活细胞中蛋白质折叠、转运与降解的放射性脉冲追踪分析

摘要

本文介绍了一种通用的脉冲-追踪方法的实验方案，可用于在活细胞中动态分析蛋白质的折叠、转运和降解过程。

摘要

放射性脉冲-追踪标记是研究活细胞中靶蛋白构象成熟、转运至其功能性细胞定位以及降解过程的有力工具。通过使用短暂的（脉冲）放射性标记时间（<30 分钟）并严格控制追踪时间，可以仅标记总蛋白池中的一小部分，并追踪其折叠过程。当结合非还原/还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）以及使用（构象特异性）抗体进行免疫沉淀时，可对折叠过程进行极为详细的分析。该系统已被用于分析具有广泛不同性质蛋白的折叠，包括可溶性蛋白、单次和多次跨膜蛋白、高度N-和O-糖基化的蛋白，以及含有或不含大量二硫键的蛋白。脉冲-追踪方法是研究多种其他特征的动力学研究基础，包括共翻译和翻译后修饰、寡聚化以及聚合过程，实质上实现了对蛋白质从合成到降解全过程的分析。脉冲-追踪蛋白折叠研究与其他用于体外（in vitro）蛋白质研究的生物化学和生物物理方法互为补充，能够提供更高的时间分辨率和生理相关信息。本文所述方法可轻松适用于研究几乎任何能在哺乳动物或昆虫细胞系统中表达的蛋白质的折叠过程。

引言

即使是相对简单的蛋白质折叠也涉及多种不同的折叠酶、分子伴侣和共价修饰¹这些过程的完全重建 体外 鉴于涉及的组分种类繁多，实际上难以实现。因此，研究蛋白质折叠极为重要 体内在活细胞中。放射性脉冲-追踪技术是研究蛋白质在其天然环境中合成、折叠、转运和降解的有力工具。

短脉冲期间对蛋白质进行代谢标记 ³⁵使用S标记的甲硫氨酸/半胱氨酸进行标记，随后在无放射性标记的条件下进行追踪，可在更广泛的细胞环境中特异性追踪新合成的蛋白质群体。随后可分离目标蛋白质 通过 免疫沉淀并分析 通过 SDS-PAGE 或其他技术。对于许多蛋白质而言，其在细胞内的转运过程常伴随着在 SDS-PAGE 凝胶上可见的修饰变化。例如，糖基化蛋白质从内质网（ER）向高尔基复合体转运时，通常伴随着 N-连接聚糖的修饰或 O-连接聚糖的添加。^2,3这些修饰会导致表观分子质量显著增加，可通过SDS-PAGE中的迁移率变化进行观察。成熟过程还可能伴随蛋白水解切割，例如信号肽的切除或前肽的去除，从而引起表观分子质量的变化，这些变化可在SDS-PAGE凝胶上轻松追踪。⁴放射性标记技术相较于环己酰亚胺追踪等类似方法具有显著优....

方案

所有放射性试剂和操作均按照乌得勒支大学当地的辐射管理规定进行处理。

1. 脉冲追踪实验

1. 贴壁细胞的脉冲-追踪实验
   注意：此处给出的体积基于60 mm细胞培养皿。对于35 mm或100 mm培养皿，体积应分别乘以1/2或2。本方案采用10分钟的脉冲时间，以及0、15、30、60、120和240分钟的追踪时间。具体时间可根据所研究的特定蛋白进行调整（见下文讨论）。
   1. 贴壁细胞例如，HEK 293、HeLa、CHO）在六个60 将细胞接种于 mm 细胞培养皿中，使其在脉冲-追踪实验当天达到亚汇合状态（80%–90%）。每个时间点和/或条件至少使用一个培养皿。
   2. 如需要，可根据制造商说明书，使用市售转染试剂对细胞进行转染；或者进行病毒转导⁸ 在脉冲-追踪实验前一天，用适当的表达载体转染细胞。
   3. 用 2 mL 洗涤缓冲液（Hank's 平衡盐溶液 [HBSS]）洗涤培养皿，加入 2 mL 饥饿培养基（不含甲硫氨酸、半胱氨酸和胎牛血清 [FBS] 的正常培养基，例如 不含甲硫氨酸和半胱氨酸但含有10 mM HEPES（pH 7.4）的最低必需培养基 [MEM]，并将培养皿置于37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中₂ 15 分钟。

