例如protein A-Sepharose）（10% [v/v] 裂解缓冲液悬浮液 + 0.25% 牛血清白蛋白[BSA]）加入微量离心管中，在4 °C下于摇床中孵育约30分钟。
- 在室温下以12,000 × g 离心1分钟使磁珠沉淀，吸除上清液。向抗体-磁珠混合物中加入200 µL裂解液，在4 °C下于摇床中孵育1小时；若免疫沉淀需要>1小时，则采用翻转混匀方式孵育。
- 在室温下以12,000 × g 离心1分钟使磁珠沉淀，吸除上清液后加入1 mL免疫沉淀洗涤缓冲液。将样品置于室温摇床中孵育5分钟。
- 按照步骤2.3所述方法沉淀磁珠，并重复洗涤一次。随后吸除上清液，将磁珠重悬于20 µL TE缓冲液（pH 6.8，含10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA）中，涡旋震荡样品。
- 加入20 µL不含还原剂的2×上样缓冲液，涡旋混匀，于95 °C加热5分钟，再涡旋一次。
注意：若仅制备还原性样品，此时应加入2 µL 500 mM DTT，然后进入步骤2.7。 - 按照步骤2.3所述方法沉淀磁珠。将19 µL非还原性上清液转移至新的微量离心管中（管中预先加入1 µL 500 mM DTT），离心并涡旋混匀后，再次于95 °C加热5分钟。
- 将样品在12,000 × g 下离心1分钟，即得还原性样品。冷却至室温后，向还原性和非还原性样品中各加入1.1 µL 1 M NEM。涡旋混匀后离心沉淀样品。
3. SDS-PAGE
- 首先，确定目标蛋白适用的 SDS-PAGE 分离胶浓度。例如，去糖基化的 HIV-1 gp120 蛋白分子量约为 60 kDa，应使用 7.5% 的凝胶进行分析。
- 根据制造商说明配制不含 TEMED 的分离胶溶液（x% 丙烯酰胺、375 mM Tris-HCl [pH 8.8]、0.1% SDS [w/v] 和 0.05% 过硫酸铵 [APS] [w/v]），并在真空条件下脱气 >15 分钟。在脱气过程中，用 70% 乙醇和无绒纸巾彻底清洁玻璃板，并将其安装至制胶装置中。
- 向分离胶溶液中加入 TEMED（终浓度为 0.005% [v/v]），充分混匀后，注入玻璃板之间，预留约 1.5 cm 空间用于后续添加浓缩胶。小心地在胶上方覆盖去离子 H2O 或异丙醇，并静置使其聚合。
- 待分离胶完全聚合后，配制浓缩胶溶液（4% 丙烯酰胺、125 mM Tris-HCl [pH 6.8]、0.1% SDS [w/v] 和 0.025% APS [w/v]）。
- 用去离子 H2O 冲洗分离胶顶部，然后完全去除水分。
注意：使用滤纸吸除最后残留的液滴。 - 向浓缩胶溶液中加入 TEMED（0.005% [v/v]），充分混匀后，覆盖于分离胶上方，并插入 15 孔梳子。待浓缩胶聚合完成后，将其转移至电泳槽中，并在上下槽加入电泳缓冲液（25 mM Tris-HCl、192 mM 甘氨酸 [pH 8.3] 和 0.1% SDS [w/v]）。
- 在 15 孔迷你胶的每个泳道中上样 10 µL。避免在凝胶的第一和最后一个泳道上样，其余空泳道应加入非还原性上样缓冲液，以防止条带出现“微笑”现象。以恒定电流 25 mA/胶进行电泳，直至染料前沿迁移至凝胶底部。
- 将凝胶从玻璃板中取出，加入蛋白染色液（含 10% 乙酸、30% 甲醇的 H2O 溶液 + 0.25% 考马斯亮蓝 R250 [w/v]）中振荡染色 5 分钟，随后用脱色液（不含考马斯亮蓝 R250 的染色液）脱色 30 分钟。
- 将凝胶正面朝下放置于保鲜膜上，然后在其上方覆盖一张 0.4 mm 厚的层析滤纸。将凝胶-滤纸夹心结构滤纸面朝下置于凝胶干燥仪上，按照制造商说明在 80 °C 下干燥 2 小时。
- 将干燥后的凝胶放入暗盒中，并覆盖放射自显影胶片或磷屏。若使用放射自显影胶片，此步骤必须在暗室中进行。
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结果
贴壁细胞脉冲-追踪实验中 HIV-1 gp120 的折叠与分泌过程如图 2所示。非还原凝胶（图中 Cells NR）显示了 gp120 的氧化折叠过程。在 5 分钟脉冲标记后立即检测（0 分钟追踪），gp120 在凝胶中呈现为一条位置较高的弥散条带；随着追踪时间的延长，该条带在凝胶中逐渐下移，经过一系列更加弥散的折叠中间体（IT），最终聚集为一条紧密的条带（NT），代表天然折叠构象的 gp120。这一迁移现象是由于二硫键的形成使蛋白结构更加紧凑，从而比完全还原状态的蛋白迁移更快。在还原凝胶（图中 Cells R）中，所有形式的二硫键均被还原，因此在各个追踪时间点，二硫键不再影响蛋白的迁移行为，从而可分析其他修饰变化。随时间推移，蛋白条带从 Ru 向 Rc 的迁移代表 gp120 的翻译后信号肽切割：随着更多蛋白分子达到天然构象并切除信号肽，其迁移速率因分子量减小而增加。在非还原和还原凝胶中，自约 1 小时起，细胞内信号强度开始下降，反映出 gp120 的分泌过程。这一过程可通过分析培养上清（图中 Medium）进...