结果

贴壁细胞脉冲-追踪实验中 HIV-1 gp120 的折叠与分泌过程如图 2所示。非还原凝胶（图中 Cells NR）显示了 gp120 的氧化折叠过程。在 5 分钟脉冲标记后立即检测（0 分钟追踪），gp120 在凝胶中呈现为一条位置较高的弥散条带；随着追踪时间的延长，该条带在凝胶中逐渐下移，经过一系列更加弥散的折叠中间体（IT），最终聚集为一条紧密的条带（NT），代表天然折叠构象的 gp120。这一迁移现象是由于二硫键的形成使蛋白结构更加紧凑，从而比完全还原状态的蛋白迁移更快。在还原凝胶（图中 Cells R）中，所有形式的二硫键均被还原，因此在各个追踪时间点，二硫键不再影响蛋白的迁移行为，从而可分析其他修饰变化。随时间推移，蛋白条带从 Ru 向 Rc 的迁移代表 gp120 的翻译后信号肽切割：随着更多蛋白分子达到天然构象并切除信号肽，其迁移速率因分子量减小而增加。在非还原和还原凝胶中，自约 1 小时起，细胞内信号强度开始下降，反映出 gp120 的分泌过程。这一过程可通过分析培养上清（图中 Medium）进.......

讨论

脉冲-追踪方法对于科学家理解完整细胞中的蛋白质折叠至关重要。尽管我们已尽力提供一种尽可能通用的方法，但该方法仍具有几乎无限的变体可能性，可用于研究蛋白质在细胞内折叠、转运及整个生命周期中发生的各种过程。

在培养皿中使用贴壁细胞进行脉冲追踪实验时，必须尽可能对每个培养皿进行相同的处理，因为实验中的每个时间点和/或条件都需要使用独立的培养皿。特别是对于较短的脉冲和追踪时间（<5 分钟），必须严格控制脉冲和追踪的时间（使用数字计时器）。使用悬浮细胞进行脉冲追踪实验有助于减少这种变异性，因为所有样品均来自同一管。由于某些细胞类型的贴壁能力弱于其他细胞，在多次更换培养基的过程中应特别注意避免细胞被冲洗掉。这一问题可通过将细胞保持在悬浮状态，或使用多聚-L-赖氨酸或多聚-L-精氨酸或明胶等试剂包被培养皿以增强细胞贴附来解决。为评估不同培养皿间标记的可重复性，应通过SDS-PAGE检测部分裂解液，以确认所有样品的总标记水平和蛋白质谱型一致。或者，也可通过液体闪烁计数法测定裂解液的每分钟总放射性计数（cpm），以确定掺入的总放射量，但该方法无法提供有关被标记蛋白质群体的信息。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 安全密封微量离心管	Sarstedt	72.706.400
乙酸	Sigma	A6283	冰乙酸
BAS 储存磷屏 20×25 cm	GE Life Sciences	28956475
溴酚蓝	Sigma	B8026	分子生物学级
Carestream Biomax MR 胶片	Kodak	Z350370-50EA
细胞培养基	多种	N/A	所用特定细胞系的常规细胞培养基
无甲硫氨酸/半胱氨酸的细胞培养基	多种	N/A	与常规培养基（如 DMEM/MEM/RPMI）相同配方，但不含甲硫氨酸和半胱氨酸
活性炭过滤滤纸	Whatman	1872047
活性炭过滤移液器吸头	Molecular bioproducts	5069B
活性炭真空防护装置	Whatman	67221001
考马斯亮蓝 R250	Sigma	112,553	用于电泳
半胱氨酸	Sigma	C7352	分子生物学级，配制 500 mM 储存液，-20 ℃保存
二硫苏糖醇（DTT）	Sigma	10197777001	分子生物学级
EasyTag Express35S 蛋白标记混合物	Perkin Elmer	NEG772014MC	可根据使用需求提供其他规格的标记试剂
EDTA	Sigma	E1644	分子生物学级
凝胶干燥设备	多种	N/A
甘油	Sigma	G5516	分子生物学级
3 号层析滤纸	GE Life Sciences	3003-917
Hank's 平衡盐溶液（HBSS）	Gibco	24020117
Kimwipes 精细擦拭纸	VWR	21905-026
MES	Sigma	M3671	分子生物学级
甲醇	Sigma	MX0490
甲硫氨酸	Sigma	M5308	分子生物学级，配制 250 mM 储存液，-20 ℃保存
小型凝胶制备与电泳设备	多种	N/A
NaCl	Sigma	S7653	分子生物学级
N-乙基马来酰亚胺	Sigma	E3876	分子生物学级，用 100% 乙醇配制 1 M 储存液，-20 ℃保存
PBS	Sigma	P5368	分子生物学级
Protein-A Sepharose 快流速珠	GE health-care	17-5280-04
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma	L3771	分子生物学级
吐温 X-100	Sigma	T8787	分子生物学级
Trizma 碱（Tris）	Sigma	T6066	分子生物学级
Typhoon IP 生物分子成像仪	Amersham	29187194
无导线试管架（20 mm，用于水浴）	Nalgene	5970-0320PK