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讨论
脉冲-追踪方法对于科学家理解完整细胞中的蛋白质折叠至关重要。尽管我们已尽力提供一种尽可能通用的方法，但该方法仍具有几乎无限的变体可能性，可用于研究蛋白质在细胞内折叠、转运及整个生命周期中发生的各种过程。
在培养皿中使用贴壁细胞进行脉冲追踪实验时，必须尽可能对每个培养皿进行相同的处理，因为实验中的每个时间点和/或条件都需要使用独立的培养皿。特别是对于较短的脉冲和追踪时间（<5 分钟），必须严格控制脉冲和追踪的时间（使用数字计时器）。使用悬浮细胞进行脉冲追踪实验有助于减少这种变异性，因为所有样品均来自同一管。由于某些细胞类型的贴壁能力弱于其他细胞，在多次更换培养基的过程中应特别注意避免细胞被冲洗掉。这一问题可通过将细胞保持在悬浮状态，或使用多聚-L-赖氨酸或多聚-L-精氨酸或明胶等试剂包被培养皿以增强细胞贴附来解决。为评估不同培养皿间标记的可重复性，应通过SDS-PAGE检测部分裂解液，以确认所有样品的总标记水平和蛋白质谱型一致。或者，也可通过液体闪烁计数法测定裂解液的每分钟总放射性计数（cpm），以确定掺入的总放射量，但该方法无法提供有关被标记蛋白质群体的信息。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Braakman实验室所有现任及前任成员在发展本文所述方法过程中提供的有益讨论与帮助。本项目获得了欧洲研究理事会资助，经费来自欧洲联盟第七框架计划（FP7/2007-2013）° 235649 以及荷兰科学研究组织（NWO）ECHO 项目° 711.012.008.
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 安全密封微量离心管 | Sarstedt | 72.706.400 | |
| 乙酸 | Sigma | A6283 | 冰乙酸 |
| BAS 储存磷屏 20×25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| 溴酚蓝 | Sigma | B8026 | 分子生物学级 |
| Carestream Biomax MR 胶片 | Kodak | Z350370-50EA | |
| 细胞培养基 | 多种 | N/A | 所用特定细胞系的常规细胞培养基 |
| 无甲硫氨酸/半胱氨酸的细胞培养基 | 多种 | N/A | 与常规培养基（如 DMEM/MEM/RPMI）相同配方，但不含甲硫氨酸和半胱氨酸 |
| 活性炭过滤滤纸 | Whatman | 1872047 | |
| 活性炭过滤移液器吸头 | Molecular bioproducts | 5069B | |
| 活性炭真空防护装置 | Whatman | 67221001 | |
| 考马斯亮蓝 R250 | Sigma | 112,553 | 用于电泳 |
| 半胱氨酸 | Sigma | C7352 | 分子生物学级，配制 500 mM 储存液，-20 ℃保存 |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma | 10197777001 | 分子生物学级 |
| EasyTag Express35S 蛋白标记混合物 | Perkin Elmer | NEG772014MC | 可根据使用需求提供其他规格的标记试剂 |
| EDTA | Sigma | E1644 | 分子生物学级 |
| 凝胶干燥设备 | 多种 | N/A | |
| 甘油 | Sigma | G5516 | 分子生物学级 |
| 3 号层析滤纸 | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's 平衡盐溶液（HBSS） | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes 精细擦拭纸 | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | 分子生物学级 |
| 甲醇 | Sigma | MX0490 | |
| 甲硫氨酸 | Sigma | M5308 | 分子生物学级，配制 250 mM 储存液，-20 ℃保存 |
| 小型凝胶制备与电泳设备 | 多种 | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | 分子生物学级 |
| N-乙基马来酰亚胺 | Sigma | E3876 | 分子生物学级，用 100% 乙醇配制 1 M 储存液，-20 ℃保存 |
| PBS | Sigma | P5368 | 分子生物学级 |
| Protein-A Sepharose 快流速珠 | GE health-care | 17-5280-04 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma | L3771 | 分子生物学级 |
| 吐温 X-100 | Sigma | T8787 | 分子生物学级 |
| Trizma 碱（Tris） | Sigma | T6066 | 分子生物学级 |
| Typhoon IP 生物分子成像仪 | Amersham | 29187194 | |
| 无导线试管架（20 mm，用于水浴） | Nalgene | 5970-0320PK |
参考文献
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